一種水稻Bel基因的定點敲除系統及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種水稻苯達松基因的定點敲除方法及其應用。
【背景技術】
[0002]在野生型水稻上應用的選擇性除草劑主要有兩類，一類是苯并噻二唑類(benzothiadiazole)除草劑，如苯達松，其有效成分能通過作物的根、葉吸收，它對豆科以外的絕大多數雙子葉植物和莎草科雜草有殺除作用，對禾本科植物無害。苯達松的除草機理是抑制植物光合作用中的希爾反應。
[0003]TALENs (轉錄激活子樣效應因子核酸酶)是近幾年出現的基因定點修飾新技術，在動物、植物和人類等領域都有廣泛的研宄和應用。轉錄激活子樣效應因子(Transcript1n Activator-Like Protein Effector, TALE)是黃單胞菌屬病原菌分泌到宿主植物細胞中的一種毒性蛋白，可以識別植物DNA，驅動基因表達。TALENs就是利用TALE的DNA結合結構域和Fok I的DNA切割結構域人工合成的核酸酶。兩個TALEN單體按照一定方式結合在DNA雙鏈上，形成有切割活性的二聚體將DNA切斷，產生DNA雙鏈斷裂(DSB)，細胞啟動修復機制，通過非同源末端連接這種不精確的修復方式可以產生基因定點突變，通過同源重組(HR)方式修復可以實現精確的基因定點插入或基因替換。相比鋅指核酸酶(ZFNs)和Meganucleases技術，TALENs技術具有設計簡單，突變效率高和細胞毒性低等優勢。TALENs的優異性取決于TALE獨特的DNA識別特性。TALEN的DNA結合結構域包含了一個由數量不等((1.5-33.5)的重復單元組成的串聯重復結構域。每一個重復單元通常由33-35個氨基酸組成，重復單元的氨基酸高度保守，但是各個單元的第12和13位兩個相鄰氨基酸是可變的，這兩個氨基酸通常被稱為重復可變雙殘基(R印eat-variablediresidue, RVD)。每個RVD與核苷酸A、T、C、G存在簡單對應的關系，最常見的識別密碼為NI識別結合A，HD識別結合C，NG識別結合T，和NN識別結合G (Moscou and Bogdanove.，2009)。
[0004]一般培育抗除草劑作物主要通過以下兩種方法:一是通過理化誘變，獲得抗除草劑作物的突變體；二是通過DNA重組技術，將抗除草劑基因導入現有的物種中，創造抗除草劑的新材料。由于理化誘變的方法靶向性不強，突變一個基因，需要處理大量實驗材料，為保證得到目的基因的突變體，需要做大量篩選工作，而且容易攜帶自己不需要的突變基因；DNA重組技術存在外源轉基因的情況，在育種時間或生物安全評價方面存在一定的問題。TALEN技術具有準確、快速、方便并且可以得到不帶外源基因的突變體，而且突變體種類豐富，采用TALEN技術來獲得抗除草劑材料將成為一種技術發展趨勢。

【發明內容】

[0005]本發明提供了一種偏好于植物基因組DNA的TALEN定點突變系統，所述TALEN定點突變系統所包含的四個識別模塊的核苷酸序列分別如下:識別結合堿基A的NI模塊的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；識別結合堿基C的HD模塊的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；識別結合堿基T的NG模塊的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示；識別結合堿基G的NN模塊的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示。
[0006]本發明還提供了一種新的獲得苯達松敏感植物的方法，更具體的是提供一種在單子葉植物中，優選在水稻中創制對苯達松敏感植株的方法。本方法以水稻Bel基因的第一個外顯子起始密碼子后邊的核苷酸序列作為靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ IDNO: 10所示，其中SEQ ID NO: 10的第17位至第34位的序列為間隔序列，兩側為TALENs的模塊識別序列(分別命名為L和R)。在本發明中，針對該靶序列的L端設計出來的TALEN-L包含TALE基因和Fokl融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；針對該靶序列的R端設計出來的TALEN-R包含TALE基因和Fokl融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。將該TALEN-L和TALEN-R的核苷酸序列構建到同一個表達載體，在組成型表達啟動子的驅動下，轉入到水稻中后，可以有效的獲得Bel基因被突變的苯達松敏感植株。實現了對水稻Bel基因進行準確、高效地打靶的實際需求。
[0007]本發明還提供了一種植物表達構建體，所述構建體含有SEQ ID N0:6和/或SEQID N0:8所示的核苷酸序列。更具體地，所述構建體的TALEN-L由Ubiquitin啟動子啟動表達，TALEN-R由35s啟動子驅動表達。
[0008]目前用TALEN方法得到的突變體材料篩選手段主要有:表型觀察，基因測序驗證等。對于表型不好觀察的材料只能進行基因測序，由于后代材料較多，造成工作量巨大，成本增高。具體到苯達松敏感突變體，表型易觀察，但有表型植株會逐漸死亡而收不到種子，所以不能在TO代進行苯達松敏感性篩選，而測序又存在嵌合體不容易測序，程序繁瑣，成本高等問題。
[0009]為解決上述問題，本發明還提供了一種篩選此類突變體的方法，具體的是對于轉化得到的轉基因植株，通過高分辨率溶解曲線(HRM)的方法篩選到突變體植株。HRM(HighResolut1n Melt)，中文譯為“高分辨率熔解”是近幾年來在國際上興起的最新的SNP及突變研宄工具。這種檢測方法不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。本發明提供了一種特異的用于檢測水稻Bel基因突變情況的HRM引物Ben-F和Ben_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12 所示。
[0010]本發明依次通過下列步驟實現:
[0011](I)單子葉植物密碼子的偏好性和水稻Bel基因序列對TALEN的核苷酸序列進行改造，改造后的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示，將該序列交寶生物工程(大連)有限公司合成；
[0012](2)將合成得到的一對TALEN核苷酸片段分別連接于Pubi和P35S啟動子下游驅動表達；Pubi和P35S啟動子核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:2所不O
[0013](3)轉化植物，具體地，優選轉化水稻；
[0014](4)以獲得的TO代轉基因水稻基因組為模板，進行HRM分析。具體地設計一對PCR引物，使產物包括Bel基因靶序列片段，PCR產物長度為120bp左右，用Lightscanner (USIdaho)掃描獲得溶解曲線，通過比較轉基因植株和野生型植株PCR產物解鏈溫度差異篩選可能的突變植株，利用此方法可方便快速大量篩選轉基因植株；
[0015](5)通過測序驗證篩選到的植株Bel基因突變情況。為驗證篩選得到的突變體植株Bel基因是否突變以及怎樣突變，通過PCR擴增帶有靶序列的DNA片段，測序驗證其真實序列。
[0016](6)對篩選到的突變體進行苯達松除草劑敏感性實驗。把篩選得到的Bel基因突變株和野生型植株同時栽到同一花盆中，待植株長到3葉一新，用1200mg/L的苯達松噴施，一周后調查植株葉子干枯情況，拍照(圖4)。
[0017]本發明所述的“啟動子”是一段位于結構基因5’端上游區的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結合并具有轉錄起始的特異性。
[0018]本發明所述的“核苷酸序列”是核酸(DNA和RNA)中核苷酸的排列順序。許多情況下，核苷酸序列決定核酸的高級結構和生物功能，即不同序列有不同的高級結構和不同的生物功能。
[0019]本發明所述的“植物表達載體”是指現有技術中已知的、能夠在植物細胞中恒定表達外源基因的任何一種載體，如pCAMBIA1300，pBI121等。
[0020]本發明所述的“轉化”是指現有技術中已知的、能夠將外源基因導入植物細胞或植物組織的任何一種植物轉化方法，如農桿菌介導法和基因槍等。
[0021]本發明所述的“轉基因植物”是指通過基因轉移技術獲得的整合有外源基因的植物個體。通常轉化植物或轉基因植物基因組中穩定帶有外源基因的核苷酸序列，可將該外源核苷酸序列穩定地遺傳給下一代。
[0022]本發明與現有的創建苯達松敏感植物的技術相比，其優勢在于方便、快速，用此技術可以一位科研人員在一年半的時間內可以得到多個不同突變位點的純合突變體植株，大大節省人力、物力，而且得到的突變體不帶轉基因成分，消除人們對轉基因的顧慮，對植物基因工程創制新的種質資源有重要意義。
【附圖說明】
[0023]圖1水稻Bel基因序列及本專利涉及到的TALEN靶序列位置，Exon I和Exon 2分別為水稻Bel基因的兩個外顯子I和2，靶序列L和靶序列R分別為TALEN蛋白的結合靶位點。
[0024]圖2用于轉化水稻的載體pOsBel示意圖。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；P35S為來自于煙草花葉病毒的組成型啟動子35S啟動子，Hyg為人工合成的潮霉素抗性基因；T35S為自于煙草花葉病毒的35S基因終止子；Pubi表示玉米泛素基因的啟動子，TALEN-L為人工合成的來自細菌的TALEN-L基因編碼區，Trbcs為來自于擬南芥Rbcs基因的終止子；TALEN-R為人工合成的來自于細菌的TALEN-R基因編碼區，Tnos表示胭脂堿合成酶(nos)基因的終止子。
[0025]圖3是HRM檢測轉基因水稻與野生型水稻Bel基因解鏈溫度峰圖比較圖；WT標示的是野生型水稻Bel基因的解鏈峰圖，24和Mutants標示的是Bel基因發生突變后的解鏈峰圖。
[0026]圖4獲得的突變體植株與野生型植株對苯達松類除草劑敏感性分析，左側為野生型植株，生長基本正常，