一種ebv lmp1蛋白的功能抑制劑及應用
【專利摘要】本發明對天然小分子化合物EGCG與EB病毒致瘤蛋白LMP1的相互作用進行了一系列研究，確定EBV LMP1可作為天然小分子化合物EGCG的分子靶標，即，天然小分子化合物EGCG可作為EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，為EGCG介導的腫瘤化學預防和治療效應提供新的證據。
【專利說明】
一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑及應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑及應用。【背景技術】
[0002]EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)也稱為人類皰疹病毒4型，是第一個被發現與人類腫瘤直接相關的病毒。據統計，全世界超過90 %的人群感染過該病毒。國際癌癥研究署 (IARC)2008年發布的世界癌癥報告指出，EB病毒引發了全球癌癥的1%，占所有感染性癌癥的5.6 %。根據I ARC對致癌因子的分類標準，EB病毒被列在第一組致癌因子中。EB病毒與多種特定的人類腫瘤的發生密切相關，包括鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和胃癌等。美國國家衛生研究院(NIH)已將EBV列為減少全球癌癥負擔的重要因子。
[0003]在宿主細胞內，EB病毒的感染方式可分為兩種形式:①潛伏感染，病毒基因組以環狀分子形式游離于細胞DNA細胞染色體之外，僅有少量的病毒基因表達，其基因組伴隨每個細胞周期復制一次，不釋放病毒。②裂解復制感染，也稱作生產性感染，病毒基因組以線型分子形式插入宿主細胞染色體DNA中，進行完整的DNA復制、轉錄、翻譯和病毒裝配，并釋放病毒顆粒，導致細胞裂解。在EB病毒陽性腫瘤中，該病毒主要以潛伏狀態存在。
[0004]EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白。LMP1由386個氨基酸組成，包括 3個不同的結構域:①24個氨基酸殘基組成的胞漿氨基末端(N末端)；②6個疏水性跨膜區 (25?186位氨基酸)；③200個氨基酸殘基組成的胞漿羧基末端(C末端)，其包含3個重要的C 末端激活結構域(C terminal activating reg1ns，CTARs):CTARl、CTAR2和CTAR3。研究表明，LMP1通過其C末端CTARs募集腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs)和腫瘤壞死因子受體相關的死亡結構域(TNFR associated dead domain protein，TRADDs)并組成性活化這些蛋白，介導LMP1胞衆信號通路的活化。LMP1通過激活陬-仙、從1(3/5141'、]\^?1(8(￡狀、？38和見1〇、？131(/^肚等信號通路， 影響上皮細胞生長因子受體、抗凋亡基因bcl-2和survivin以及與細胞周期相關的基因 cyclinDl、⑶K4和P53等，控制細胞的增殖和凋亡，使上皮細胞發生轉化，從而誘發腫瘤的形成。此外，LMP1促進侵襲轉移因子E-cadherin、ICAMl、MMP9以及血管內皮生長因子的表達， 在腫瘤的侵襲和轉移中起重要作用。由于LMP1在EBV陽性腫瘤的發生、發展、轉移多階段具有重要功能，已被確定為鼻咽癌存活的標志物。因此，EBV LMP1已成為EBV陽性腫瘤的治療靶點。
[0005]表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigall〇CateChingallate，EGCG)，又稱為表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯，是一種從綠茶中提取的多酚類化合物。EGCG的化學式是C22H18〇n，分子量為458.4,是一種具有抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等多種生物活性的小分子化合物。研究表明，EGCG可調節酶活性及信號傳導通路，抑制細胞生長和增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和周期阻滯，并通過抑制腫瘤新生血管的生成，發揮抗腫瘤細胞侵襲和轉移的功能，從而在多階段發揮抗腫瘤功能，在腫瘤化學預防以及治療中發揮重要作用。研究揭示，EGCG對其分子靶標的結合是EGCG抗腫瘤活性的結構基礎，高親和力的EGCG結合蛋白可能是EGCG的直接作用靶標。目前，已經鑒定了EGCG的多個分子祀標，如脂後膜分子laminin和67-kDa laminin受體、 vimentin、胞漿蛋白ZAP-70、Fyn以及分子伴侶GRP-78等，這些分子靶標多為細胞膜蛋白或其受體，與EGCG具有較高的親和力。研究證實，腫瘤病毒可以編碼相應的致瘤蛋白，并通過與宿主細胞內的其他蛋白相互作用影響其正常的功能，以誘導腫瘤的發生。因此，發現EGCG 的病毒編碼分子靶標將對腫瘤化學預防和治療以及針對其分子靶標開發新抗腫瘤藥物提供新的重要啟示。
[0006]EGCG是具有廣譜抗腫瘤活性的天然小分子化合物，對多發性骨髓瘤、人結腸癌、胰腺癌以及人頭頸部腫瘤等均有抑制生長的作用。在不同類型的腫瘤中，EGCG發揮抗腫瘤作用的機制不盡相同。此外，EGCG具有抗病毒活性，其抗病毒譜涵蓋多個病毒家族，包括EBV， HIV，HCV等多種重要的人類致瘤病毒。因此，對EBV引發的腫瘤，EGCG的抗病毒活性是發揮其抗腫瘤作用的重要方式。國際癌癥研究署(IARC)2008年發布的世界癌癥報告指出，EB病毒引發了全球癌癥的1%，占所有感染性癌癥的5.6%，說明不是所有的腫瘤均由病毒感染引發。對于致病機理與病毒感染無關的腫瘤而言，EGCG的抗腫瘤活性則需要通過其他途徑實現。EGCG的抗腫瘤機制包括:作為抗氧化劑，減少R0S產生抑制腫瘤的發展;結合并調節能夠影響細胞生長和增殖相關酶(如MAPKs、MMPs等)、受體(如EGFR、IGF-1R、HGFR等)和信號分子 (如Bcl2和Vimentin)的活性。目前，EGCG的臨床效果與抑制EBV裂解復制有關，其能夠抑制腫瘤患者外周血中的EBV抗體滴度和DNA拷貝數。但是，EGCG抑制EBV裂解復制機制的研究還較少。
【發明內容】

[0007]我們通過前期實驗發現LMP1不僅能夠介導EBV相關腫瘤的發生發展，而且能夠促進EBV的裂解復制。本發明對天然小分子化合物EGCG與EB病毒致瘤蛋白LMP1的相互作用進行了一系列研究，確定EBV LMP1可作為天然小分子化合物EGCG的分子靶標，S卩，天然小分子化合物EGCG可作為EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，為EGCG介導的腫瘤化學預防和治療效應提供新的證據。
[0008]為明確EGCG結合LMP1，本發明首先利用熒光光譜法分析了二者之間的相互作用性質。觀察熒光光譜發現，隨著LMP1蛋白溶液中EGCG濃度的提高，LMP1的內源熒光逐漸淬滅。 根據EGCG對LMP1內源熒光的淬滅機理，測得兩者在不同溫度下的結合常數均大于生物大分子熒光平均壽命，確定EGCG對LMP1的淬滅為靜態過程，從而排除了二者的相互作用為動態碰撞。通過進一步分析，判斷EGCG與LMP1的結合位點數約等于1。[00〇9] 本發明隨后利用pul 1-down親和層析實驗驗證EGCG與LMP1的結合作用。經Western blot實驗檢測，我們發現，1.EGCG能夠捕獲細胞蛋白裂解液中的LMP1; 2.EGCG可結合純化的 LMP1蛋白。
[0010]為確定LMP1是EGCG的分子靶標，本發明借助等溫滴定量熱(iso thermal titrat1n calorimetry，ITC)技術明確EGCG結合LMP1的熱力學特征。實驗結果表明，EGCG 與LMP1的結合位點數為1.05，Kd值為0.36yM，確定LMP1為EGCG的高親和蛋白。[〇〇11]最后，本發明利用細胞增殖能力檢測實驗驗證EGCG靶向LMP1的抗腫瘤效應。結果顯示，在EGCG生理濃度(lyM)作用下，LMP1陽性的鼻咽癌細胞系與陰性細胞系相比，增殖能力受到明顯的抑制。[0〇12]已發現的EGCG靶標都是由人類細胞表達，大多數定位于細胞質膜，例如EGFR、Fas、 Vimentin、IGF-1 受體、Laminin、67kDa Laminin receptor、Fibronectin、Fibrinogen和 Histindine-rich glycoprotein。另外，還有少數的革E標蛋白定位于細胞質，包括GRP-78、 ZAP-70和Fyn。本申請發現的EGCG新靶標LMP1是致瘤病毒EBV編碼的潛伏膜蛋白，其6個疏水的跨膜結構域錨定于宿主細胞質膜，該靶標是一個組成型活化的蛋白，持續性地活化相關的致瘤信號通路，促進腫瘤的發生發展。因此，天然小分子化合物EGCG是一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，通過靶向LMP1對EBV陽性腫瘤的化學預防與治療具有較好的發展前景。【附圖說明】[〇〇13]圖la顯示了天然小分子化合物EGCG對EB病毒致瘤蛋白LMP1的熒光淬滅效應，圖lb 和圖lc顯示了EGCG對LMP1熒光淬滅的Stern-Volmer曲線；圖lc顯示了EGCG對LMP1熒光淬滅的雙對數圖；[〇〇14]圖2a顯示了 EGCG與AGS-EBV(EB病毒陽性胃腺癌細胞系)和B95-8 (EB病毒陽性狨猴淋巴瘤細胞系)細胞裂解液中的LMP1的結合;圖2b顯示了EGCG與純化的LMP1蛋白的結合；
[0015]圖3顯示了EGCG與LMP1結合的熱力學特征及相關參數；[〇〇16]圖4a和4b分別顯示了 EGCG對鼻咽癌細胞系CNE1-LMP1以及胃腺癌細胞系AGS-EBV增殖能力的抑制效應。【具體實施方式】[0〇17]本發明所用細胞系B95-8(ATCC;CRL 1612)來自美國標準培養物收藏所(AmericanType Culture Collect1n,ATCC);胃腺癌細胞系AGS-EBV來自中國農業大學;CNE1和CNE1-LMP1由中南大學湘雅醫學院腫瘤研究所建系。[〇〇18]實施例1熒光光譜法檢測EGCG與LMP1的相互作用。
[0019]蛋白質分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸而產生較強的內源性熒光。熒光猝滅劑與熒光物質相互作用而導致熒光強度下降的現象稱為熒光猝滅作用。熒光猝滅作用因猝滅機制不同可分為動態熒光猝滅和靜態熒光猝滅。以此原理為基礎的熒光光譜法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的重要手段。
[0020]實驗方法如下:在25°C和37°C條件下，分別在比色杯加入一定摩爾濃度梯度(0? 75yM)的EGCG和純化的LMP1蛋白溶液(加入的EGCG體積不超過溶液總體積的1.5%，此時體積影響較小，可以忽略體積效應，即純化的LMP1蛋白溶液濃度保持不變)，定容后混勻;設置熒光光譜儀激發波長為以lx = 280nm，狹縫寬度5nm，在300?450nm范圍內掃描LMP1的熒光光譜以及LMP1在EGCG作用下的熒光淬滅光譜，并記錄實驗數據。[〇〇21]通過處理數據，疊加熒光光譜，獲得EGCG對LMP1的熒光淬滅光譜。結果如圖la。根據熒光光譜峰值和對應的EGCG濃度，分別用Stern-Volmer方程和雙對數方程等處理實驗數據(結果見圖lb和圖lc，證實了在實驗濃度和溫度范圍內，EGCG能夠與LMP1形成復合物，弓丨起靜態熒光猝滅；并得到了在25°C和37°C下結合反應的相關參數:25°C和37°C時LMP1對 EGCG的結合位點數分別為0.8551和0.9283，約等于1;對于n?1，即當熒光體與猝滅體之間形成不發焚光的1:1型復合物時，靜態猝滅滿足Lineweaver-Burk方程，求得結合常數Ka = 4.4X104(mol/L)_1〇
[0022]實施例2Pull-down親和層析實驗確定EGCG結合LMP1蛋白。[〇〇23] 操作步驟如下:
[0024]將制備好的總蛋白(含LMPl)500yg(或者純化的LMP1蛋白單體)與50yl EGCG-Sepharose 4B(或者與50yl Sepharose 4B，作為陰性對照)置于反應Buffer(50mmol/L Tris(pH 7.5)，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，lmmol/L DTT，0.01%Ninidet P-40， 0.02mmol/L Phenylmethylsulfonyl fluoride ,4Ag/mL bovine serum albumin ,IX protease inhibitor cocktail)中，于4°C輕輕振搖、孵育過夜。次日，珠子以Washing Buffer([50mmol/L Tris(pH 7.5)，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，lmmol/L DTT,0.01% NP40,0? 02mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride])洗5次以去除未結合的蛋白。加入適量的SDS上樣緩沖液，沸水浴5min，13000rpm離心5min，取上清上樣，在不連續SDS變性凝膠中分離，將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性結合位點，然后膜與EB 病毒LMP1—抗4°C孵育12h，PBST洗滌;二抗室溫孵育2h，PBST洗滌，加入化學發光底物，于凝膠及化學發光成像系統進行化學發光，拍照記錄圖像。結果見圖2a和圖2b。[〇〇25]實驗結果顯示，EGCG直接結合EB病毒陽性細胞系總蛋白裂解液中的LMP1，也可結合體外表達純化的LMP1單體蛋白。
[0026]實施例3EGCG與LMP1結合的ITC曲線，以及由實測ITC曲線積分得到的結合反應熱對EGCG與蛋白摩爾比的非線性擬合曲線。[〇〇27]等溫滴定量熱技術是一種原位、在線和無損傷地研究生物熱力學與生物動力學的重要方法。它通過類似化學滴定的方法，記錄反應熱流隨時間的變化，具有靈敏度高、重現性好和原位在線不干擾研究反應的特點，是目前最準確、應用最多的熱力學方法之一。常應用于蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質-小分子相互作用以及酶促反應動力學等。[〇〇28] 操作步驟如下:[〇〇29]在25°C時，EGCG與LMP1相互作用的熱力學性質的測定在美國TA公司生產的等溫滴定微量熱儀Nano ITC上進行。滴定實驗中，將100yM EGCG溶液裝入50yl的滴定注射器，4.5y M LMP1純化蛋白溶液放入lml的樣品池，攪拌器以300r/min的速度攪拌，每間隔200s加入 2.5yl EGCG溶液到LMP1溶液中，共滴定20次。參比池中加入去離子水作為樣品池的熱平衡參照。另做一空白實驗以扣除EGCG稀釋熱的影響，即在樣品池中加入緩沖液，用100yM EGCG 溶液滴定。LMP1的稀釋熱經測定非常小，可略去。所有的溶液都在25°C條件下真空脫氣處理以減小信號噪音。積分每個峰面積并扣除稀釋熱后得到結合反應熱，對EGCG與LMP1的摩爾比作圖得到反應等溫線。以TA公司提供的Nano Analyze數據分析軟件對等溫線中的獨立結合位點模型進行非線性最小方差擬合，可計算出EGCG與LMP1相互作用的本征解離常數Kd、 本征摩爾結合焓A H、反應熵變A S和結合位點數n，結果見圖3。
[0030]結果顯示，EGCG與LMP1結合的Kd值為0.36yM，為高親和性結合，結合位點數為1.05〇[〇〇31]實施例4LMP1的表達增強EGCG對腫瘤細胞增殖能力的抑制效應。[〇〇32]取生長狀態良好的細胞，用含EDTA的胰酶于37°C消化，制成細胞懸液，以每孔2 X 1〇4個細胞接種到24孔板中，接種體積為500yl; 37 °C、5 % C02培養過夜，待細胞貼壁。在37 °C、 5%C02培養條件下，以DMS0(對照組)和EGCG的生理濃度(lyM)分別處理兩種細胞系，每個濃度設置3個重復孔，培養5天。處理完畢后，用細胞計數儀計數。結果見圖4a和4b。
[0033] 結果顯示，與對照組相比，lyM的EGCG能夠明顯抑制CNE1-LMP1和AGS-EBV細胞的增殖，差異具有統計學意義(*代表P<〇.〇5，***代表P<0.001)。
【主權項】
1.一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，其特征在于，所述功能抑制劑為天然小分子化合 物EGCG。2.天然小分子化合物EGCG在制備EBV LMP1蛋白功能抑制劑中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105997987SQ201610328003
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】曹亞, 李弘德, 羅湘建
【申請人】中南大學