專利名稱：可與人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶結合的抗體以及其利用方法
技術領域：
本發明涉及與人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶結合的抗體，使用該抗體的人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的檢測或測定系統，使用抗體的診斷藥劑，以及使用該抗體的治療藥劑。
背景技術：
近年來已在人類的慢性呼吸道炎癥患者的痰中純化(參考特開平7-067640號公報以及S.Yasuoka et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16p300-308，1997)人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶(HumahAirway Tryptase，以下亦稱為HAT)，其氨基酸序列以及cDNA序列已明確(參考特開平8-89246號公報，US-5804410，EP-699763，以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998)。這種酶的體外活性已得到研究。由于這種酶對支氣管上皮細胞分泌IL-8或GM-CSF等細胞因子具有增強作用以及對粘液絨毛運動的作用(寺尾紀子，1998年度日本呼吸器學會)可想到與呼吸道炎癥的病態的可能關系。由具有纖維蛋白原的分解活性以及血纖維蛋白溶酶原活性因子(原尿激酶)活化作用等酶活性(吉永純子，1998年度對病態與治療的蛋白酶與干擾素研究會(Conference onProteases and Inhibitors in Pathophysiology and Therapeutics)，可考慮通過形成呼吸道粘膜面的纖維蛋白而具有抗炎癥作用，或者可改善慢性呼吸道疾病的病態，用對于癌細胞轉移等可能有關。

發明內容
本發明的課題在于獲得上述可檢測出HAT的抗體，以及使用其抗體的測定系統的構建。由此可測定HAT的生物體內的濃度或可調查組織或細胞的HAT分布，即可診斷炎癥性的疾病或癌癥。本發明的課題為中和HAT活性的抗體，以及抑制HAT活化抗體的取得。中和HAT活性的抗體或抑制HAT活化的抗體，可使用于對HAT的凝聚、纖溶系統的作用、對呼吸道病態的作用、對呼吸道炎癥的作用、有關癌細胞增殖或轉移的作用、對粘液纖毛運動的作用、抑制或修飾抗病毒感染作用等生理作用的改善或治療疾病。這些抗體可作為慢性呼吸道炎癥(COPD，氣喘)、凝聚、纖溶異常、癌癥等疾病的新穎性治療藥劑、診斷藥劑。
本發明者取得與HAT結合的單克隆抗體以及多克隆抗體，成功地用于生物體內HAT的檢測。且發現所取得的抗體具有HAT中和活性，故完成本發明。
本發明是結合人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的抗體。本發明包括可用于酶免疫測定法而測定生物體內的天然人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的抗體，或含有可使用于western印跡而檢測出生物體內的天然人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的抗體。本發明的抗體的表位在人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的氨基酸序列第187至第418號之間。
本發明中“人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶”為特開平8-89246號公報所揭示的含有人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的cDNA序列的一部分或全部的蛋白質。人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶氨基酸序列號碼則依據Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998所描述的氨基酸序列號碼。
另外本發明提供一種使用人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶結合的抗體，檢測或者測定人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的方法，以及使用此抗體的人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的酶免疫測定法。
本發明提供一種治療藥，其含有抑制人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的活化的抗體，以及含有中和人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶活性的抗體的治療藥。
本發明還提供一種動物細胞，可產生與人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶結合的抗體。
附圖簡述

圖1表示對本發明的抗HAT抗體的中和活性的評估結果。
圖2表示對使用本發明抗HAT多株抗體的測定系統中重組HAT的標準曲線。
圖3表示使用本發明抗HAT多株抗體的測定系統所測定的喀痰中HAT的結果。
圖4表示調查對本發明抗HAT單克隆抗體與HAT多克隆抗體的重組HAT的液相抗原反應性的結果。
圖5表示對使用本發明抗HAT單克隆抗體與抗HAT多克隆抗體的測定系統中重組HAT的標準曲線。
實施發明的最佳方式本發明的多克隆抗體，可由下述方法取得。即，制備抗原蛋白HAT時，可依據特開平7-067640號公報以及S.Yasuoka et al.，Am.J.Respir.Cell MOl.Biol.，16，p300-308，1997所描述的方法，由痰中等生物樣品或產HAT的培養細胞中純化取得，或依據特開平8-89246號公報、US-5804410、EP-699763、以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998所描述的方法產生重組HAT，再通過純化即可獲得。
再將純化HAT與佐劑同時對動物作重復的腹腔內注射或皮下注射，引起動物的免疫反應。作為所使用的動物，優選哺乳類，更優選兔子、山羊、綿羊、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠。其中以兔子為最優選的。
再從已免疫的動物中采血分離血清成份，依常法以蛋白質A柱純化IgG，取得抗HAT多克隆抗體。
本發明的單克隆抗體可依據下述方法制備。即，基本上為Galfre以及Milstein，酶學方法，第73卷，Academic Press，New York(1981)；James W.Goding，單克隆抗體原理和方法，Academic Press，Orlando，Florida(1986)；Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等共編，Wiley Interscience，New York(1987)等所描述的方法。
制備單克隆抗體時以純化抗原蛋白質為佳。此純化蛋白質也可用于抗體效價的檢定。制備本發明的單克隆抗體時所使用的重組HAT的表達方法以及純化方法，如特開平8-89246號公報所詳述。
再將純化重組HAT與佐劑同時作重復動物的腹腔內注射或皮下注射，而引起動物的免疫反應。作為使用的動物以哺乳動物為優選的，大鼠以及小鼠為較優選的。最優選的為balb/c小鼠。
再從免疫的動物中取出B淋巴細胞，如上述文獻所記載的方法，與具有無限增殖能力的動物細胞進行細胞融合。作為此融合的對象，較優選的細胞株為小鼠的骨髓瘤細胞，以P3-X63-Ag8-Ul骨髓瘤細胞(ATCC CRL1597)為最優選的。
細胞融合后，依常法在適當的選擇性培養基中繼續培養，在生存的細胞中以ELISA法等選出產生與重組HAT結合的抗體的細胞株。對所得的單克隆抗體產生細胞作數次的分選，可選出具有單克隆性以及抗體產生能力穩定的株。作為分選法可使用極限稀釋法、軟瓊脂糖法以及使用細胞分分選器法等。
對所得的重組HAT的單克隆抗體，可由以下方法選出具有活性的抗體。即，以抗小鼠IgG(Fc)抗體結合抗HAT單克隆抗體的ELISA用于96孔板中，加入重組HAT，洗凈后，與螢光底物反應后測定HAT活性，進而篩選可中和HAT活性的抗體。使用經添加酶標識后的抗HAT兔子多克隆抗體二抗，可篩選液相抗原反應性較高的抗體。
本發明的單克隆抗體用于人類治療時，使用人類型的單克隆抗體是優選的。人類型的單克隆抗體中除人類的單克隆抗體外，還包括所謂的嵌合型抗體，即唯一的可變區域來自小鼠等動物的氨基酸序列，恒定區域中使用人類氨基酸序列的抗體。其他，根據所謂CDR圖示技術的單克隆抗體，即僅互補性決定區域來自動物的氨基酸序列，其他序列皆來自人類，其包含于人類型的單克隆抗體中。
嵌合型抗體或經由CDR圖示技術的單克隆抗體，根據本發明基因重組技術，亦可容易經由產生本發明的單克隆抗體的小鼠的融合瘤中取出對應的基因，與人類抗體基因作重組，導入動物細胞后使其表達而容易制得。例如Int.J.Cancer，44，424-433(1989)，Pro Natl AcadSci USA，87，8095-8099(1990)所記載。以未變化氨基酸序列，使單克隆抗體的產生效率提升為目的，由融合瘤中取出對應本發明抗體的基因可于其他動物細胞中表達。本發明的單克隆抗體亦含有經由這些基因重組技術所得的單克隆抗體以及產生單克隆抗體的動物細胞。
作為人類型單克隆抗體的制備方法，除上述方法之外，也有將人類的B淋巴細胞與人類或小鼠的骨髓瘤細胞或異型骨髓瘤(neteromyeloma)細胞進行細胞融合的方法。作為與人類的骨髓瘤細胞進行細胞融合的方法，已在J.Immunol Methods，61，17-32(1983)中描述，作為與小鼠的骨髓瘤細胞進行細胞融合的方法，已在ProcNatl Acad Sci USA，77，6841-6845(1980)描述，作為與異型骨髓瘤細胞進行細胞融合的方法，已在Pro Natl Acad Sci USA，81，3241(1984)等描述。實施這些方法時，于人類的B淋巴細胞進行細胞融合前，于體外接受刺激是優選的。刺激的方法，可按BiochemBiophys Res Commun，135，495(1986)所記載的方法實施。
其他作為人類單克隆抗體的制備方法，可舉出經由EB病毒進行人類B淋巴細胞的轉化作用的方法。
即，本發明的單克隆抗體以及多克隆抗體是可檢測以及測定生物體內的以及存在于細胞中的HAT的抗體，或可中和HAT活性的抗體，或抑制HAT活性化的抗體，可為任一種，或可由任何方法所制得。該領域的技術人員，變化其種類或其制備方法而獲得具有本發明單克隆抗體活性并非難事。
本發明的單克隆抗體以及多克隆抗體可使用于HAT的檢測以及測定。即，經由如ELISA法或RIA法的免疫化學測定方法，即可測定出HAT濃度。例如使用于固相邊(Solid phase side)固定抗HAT單克隆抗體的培養皿，可高感度地測定出HAT。可經由免疫組織染色、免疫細胞染色、流式細胞儀等可檢測或測定HAT。
使用本發明的單克隆抗體以及多克隆抗體，可測定與膜結合的HAT。膜結合型HAT的活性可通過區分活性與非活性類型而得到測定。實施例以下以實施例詳細說明本發明，但非可限定本發明。[實施例1]HAT的制備對痰中天然HAT的純化，則依據特開平7-067640號公報以及S.Yasuoka et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16，p300-308，1997中描述的方法。對于純化重組HAT，則依據特開平8-89246號公報，US-5804410、EP-699763以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998所描述的方法進行。即，培養昆蟲細胞(Tn-5細胞)至單層為5×106個/ml的密度，除去培養基后，每細胞按MOI＝0.2-0.5加入含有重組HAT表達桿狀病毒(#1B3)的無血清培養基使其感染，經3天培養后，使HAT表達。欲確認已表達的蛋白質，使用SDS-PAGE以及抗HAT-N-19肽抗體的western印跡(Anal.Biochem.，112，195-203，1981)進行。經離心分離法(約500×g)將上清與細胞分開，上清液經極限過濾法(富士濾器，FiltronMiniset，分級分離分子量300kDa)將病毒除去后，以Tris鹽酸-50mM氯化鈉緩沖液(pH8.0)透析或稀釋過液。細胞懸浮于50mM Tris鹽酸-500mM氯化鈉緩沖液(pH8.0)中，加入Triton使最終濃度成1％X-100，于0℃下放置60分鐘，溶解細胞。細胞殘渣經離心分離后，于50mM Tris鹽酸-500mM氯化鈉緩沖液(pH8.0)中透析或稀釋過夜。將此溶液用50mM Tris鹽酸-500mM氯化鈉緩沖液(pH8.0)平衡后倒入苯甲脒親和柱(pharmacia公司制)，以同緩沖液洗凈后，以10mM鹽酸-500mM氯化鈉溶液(pH2.0)洗脫。對各部分如實施例5(1)所示方法進行胰蛋白酶類蛋白酶活性的測定以及檢測。收集主要波峰，進行SDS-PAGE，檢測出分子量約為28KaDa的蛋白質，使用抗胰蛋白酶類蛋白酶肽抗體的Wertern印跡確認胰蛋白酶類蛋白酶(參照特開平8-89246號公報，US-5804410、EP-699763、以及Yamaoka K.et al.，J.Biol.Chem.，273(19)，11895-11901，1998)。[實施例2]抗HAT多克隆抗體的取得以抗肽抗體的取得以肽合成機(Applide Biosystems Model 431A)化學合成成熟HAT的1至19殘基序列之N末端具有半胱氨酸的20殘基肽(序列號1)，此合成肽溶解于10mM磷酸緩沖液(pH7.5)中(10mg/ml)，與10mg的馬來酰亞胺活化血藍蛋白(Boehringer MannheimBiochemica公司制)作25℃下2小時的恒溫培養后，反應溶液以10mM磷酸緩沖液(pH7.5)作透析。將與血清蛋白結合的肽施藥于家兔的皮下(0.5mg/1次)。隔2周進行6次重復施藥。采全血制備成血清后，以蛋白質A Sepharose4B柱(Pharmacia公司制)純化得到抗HAT多克隆抗體(抗-N19PAb)。(2)抗重組HAT抗體的取得由實施例1制備的重組HAT(40μg/1次)與弗氏完全佐劑(BACTO公司制，1∶1)同時于每2星期對家兔作皮內施藥。此進行4次后，采全血得到抗血清。將此血清依常法以蛋白質A Spharose4B柱(Pharmacia公司制)純化IgG，得到抗HAT多克隆抗體(anti-rHATPAb)。[實施例3]抗HAT單克隆抗體的制作(1)用重組HAT對小鼠進行免疫由實施例1制備出的重組HAT10-20μg/次/只與弗氏完全佐劑(BACTO公司制，1∶1)同時于每2星期對Balb/c鼠(7周，雄)作腹腔內施藥。進行4次后，第5次將細胞融合的3天前作重組HAT溶液50μl的靜脈內施藥。由小鼠的尾靜脈采血，于37℃下作30分鐘的恒溫培養后，以3000rpm 10分鐘的離心回收血清，小鼠血清中的抗HAT抗體效價用ELISA測定。以下對此方法作詳述。
于96孔ELISA的培養皿(Falcon3912，Becton Dickinso公司)中加入50μl以0.05M Na2CO3緩沖液(pH10.5)稀釋1μg/ml的重組HAT，在4℃下恒溫培養過夜。以含有0.05％Tween20的PBS洗凈3次后，以含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS于室溫下處理1小時。以含有0.05％Tween20的PBS洗滌3次后，加入50μl的抗體，于室溫下反應1小時。以含有0.05％Tween 20的PBS洗凈3次后，加入50μl含有3％BSA的PBS稀釋至1000倍的堿性磷酸酶結合公山羊抗鼠IgG抗體(ZYMED公司)，于室溫下反應1小時。含有0.05％Tween20的PBS洗凈3次后，以PNPP(對硝基苯基磷酸鹽，和光純藥)于室溫下反應1小時，測定405nm的吸光度。(2)經細胞融合制作雜交瘤在細胞融合前將小鼠殺死，將其脾細胞于PBS中進行研磨，殘渣以尼龍過濾器過濾后，離心后用PBS洗凈。此脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8U.1)依常法(Kohler，Milstein；Nature，256，495-497(1975))進行細胞融合。
即，5×107個脾細胞與5×106個小鼠骨髓瘤細胞P3×63Ag8U.1(P3Ul)用RPMI1640培養基洗凈后，以1500rpm作5分鐘離心，得到細胞沉淀。2分鐘內加入1ml的35％聚乙二醇液體(5.75ml的RPMI 1640培養基+3.5ml的聚乙二醇+0.75ml的二甲基亞砜)，將此細胞溫和地懸浮其中。2分鐘內加入1ml的RPMI 1640培養基后，再于2分鐘內加入2ml。其次2分鐘內加入4ml的GIT-HAT培養基(含有95μM的次黃嘌呤、0.4μM的氨基喋呤、1.6μM的胸腺嘧啶，以及5％FCS的GIT培養基)后，再于2分鐘內加入8ml。于37℃下恒溫培養30分鐘后，于各孔中加入約104個小鼠腹腔侵出細胞于96孔平底培養皿，于5％CO2中37℃培養。
一周后以GIT-HT培養基(GIT-HAT培養基中除去氨基喋呤)替換一半的培養基，且于5％CO2存在下于37℃培養約1星期，各孔得到數個雜交瘤的菌落。(3)雜交瘤的篩選2星期后以包被重組HAT的平板進行篩選。每含有50μl的重組HAT的50mM Na2CO3緩沖液(pH 10.5)溶液(1μg/ml)注入96孔培養皿(Falcon公司，PVC制)的各孔中，4℃下放置過液。洗凈后，200μl的3％BSA/PBS加入各孔中于37℃下作1小時的封閉。再度洗凈后各孔中加入50μl的培養上清液，于室溫下放置1小時，以0.05％Tween/PBS洗凈3次。
再將50μl含有3％BSA以及0.2％脫酯奶粉的PBS稀釋至2000倍的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶綴合物(Tago公司)加入各孔中，于室溫下放置1小時，再次洗凈，每孔中加入100μl以1mg/ml濃度溶解于含有0.25mM氯化鎂的1M二乙醇胺緩沖液(pH9.8)的對硝基苯基磷酸二鈉(和光純藥)溶液，于室溫下反應30分鐘。使用96孔的ELISA leader測定器測定405nm的吸光度，(Molecular Davicea公司Vmax)，選擇可分泌與重組HAT結合的單克隆抗體的雜交瘤。(4)雜交瘤的克隆對于如此選出的雜交瘤，進行2次的極限稀釋法的克隆再進行建株。具體而言，將小鼠腹腔浸出細胞制備出于HT培養基中106個/ml的比例，分注于各孔中，各孔中以0.5個懸濁于HT培養基的程度埋入雜交瘤細胞。在5％CO2的恒溫箱中，37℃條件下培養2星期，對該培養上清液以上述ELISA法進行篩選，取出單一菌落而進行建株。(5)雜交瘤的培養以及抗體的純化由以上操作所得產生抗HAT抗體的融合瘤20克隆中的6克隆適應于含有胰島素、轉鐵球蛋白、乙醇胺、亞硒酸鹽的無血清培養基的eRDF培養基(Gibco BRL公司)中進行培養，回收培養上清液。將培養上清液中的抗體以蛋白質G柱依常法純化。(6)HAT單克隆抗體的亞類分型上述(5)操作所得的純化抗HAT單克隆抗體6克隆，使用Boehringer公司制的IsoStrip(小鼠單克隆抗體的Isotyping Kit)進行亞類分型。其結果斷定#A3、#B3、#B5的3克隆為IgGI，#A6、#C2為IgM。對于#C3則不明。[實施例4]利用抗HAT抗體進行Western印跡重組HAT或天然HAT于還原條件下，以SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，硝酸纖維素膜(BIO-RAD公司)上進行Western印跡。以含有3％BSA的PBS于室溫下處理過夜，以含有3％BSA的PBS稀釋至10μg/ml[實施例2、3]而得到的抗HAT抗體于室溫下與印跡產物反應1小時。將硝酸纖維素膜以含有1％BSA之PBS洗凈6次后，與以含有3％BSA的PBS稀釋至25μg/ml之堿性磷酸酶結合羊抗人IgG抗體(TAGO公司)于室溫下反應1小時。將硝酸纖維素膜以含有1％BSA之PBS洗凈6次后，與NBT(氯化氮藍四唑)/BICP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸對甲苯胺鹽，PIERCE公司)于室溫下反應10分鐘使其顯色，顯示各個抗HAT抗體與重組HAT的結合。Western印跡的反應性，對于單克隆抗體而言，#A3及#B5的反應性較高，#B3的反應性則極低。至于多克隆抗體，抗N-19抗體(anti-N19 PAb)的反應性較高，抗rHAT抗體(anti-rHAT PAb)的反應性較低。又，anti-rHAT PAb并未顯示與來自肥大細胞類胰蛋白酶以及胰蛋白酶有交叉反應。且，使用正常兔子IgG作為陰性對照組。[實施例5]HAT中和活性的評估(1)HAT活性的測定方法對1.0ml的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.6)而言，其中含有100μM的胰蛋白酶合成底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(MCA甲基香豆素酰胺)和0.01％BSA，加入50μl含有HAT的溶液，于37℃下恒溫孵育1小時。然后加入1ml的30％醋酸，生成的7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)的量以螢光測定定量(熒光460nm，激發380nm)，算出蛋白酶活性。1分鐘內生成1pM的AMC定義為1活性單位(1單位＝1pM AMC/分鐘)。(2)抗HAT抗體的HAT中和活性之評估對含有2ng/ml的重組HAT，和0.01％BSA的0.5ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)而言，加入50μl的含有抗HAT抗體溶液，于37℃下恒溫孵育30分鐘。然后加入0.5ml含有200μM的胰蛋白酶合成底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA之50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)，于37℃下恒溫孵育1小時。再加入1ml的30％醋酸，生成的7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)的量以熒光測定定量(螢光460nm，激發光380nm)，計算抗HAT抗體的蛋白酶活性中和能力。結果如圖1所示。實施例2所得重組HAT(昆蟲細胞-桿狀病毒系統)經免疫所得抗HAT多克隆抗體，確認抗HAT抗體于236μg/ml濃度下具有27％活性抑制效果。[實施例6]HAT測定系統構建1對多克隆抗體的夾心EIA(酶免疫測定)的構建使用由實施例2(B)所得的抗HAT多克隆抗體(anti-rHAT PAb)依照以下的操作進行，構建夾心EIA系統。
(A)辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體的制備(1)抗體(F(ab’)2)的制備1ml的含有2.0mg/ml抗體(IgG)的PBS溶液中，加入100μl的1M醋酸緩沖液(pH4.2)與40μg的胃蛋白酶溶解于20μl的同種緩沖液，于37℃下反應4小時。反應終了后，使用以PBS平衡過的交聯葡聚糖G25柱(φ2cm×45cm)分離反應產物收集F(ab’)2。(2)抗體(F(ab’)2)的HRP標識2ml含有1mg/ml的抗體(F(ab’)2)之0.01M磷酸、0.15M NaCl(pH7.4)溶液中，加入50μl的N-(m-馬來酰亞胺安息香酸)-N-琥珀酰亞胺酯(MBS)的10mg/ml的二甲基甲酰胺溶液，于25℃下反應30分鐘。再使用填充交聯葡聚糖G-25的柱，以0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)進行膠體過濾，分離出馬來酰亞胺化抗體及未反應的MBS。另一方面，于2ml的HRP的10mg/ml 1M磷酸緩沖液(pH6.5)溶液中加入120μl的S-乙酰硫氫基琥珀酸酐的60mg/ml二甲基甲酰胺溶液，于25℃下反應2小時。再加入800μl的0.1M Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)、160μl的0.1M EDTA、1.6ml的1M羥氨，于0℃下反應4分鐘。其后將反應液放入火棉膠袋，使用含有5mM EDTA溶液的0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)、于4℃下透析3天，得到硫醇化HRP。再將2mg的馬來酰亞胺化抗體與4mg的硫醇化HRP混合，使用火棉膠袋于冰浴下濃縮至蛋白濃度為4至10mg/ml，于15至20℃下放置過夜。將此液體以Ultrogel AcA44(Pharmacia LKB公司制)填充柱作膠體過濾，得到抗HAT(F(ab’)2)HRP標記抗體。(B)抗體固定化平板的制備充分洗凈96孔平板(住友培克來特公司制，MS-3796F/碳素平板)，4℃下放置于抗體的20μg/ml PBS溶液中一整天后，以PBS洗凈，4℃下放置于1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中一整天得到抗體固定化平板。(C)測定系統的構建往上述(B)所制備的抗HAT抗體IgG固定化平板中，添加100μl的純化重組HAT(標準物質)之以0至1600ng/ml范圍含于1％BSA-0.1％脫脂奶粉的10mM PBS(pH 7.2)溶液(樣品稀釋液)，25℃下恒溫孵育4小時。其后，以含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗凈，將上述(A)所制備的抗HAT(F(ab’)2)HRP標記抗體(500μg/ml)于含1％BSA的10mM PBS(pH7.2)中稀釋100倍取100μl稀釋液加入每孔中，25℃下恒溫孵育2小時。吸除各孔中的溶液后，用含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗凈，各孔中加入100μl的含有3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和0.02％H2O22.5mM的0.1M磷酸/檸檬酸緩沖液(pH4.3)，于25℃下反應30分鐘后，作為反應停止劑于各孔中加入100ul的0.5M硫酸水溶液停止酶反應。然后使用分光光度計測定溶液于波長450nm處的吸光強度，此與標準物質濃度0至1600ng/ml對應制圖。結果如圖2表示。(D)生物體內成份中HAT檢測(1)唾液中HAT的檢測使用上述(C)的測定系統檢測人唾液中的HAT。將人的唾液以15000rpm離心15分鐘，取上清作為測定樣品。測定全部6種原液及用含有1％BSA-0.1％脫酯奶粉的10mM PBS(pH7.2)溶液(樣品稀釋液)稀釋至16倍的溶液。因其中3樣品的測定值較低故采用原液值，其他3檢體則采用16倍稀釋的值作為唾液中HAT濃度。測定結果與樣品中HAT活性(胰蛋白酶)同時列于表1中。
表1

*重組HAT表示胰蛋白酶類蛋白酶活性(2)咳痰中HAT的檢測痰由慢性呼吸道疾病患者中取得，以9倍的生理鹽水稀釋后，經勻漿處理，于10,000×g下離心10分鐘，其上清液作為測定樣品。將稀釋20倍進行測定，結果如圖3所示。其中粘液性-粘液膿性痰從以下病患中采樣。
CB；慢性支氣管炎SecCB；繼發性支氣管炎BA；支氣管哮喘BE；支氣管擴張癥DPB；彌漫性泛細支氣管炎又，膿性痰則如以下的病患中取樣BE；支氣管擴張癥DPB；彌漫性汽細支氣管炎在圖3中，M表示粘液性痰，P表示粘液膿性痰。
膿性痰表現出比粘液性痰較低的測定值。2.單克隆抗體以及多克隆抗體的夾心EIA的構建(1)各抗HAT單克隆抗體的液相抗原反應性的評估經亞類分型為IgG1型的#A3、#B3、#B5等三種抗HAT單克隆抗體，在液相中進行對重組HAT的結合性的評估。
評估方法則依據實施例6的1.(B)(C)進行。即，在96孔平板中加入50μl/孔的各抗HAT單克隆抗體的1或5μg/ml PBS溶液，4℃下放置過液，以固定平板上的抗體。
在已制備的抗HAT單克隆抗體IgG固定化平板中，加入100μl的純化重組HAT(標準物質)以0至1600ng/ml范圍含于1％BSA-0.1％脫脂奶粉的10mM PBS(pH 7.2)溶液(樣品稀釋液)，25℃下孵育4小時，其后，用含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH 7.2)洗凈，添加100μl上述(A)已制備的抗HAT(F(ab’)2)HRP標記抗體(500μg/ml)于每孔中，該抗體已用含1％BSA的10mM PBS(pH7.2)稀釋100倍，25℃下恒溫孵育2小時。吸除各孔中的溶液后，用含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗凈。各孔中添加100μl的含有0.02％3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽、2.5mM H2O2的0.1M磷酸/檸檬酸緩沖液(pH4.3)，于25℃下反應30分鐘后，作為反應停止劑于各孔中添加100μl的0.5M硫酸水溶液停止酶反應。然后使用分光光度計測定波長450nm處的溶液吸光強度，引與標準物質濃度0至300ng/ml對應制圖。其結果顯示液相抗原反應性有#B3＞#B5＞#A3的順序。結果如圖4所示。(2)測定系統的構建(A)生物素化抗體的制備使用上述(1)液相抗原反應性的測定結果最高的#B3抗HAT單克隆抗體，以及實施例2(B)所得的抗HAT多克隆抗體(anti-rHATPAb)，如以下進行IgG的生物素化將1ml的1-3mg/ml的IgG溶液(PBS(-))，與等滲的0.2M的NaHCO3(pH8.0)混合，然后加入100倍摩爾濃度的10mM生物素化試劑，于37#下恒溫孵育1小時。生物素化試劑通過將NHS-LC-Biotin(PIERCE公司制#21335分子量556)溶解二甲基甲酰胺為10mM制備得到。其后加入十分之一量的1M單乙醇胺，于37℃下進一步恒溫孵育1小時。將此反應液用PBS(-)緩慢調至2.5ml，施用于G-25膠體過濾柱中，使PBS(-)流出而回收生物素化IgG。此外，加入BSA使其終濃度為3％，加入NaN3使其終濃度為0.1％，保存最終混合物。(B)抗體固定化平板的制備充分洗凈96孔平板(住友培克來特公司制，MS-3796F/碳素平板)，每100μl的抗體的20μg/ml PBS溶液加入各孔中，4℃下放置一整天后，用PBS-0.05％Tween20洗凈，加入380μl之1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液于各洞穴中，4℃下放置一整天后得到抗體固定化平板。(C)測定系統的構建如上述(B)所制備的抗HAT抗體IgG固定化平板中，添加50μl該溶液含有1％BSA-0.1％脫脂奶粉的10mM PBS(pH7.2)溶液(檢體稀釋液)，該溶液含有的純化重組HAT(標準物質)范圍是0至400ng/ml以及50μl上述(A)所制備的含有10μg/ml生物素化IgG的10mM PBS(pH 7.2)溶液，該溶液中含有1％ BSA-0.1％脫脂奶粉最終混合物4℃下放置過夜。再將平板洗凈后，以100μl/孔的量加入含有稀釋至1萬倍的鏈霉親合素標記的過氧化酶(TAGO公司制，#SNN1004)的10mM PBS(pH7.2)溶液，該溶液含有1％BSA-0.1％脫脂奶粉25℃下恒溫孵育1小時。吸除各洞穴中的溶液后，以含有0.05％Tween20的10mM PBS(pH7.2)洗凈，各孔中添加100μl的含有0.02％ 3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和2.5mM H2O2的0.1M磷酸/檸檬酸緩沖液(pH4.3)，于25℃下反應15分鐘后，作為反應停止劑于各洞穴中添加100μl的0.5M硫酸水溶液停止酶反應。再使用分光光度計測定溶液于波長450nm處的吸光強度，此與標準物質濃度0至200ng/ml對應制圖。結果如圖5表示。
產業上可利用性本發明的單克隆抗體以及多克隆抗體作為治療藥可抑制或緩和許多生理活動如HAT對凝聚纖溶系統的作用、對呼吸道病態的作用、對呼吸道炎癥的作用、對癌細胞增殖或轉移的作用、對粘液纖毛運動或抗病毒感染作用等還可用于改善或治療其它不健康的生理狀態。
又，使用本發明的單克隆抗體以及多克隆抗體作為診斷藥，例如可測定唾液中、咳痰中以及血中的HAT濃度。
權利要求
1.一種抗體，該抗體可與人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶結合。
2.權利要求1中所述的抗體，該抗體為單克隆抗體。
3.權利要求2中所述的抗體，該抗體為鼠單克隆抗體。
4.權利要求3中所述的抗體，該抗體為鼠IgG單克隆抗體。
5.權利要求3中所述的抗體，該抗體為鼠IgM單克隆抗體。
6.權利要求1中所述的抗體，該抗體為多克隆抗體。
7.權利要求6中所述的抗體、該抗體為兔子多克隆抗體。
8.一種抗體，通過免疫人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的部分肽段獲得。
9.一種抗體，通過免疫部分肽段獲得，該部分肽段包含人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶成熟部分N末端1至19殘基的一部分或全部。
10.權利要求8或9中所述的抗體，該抗體為多克隆抗體。
11.權利要求10中所述的抗體，該抗體為兔子多克隆抗體。
12.權利要求1至11中任一項所述的抗體，使用該抗體進行酶免疫測定可測定生物體內天然的人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶。
13.權利要求1至11中任一項所述的抗體，使用該抗體進行Western印跡可檢測生物體內天然的人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶。
14.權利要求1至11中任一項所述的抗體，可抑制其中的人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的活性。
15.權利要求1至11中任一項所述的抗體，可中和其中的人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的活性。
16.權利要求3至5中任一項所述的抗體，該抗體的表位位于人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶氨基酸序列的第187至418位之間。
17.權利要求1至11中任一項所述的抗體，其中的免疫原為重組人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶。
18.一種檢測或測定人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的方法，該方法使用權利要求1至11中任一項所述的抗體。
19.一種人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶的免疫測定法，該方法使用權利要求1至11中任一項所述的抗體。
20.一種包含權利要求14所述抗體的治療藥。
21.一種包含權利要求15所述抗體的治療藥。
22.一種動物細胞，該細胞可產生權利要求2至5中任一項所述的抗體。
23.一種可產生權利要求2至5中任一項所述抗體的雜交瘤細胞或源于雜交瘤細胞的動物細胞。
全文摘要
本發明提供一種以測定生物樣品中人類氣管胰蛋白類酶蛋白酶為基礎的病態診斷方法和與人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶有關的疾病治療藥。本發明涉及與人類氣管胰蛋白酶蛋白酶結合的抗體,蛋白酶免疫測定法,含有阻礙人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶活化的抗體的治療藥,以及含有中和人類呼吸道胰蛋白酶類蛋白酶活性的抗體的治療藥。
文檔編號G01N33/573GK1339064SQ00803389
公開日2002年3月6日 申請日期2000年12月4日 優先權日1999年12月6日
發明者江口廣志, 山岡一良, 小川弘子, 安岡劭 申請人:帝人株式會社