酯酶蛋白及其編碼基因以及它們的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酯酶蛋白，還涉及該酯酶蛋白的編碼基因，含有編碼酯酶蛋白的 基因的重組載體和細胞，含有該酯酶蛋白的組合物，以及所述酯酶蛋白及其編碼基因的應 用。
【背景技術】
[0002] 酯酶（EsteraseE.C.3. 1. 1. 1)是自然界中常見的酯水解酶類，普遍存在于動物、 植物和微生物中，其中微生物來源的酯酶種類最為豐富。不同來源的酯酶基因差別大，同 源性不高，但在蛋白質三維結構上具有極高的相似性，即a/P折疊酶結構；催化反應機 理都遵循絲氨酸水解酶的反應機制，即催化結構域包含絲氨酸-組氨酸-谷氨酸(或天冬 氨酸）三聯體活性中心結構并在絲氨酸活性位點附近存在絲氨酸水解酶的特征保守序列 G-X-S-X-G。酯酶和脂肪酶在結構和催化機理上具有極高的相似性，其主要區別：酯酶主要 是水解短鏈水溶性酯底物，催化過程中遵循典型的米氏方程；而脂肪酶能夠催化水解疏水 性長鏈脂肪酸脂底物，并且在催化過程中表現界面活性。
[0003] 微生物來源的酯酶種類最為繁多，根據的它們的氨基酸序列相似性和基本生物學 特性，Arpigny于1999年將其系統劃分為8個大的家族；其中家族一為脂肪酶，家族二到八 為酯酶。幾年來隨著大量新的酯酶基因的發現，目前已提出了 9到15酯酶家族。
[0004] 酯酶/脂肪酶由于其蛋白分子穩定、催化反應簡單、不依賴輔助因子、底物范圍廣 等優點，被廣泛的應用于食品加工、洗滌劑，醫藥、化妝品、化合物制備等行業。據初步統計 全球工業酶產值在2004達到了 20億，并以每年4-5%的數率在增長，其中脂肪酶類的使用 占總用酶頻率的10%。近年來隨著手性化合物在制藥、農藥、香料、液晶、功能性高分子等工 業中廣泛的應用，酯酶對手性化合物拆分的特性更加凸現出來。相比于脂肪酶，酯酶在手性 拆分上表現著更顯著的效果，例如利用酯酶NP對手性萘普生進行拆分可以得到99%光學純 的轉化率達到95%的對應體產物。

【發明內容】

[0005] 本發明的發明人基于對來自西藏冰川土壤的分析，意外的發現了酯酶蛋白及其編 碼基因。另外，本發明還提供了含有編碼所述酯酶蛋白的基因的重組載體、細胞，以及含有 所述酯酶蛋白的組合物，以及它們的應用。
[0006] 第一方面，本發明提供了一種酯酶蛋白，其中，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQID No :2所示。
[0007] 第二方面，本發明提供了一種編碼酯酶蛋白的基因，其中，該基因的核苷酸序列為 能夠編碼SEQIDNo :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0008] 第三方面，本發明提供了一種引物對，其中，該引物對包括如SEQIDNo :3所示的 上游引物和如SEQIDNo :4所示的下游引物。
[0009] 第四方面，本發明提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有如上所述的基因。
[0010] 第五方面，本發明提供了一種轉基因細胞，其中，該轉基因細胞含有如上所述的基 因。
[0011] 第六方面，本發明提供了一種組合物，其中，該組合物含有如上所述的酯酶蛋白。
[0012] 第七方面，本發明提供了如上所述的酯酶蛋白、如上所述的基因、如上所述的重組 載體、如上所述的轉基因細胞和如上所述的組合物在降解硝基苯酚酯和/或在食品、洗滌 用品、醫藥、化妝品中的應用。
[0013] 由實施例可以看出，本發明的提供的酯酶蛋白具有較高的酯酶活性，能夠有效地 降解硝基苯酚酯。并且具有廣泛的pH值耐受性、低溫耐受性以及耐鹽的特性。
[0014] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0015] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0016] 圖1為表達純化的各個階段中重組蛋白溶液的SDS-PAGE電泳圖；M :蛋白Marker ; 1:對照酶液；2:重組菌粗酶液；3 :Ni-NDA His-Bind Column第一次純化后得到的重組蛋白 溶液；4:Ni-NDA His-Bind Column第二次純化后得到的重組蛋白溶液。
[0017] 圖2顯示了重組蛋白對不同底物的比活。
[0018] 圖3顯示了重組蛋白在不同溫度下的比活。
[0019] 圖4顯示了重組蛋白在不同pH下的比活。
[0020] 圖5顯示了重組蛋白在不同NaCl濃度下的比活。
【具體實施方式】
[0021] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0022] 第一方面，本發明提供了一種酯酶蛋白，其中，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0023] 根據本發明，所在酯酶蛋白可以由人工合成獲得，也可以通過該酯酶蛋白的氨基 酸序列獲得其編碼基因，然后再進行相應的生物表達獲得。
[0024] 基于此，第二方面，本發明提供了一種編碼如上酯酶蛋白的基因。
[0025] 本領域技術人員公知，遺傳密碼子具有簡并性，因此，在了解如上酯酶蛋白的氨基 酸序列的情況下，本領域技術人員根據常規的技術手段能夠獲得核苷酸序列不同的、且能 夠編碼如上酯酶蛋白編碼基因。優選的情況下，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0026] 第三方面，本發明提供了一種引物對，其中，該引物對包括如SEQ ID No :3所示的 h游引物（5' -GCGGGATCCATGACTGTGAATCCTC-3' )和如 SEQ ID No :4所示的下游引物（5'-GC GGAGCTCGGACTATTTTTGTCCCAG-3' )。
[0027] 本發明提供的上述引物對能夠特異性的擴增SEQIDNo:1所示的基因。所述特異 性擴增是指所述引物對能夠擴增SEQIDNo.1所示的核酸、并產生特定大小的目標條帶，所 述引物對不能夠擴增SEQIDNo.1所示的核酸以外的核酸或者擴增不能產生特定大小的目 標條帶。
[0028] 另外，根據本發明，為了便于該引物對所擴增的基因片段能夠有效地與載體相連， 所述引物對上還設計有酶切位點，如SEQ ID No :3所示的上游引物下劃線部分為BamHI的 酶切位點，SEQ ID No :4所示的下游引物下劃線部分為SacI的酶切位點。
[0029] 本發明需要說明的是，本發明提供的所述引物中的酶切位點并不能夠作為對本發 明的引物的限制，本領域技術人員根據預定的與所述引物對擴增的基因相連的載體上的酶 切位點，能夠相應的設計具有不同酶切位點的引物對。
[0030] 第四方面，本發明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有如上所述的基 因。
[0031] 根據本發明，所述重組載體具體可以為重組表達載體。可以用現有的表達載體構 建含有所述基因的重組表達載體。為了增強目的基因的轉錄，在使用所述基因構建重組表 達載體時，可以在其轉錄起始密碼子前添加任何一種本領域常規的增強型啟動子或組成型 啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結合使用。此外，為了進一步增強目的基因的轉 錄和/或翻譯，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用轉錄增強子和/或翻譯增 強子。
[0032] 本領域技術人員能夠理解的是，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區 域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。
[0033] 根據本發明，上述啟動子以及增強子可以為本領域常規的啟動子和增強子，在此 不再詳細贅述。
[0034] 根據本發明，所述"載體"可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒、粘 粒、噬菌體及反轉錄病毒等。優選地，所述載體為pET28a質粒。
[0035] 根據本發明，為了便于目的蛋白的分離與純化，在構建所述載體時，還可以加入表 達如表1所不的標簽的核昔酸序列，在目的蛋白中，表1所不的標簽連接在目的蛋白的氣基 末端或羧基末端。
[0036] 表1標簽的序列
【主權項】
1. 一種酯酶蛋白，其特征在于，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
2. -種編碼酯酶蛋白的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列為能夠編碼SEQID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的基因，其中，該基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。
4. 一種引物對，其特征在于，該引物對包括如SEQIDNo:3所示的上游引物和如SEQ IDNo:4所示的下游引物。
5. -種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權利要求2所述的基因。
6. -種轉基因細胞，其特征在于，該轉基因細胞含有權利要求2所述的基因。
7. 根據權利要求6所述的轉基因細胞，其中，所述轉基因細胞為原核細胞。
8. -種組合物，其特征在于，該組合物含有權利要求1所述的酯酶蛋白。
9. 權利要求1所述的酯酶蛋白、權利要求2所述的基因、權利要求5所述的重組載體、 權利要求6所述的轉基因細胞和權利要求8所述的組合物在降解硝基苯酚酯和/或在食 品、洗滌用品、醫藥、化妝品中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其中，所述硝基苯酚酯為對硝基苯酚乙酸酯，對硝基 苯酚丙酸酯，對硝基苯酚丁酸酯，對硝基苯酚己酸酯、對硝基苯酚辛酸酯和對硝基苯酚癸酸 酯中的一種或多種。
【專利摘要】本發明公開了一種酯酶蛋白，其中，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。另一方面，本發明還提供了一種編碼酯酶蛋白的基因，其中，該基因的核苷酸序列為能夠編碼SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本發明還提供了如上所述的酯酶蛋白及其編碼基因的應用。由實施例可以看出，本發明的提供的酯酶蛋白具有較高的酯酶活性，能夠有效地降解硝基苯酚酯。
【IPC分類】C12P7-40, C12P7-52, C12N9-18, C12N15-11, C12P7-54, C12N15-63, C12N1-21, C12N15-55, C12P13-00
【公開號】CN104762276
【申請號】CN201410008456
【發明人】薛燕芬, 翟磊, 馬延和
【申請人】中國科學院微生物研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年1月8日