胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶的制作方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及黃曲霉毒素解毒酶，特別涉及到對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解 毒酶。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的劇毒性次生代謝產物，已 經確定的黃曲霉毒素分子的結構主要有八種，分別是AFB1，AFB2, AFG1，AFG2, AFM1，AFM2， AFGM1，AFGM2,其中毒性最強的黃曲霉毒素 Bl被認為是潛在的對人類危害極為突出的一類 強致癌誘變劑，一次大量攝入黃曲霉毒素 Bl會引起人及動物的急性中毒、甚至死亡；小劑 量長期攝入會致畸、致突變和致癌，即使幾十PPb的含量仍有極大的毒性；黃曲霉毒素廣泛 存在于谷物、糧食和飼料原料中，畜禽攝入污染了黃曲霉毒素的飼料會引起動物體重下降 或引發疾病，通過食物鏈間接進入人體的黃曲霉毒素具有極強的致癌作用，嚴重威脅人類 健康。因此，解決黃曲霉毒素對飼料糧食的污染及對動物生產和人類健康的危害有非常重 要的意義；
[0003] 由于黃曲霉毒素的熱穩定性好、耐高溫，飼料中含有的毒素絕大部分是隨著動物 對其消化在消化道內分解過程逐步釋放出來，化學去毒方法通常不具備在飼料中應用價 值；傳統的物理吸附方法存在特異性差，應用效果促在爭議的問題。生物酶解黃曲霉毒素 具有特異性好，分解效果切確等優點。利用黃曲霉毒素解毒酶對AFBl進行降解具有以上優 點，黃曲霉毒素解毒酶（Aflatoxin Detoxinfizyme，ADTZ)是一種在體外能夠使一族黃曲霉 毒素結構雙呋喃環中的呋喃雙鍵斷裂，將黃曲霉毒素轉化成無毒產物的酶。
[0004] 目前，飼料添加劑用酶的使用都是通過添加在飼料中一起喂食動物，經胃到達腸 道，在腸道中發揮酶的作用。在這個過程中，飼用酶會受到動物腸道消化酶不同程度的破 壞，而降低了使用效率，因此，提高飼料用酶對消化酶，如胰蛋白酶的耐受性，可以延長其在 動物體內消化道的使用壽命，對飼用酶的應用十分有價值。
[0005] 本發明利用酶促反應理論和蛋白分子之間相互識別的原理，以及計算化學的方 法，設計并篩選到了一株黃曲霉毒素解毒酶突變體，所獲得的黃曲霉毒素解毒酶突變體對 AFBI催化降解功能不受影響，而對胰蛋白酶的耐受提高了，該突變株對胰蛋白酶抗性比野 生型提高了 2. 73 倍，命名為 ADTZK213G/K244G/K27°S。

【發明內容】

[0006] 本發明的首要目的是提供一種對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶。
[0007] 本發明是對黃曲霉毒素解毒酶的基因（稱為ADTZ基因）進行定點突變。由假密 環菌（Armillariellatabescens)AS165中獲得的黃曲霉毒素解毒酶，已經被測序，GENBANK 登錄號為AY941095。該酶的成熟蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0008] 根據本發明所述的一種定點突變改造的黃曲霉毒素解毒酶，是由氨基酸序列為 SEQ ID NO. 1的來源于假密環菌（Armillariellatabescens)的黃曲霉毒素解毒酶中制造多 個氨基酸取代而產生的，對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶，所述的氨基酸取代是 第213、244和270位的取代。
[0009] 根據本發明所述的定點突變改造的黃曲霉毒素解毒酶的進一步特征，所述在第 213位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代賴氨酸；在244位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代 賴氨酸；在第270位的氨基酸取代是用絲氨酸取代賴氨酸；所述的定點突變改造的黃曲霉 毒素解毒酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
[0010] 本發明所述的作用于黃曲霉毒素的突變體黃曲霉毒素解毒酶（ADTZK213e/K244e/K27° s)， 經人工腸液（pH6. 0，lmg/mL胰蛋白酶溶液）處理IOmin后，其對胰蛋白酶的抗性比野生型 ADTZ提高2. 73倍，經人工腸液（pH6. 0, lmg/mL胰蛋白酶溶液）處理180min后，其半衰期比 野生型酶延長了 72分鐘，其他酶學性質與野生型酶基本一致。
[0011] 進一步地，本發明提供了一種DNA分子，其編碼本發明所述的對胰蛋白酶抗性提 高的黃曲霉毒素解毒酶。
[0012] 優選地，本發明所述的DNA分子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3。
[0013] 本發明的另一個目的是提供一種載體，其含有本發明所述的DNA分子。
[0014] 本發明的又一個目的是提供一種宿主細胞，其含有本發明所述的DNA分子，或者 含有本發明所述的載體。
[0015] 上述載體和宿主細胞都可以通過本領域公知的技術手段進行制備。
[0016] 本發明還提供了本發明所述的對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶的生產 方法，包括：在適于黃曲霉毒素解毒酶表達的條件下培養本發明所述的宿主細胞，并從培養 基中分離所述的黃曲霉毒素解毒酶。
[0017] 當本發明所述的DNA分子以合適的取向和正確的閱讀框插入到所述的載體，或者 轉入所述的宿主細胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表達系統中表達。許多 宿主-載體系統都可以用來表達蛋白質編碼序列。宿主-載體系統包括但不限于：用噬菌 體、質粒或粘粒轉化的細菌；含有酵母載體的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳動物細胞 系統；用病毒感染的昆蟲細胞系統；用細菌感染的植物細胞系統。本發明優選的載體包括 病毒載體、質粒、粘粒或者寡核苷酸。
[0018] 本發明優選的宿主為真核系統如畢赤酵母；本發明優選的蛋白質表達方法為畢赤 酵母甲醇誘導分泌表達。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示本發明所述的突變體與野生型ADTZ蛋白在胰蛋白酶處理前和處理后的 酶比活力。
[0020] 圖2是本發明所述的突變體的酶活測定標準曲線。
[0021] 圖3是本發明所述的突變體的蛋白定量標準曲線。
[0022] 圖4是SDS-PAGE蛋白電泳圖，圖4中，"一"處為目的蛋白條帶，大小為77Kd左右； "空載"為不含目的基因的野生型畢赤酵母SMD1168對照樣品；"wtADTZ"為野生型黃曲霉毒 素解毒酶蛋白；mADTZ為突變體mADTZ K213e/K244e/K27°s蛋白。
【具體實施方式】
[0023] 本文中所采用的術語，除非另有說明，均為本領域技術人員所通常理解的含義。以 下提供在本發明中使用的一些特殊術語的定義。
[0024] "wtADTZ"表示野生型黃曲霉毒素解毒酶，其基因以斜體WtADTZ表示。
[0025] "mADTZK213e/K244e/K27°s" 表示突變體黃曲霉毒素解毒酶 mADTZK213e/K244e/K27°s，其基因以 mADTZK213G/K244G/K27°s 表示。
[0026] 實施例1 :黃曲霉毒素解毒酶基因的PCR擴增和測序
[0027] 1、本發明以假蜜環菌來源的的黃曲霉毒素解毒酶基因（AY941095. 1)序列作為參 考，采用軟件Primer 5設計并合成兩條寡核苷酸引物，堿裂解法提取DH-5a中的PSA質 粒，通過PCR法擴增ADTZ目的基因。
[0028] 兩條PCR引物如下：
[0029] 正向引物：
[0030] 5' GTTTCTTCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAATGGCCACCACAACTGTCC 3' ；
[0031] 反向引物：
[0032] 5? GTTTCTTCCTGCAGCGGCGCTACTAGTTCACAATCGTCTCTCAATGAAACT 3，。
[0033] 下劃線部分為接頭，其中藍色堿基分別為EcoRI、Xbal、Spel、Pest限制性內切酶 酶切位點。
[0034] PCR反應體系如下：
[0035] IOxKOD緩沖液 5ul PSA-ADTZ 模版 Iul KOD-Plus-NEO Iul dNTPs 5ul ddH20 32ul 25mM MgSO4 3uL 正向引物F 1.5ul 反向引物R 1.5u! 合計 50ul
[0036] PCR程序設定：
[0037] 94°C 預變性 2min;
[0038] 94°C，15s ;67°C，30s ;
[0039] 68°C，2min 30 個循環；
[0040] 68 °C, 5min〇
[0041] PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA回收試劑盒進行膠回收，得到大 約2. Ikb的片段。
[0042] 實施例2 :黃曲霉毒素解毒酶基因（ADTZ)與克隆載體Taox+PgHT+PB的連接
[0043] 1.將mADTZ目的基因和克隆載體Taox+PgHT+PB分別用限制性內切酶EcoRI和 Spel/Xbal于37°C酶切lOmin，酶切條件如下：
[0044]
【主權項】
1. 一種對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶，其特征在于：它是由氨基酸序列為 SEQ ID NO. 1的來源于假密環菌（Armillariellatabescens)的黃曲霉毒素解毒酶中制造 多個氨基酸取代而產生的、對胰蛋白酶抗性更強的解毒酶，所述的氨基酸取代是第213、244 和270位的取代。
2. 根據權利要求1所述的對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶，其特征在于：所 述在第213位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代賴氨酸；在244位的氨基酸取代是用半胱氨 酸取代賴氨酸；在第270位的氨基酸取代是用絲氨酸取代賴氨酸；所述的定點突變改造的 黃曲霉毒素解毒酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3. -種DNA分子，其特征在于：其編碼權利要求2所述的對胰蛋白酶抗性提高的黃曲 霉毒素解毒酶。
4. 根據權利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3。
5. -種載體，其特征在于：其含有權利要求3或4所述的DNA分子。
6. -種宿主細胞，其特征在于：其含有權利要求3或4所述的DNA分子，或者含有權利 要求5所述的載體。
7. -種根據權利要求1所述的對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶的生產方法， 其特征在于，所述方法包括：在適于黃曲霉毒素解毒酶表達的條件下培養權利要求6所述 的宿主細胞，并從培養基中分離所述的黃曲霉毒解毒化酶。
【專利摘要】本發明公開了一種對胰蛋白酶抗性提高的黃曲霉毒素解毒酶。本發明通過蛋白質工程技術對野生型黃曲霉毒素解毒酶三維結構外層部位的關鍵氨基酸殘基進行了改造，提供了一種獲得對胰蛋白酶抗性提高的ADTZ突變體。本發明所述的作用于黃曲霉毒素的突變體黃曲霉毒素解毒酶(ADTZK213C/K244C/K270S)，對胰蛋白酶的抗性比野生型ADTZ提高2.73倍，其半衰期比野生型酶延長了72分鐘，其他酶學性質與野生型酶基本一致。
【IPC分類】C12N15-53, C12N15-81, C12N1-19, C12N9-02, C12R1-645, C12R1-84
【公開號】CN104611305
【申請號】CN201410850778
【發明人】姚冬生, 邱玉信, 謝春芳, 劉大嶺
【申請人】暨南大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月30日