一種含有能夠降解苯并[ghi]苝功能基因的質粒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物學與分子生物學技術領域，具體涉及一種含有能夠降解苯并[ghi]花功能基因的質粒。
【背景技術】
[0002]多環芳徑(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環的有毒有機污染物，具有強烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用。PAHs能通過生物累積及食物鏈的傳遞作用對生態環境和人體健康造成極大危害，已引起各國環境科學家的高度重視。對環境中多環芳烴的治理技術主要有物理法、化學法和生物法，其中生物法具有操作簡單、運行費用低、無二次污染等優點。一般來說，隨著多環芳烴苯環數量的增加，其降解速率降低。低分子量的多環芳烴在環境中能較快被降解，在環境中存在的時間較短，而高分子量的多環芳烴，例如芘、熒蒽、苯并[a]芘、苯并[ghi]茈、茚并[l，2，3_cd]芘、苯并[b]熒蒽及苯并[k]熒蒽等則難于降解，較長期存在于環境中。因此，構建多環芳烴高效降解菌來強化降解已成為去除多環芳烴污染的一種重要方法。
[0003]多環芳烴降解質粒是細胞內能夠自我復制的雙鏈環狀的小分子DNA，能降解芳香族化合物的代謝酶通常是由降解質粒基因編碼的。因此，多環芳烴降解質粒上攜帶了部分的降解基因信息，可通過轉化作用連接到宿主細菌中構成重組菌，從而使重組菌表現相應的降解多環芳烴的性能。從多環芳烴降解菌株中提取與純化得到多環芳烴降解質粒對于構建新的多環芳烴高效降解菌以及提高多環芳烴的降解性能都具有重要的意義。但是，國內外缺少關于多環芳烴降解質粒方面的研宄報道。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種含有能夠降解苯并[ghi]茈功能基因的質粒。所述含有降解苯并[ghi]花功能基因的質粒由菌株羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum lupini DW3的菌液經過提取與純化得到的。提取與純化含有降解苯并[ghi]茈功能基因的質粒所用的菌株羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum lupini DW3，2013年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研宄所，菌種保藏號為CGMCC N0.8623。
[0005]從菌株羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum lupini DW3中提取與純化含有降解苯并[ghi]茈功能基因的質粒的具體方案為:
[0006](I)向體積為500mL的錐形瓶內加入400mL基礎培養基、1.0mL微量金屬液、0.1mL質量濃度為10mg/L的維生素c溶液，搖勻后作為液體培養基備用；其中基礎培養基的組成為 -NH4NO3:1.7g.L-1，KH2PO4:1.0g.L-1，K2HPO4:1.0g.L Λ MgCl2:0.30g.L-1，CaCl2.2H20:0.15g.ΙΛ 微量金屬液的組成為:CoCl 2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35mg.L Λ H3BO3:11.0mg.ΙΛ MnCl2.4H20:45mg.?Λ Na2MoO4.2H20:5.5mg.?Λ NiCl2.2H20:4.5mg.?ΛZnCl2:4.5mg.L S
[0007](2)在超凈工作臺中向體積為10mL的錐形瓶中加入6.0mL濃度為lg/L的苯并[ghi]茈丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天；
[0008](3)向步驟⑵中的錐形瓶內加入60mL按步驟⑴配制的液體培養基；
[0009](4)在超凈工作臺中挑取菌株羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum lupini DW3，將其接種至步驟(3)中的錐形瓶中，在溫度為25?30°C、轉速為100r/min的振蕩器中培養20?22天；
[0010](5)將步驟(4)中的菌液轉移到容積為15mL的離心管中，在10000r/min條件下離心lOmin，棄去上清液；
[0011](6)向步驟(5)中的離心管中加入1mL pH值為9.0濃度為0.08M的NaH2PO4緩沖液，旋禍振蕩5min后再進行超聲波振蕩15min，在10000r/min條件下離心lOmin，棄去上清液分離出菌體；
[0012](7)向由步驟(6)的離心管中加入7mL溶液A，然后混勻；溶液A的組成為:50mL0.45M 三羥基甲基氨基甲烷-HCl，20mL 0.25M EDTA，20mL 0.9M KCl，1mL 百分比濃度為2.0%的氯化十六烷基三甲胺，pH 8.2 ;然后加入2.2mgN-乙酰胞壁質聚糖水解酶，在O?4°C條件下振蕩1min后加入1.5mL濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液，旋渦振蕩5min后在55°C條件下水浴振蕩lh，在10000r/min條件下離心lOmin，收集上清液；
[0013](8)向由步驟(7)得到的上清液中加入ImL濃度為5.5M的醋酸鉀和0.5mL異丙醇，在O?4°C條件下振蕩15min，在10000r/min條件下離心lOmin，收集上清液；
[0014](9)將由步驟(8)得到的上清液加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入離心管中，在10000r/min條件下離心lOmin，倒去離心管中的液體；重復這一過程，直至所有由步驟(8)得到的上清液都經過離心純化柱純化；
[0015](10)向經步驟(9)處理后的離心純化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的組成為:5mL4.5M鹽酸胍，1mL 3.5M醋酸鉀與85mL無水乙醇，pH 7.0 ;在O?4°C條件下振蕩15min，在10000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體；
[0016](11)向經步驟(10)處理后的離心純化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的組成為:40mL 1mM 三羥基甲基氨基甲烷-HCl，30mL 3.0MNaCl，30mL 1.5mM EDTA, pH 8.5 ;在 55°C條件下振蕩20min，在lOOOOr/min條件下離心5min ;將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min條件下離心5min ;離心管中液體即為含有降解苯并[ghi]茈功能基因的質粒溶液，在_20°C保存備用。
[0017]本發明得到的含有降解苯并[ghi]茈功能基因的質粒可以構建對苯并[ghi]茈具有降解功能的菌株，提高以苯并[ghi]茈為代表的多環芳烴污染物的生物降解效果，對于多環芳烴苯并[ghi]茈污染土壤及水體有應用潛力。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實例進一步說明本發明。
[0019]材料:
[0020](I)菌株羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum lupini DW3，該菌株在2013年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研宄所，菌種保藏號為CGMCC N0.8623。
[0021](2)大腸桿菌BL21感受態細胞(天津博美科生物技術有限公司)。
[0022](3)苯并[ghi]花(純度多 99%, Sigma Aldrich)。
[0023](4)丙酮、N-乙酰胞壁質聚糖水解酶、異丙醇。
[0024](5) pH值為9.0濃度為0.08M的NaH2PO4緩沖液。
[0025](6)濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液。
[0026](7)濃度為5.5M的醋酸鉀溶液。
[0027](8)溶液A 10mL,其組成為:50mL 0.45M三羥基甲基氨基甲烷-HC1，20mL 0.25MEDTA，20mL 0.9M KCl，1mL百分比濃度為2.0 %的氯化十六烷基三甲胺，pH 8.2。
[0028](9溶液B 100mL，其組成為:5mL 4.5M鹽酸胍，1mL 3.5M醋酸鉀與85mL無水乙醇，pH 7.0ο
[0029](10)溶液C lOOmL，其組成為:40mL 1mM三羥基甲基氨基甲烷-HCl，30mL 3.0MNaCl，30mL 1.5mM EDTA, pH 8.5。
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