本發明涉(she)及生物分子(zi)檢測，具體涉(she)及一種曲(qu)霉(mei)菌屬(shu)鑒(jian)別(bie)用原位分子(zi)標記探針、試劑(ji)盒及曲(qu)霉(mei)菌屬(shu)的鑒(jian)別(bie)方法(fa)。

背景技術：

1、侵襲性真(zhen)菌(jun)(jun)感(gan)染在重癥患者及免(mian)疫抑制(zhi)人群具有較高發病率(lv)和死亡率(lv)。曲(qu)霉(mei)(mei)菌(jun)(jun)為一種常見的真(zhen)菌(jun)(jun)感(gan)染類型，其與毛霉(mei)(mei)菌(jun)(jun)的臨床表現(xian)相似，缺乏特異(yi)性，但在治(zhi)療及用藥選擇(ze)上(shang)不同(tong)于毛霉(mei)(mei)菌(jun)(jun)。

2、臨(lin)(lin)床上對致病(bing)(bing)(bing)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)雖較(jiao)(jiao)多，但(dan)迄今無(wu)法(fa)(fa)(fa)同(tong)時(shi)滿足快速(su)精準、經濟易(yi)操(cao)作(zuo)(zuo)的(de)(de)(de)(de)臨(lin)(lin)床需求。組織病(bing)(bing)(bing)理(li)學(xue)是(shi)(shi)診斷(duan)(duan)侵襲性(xing)(xing)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)感染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)金標準之一，但(dan)由于(yu)(yu)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)形(xing)態結(jie)(jie)構類(lei)似，僅通過he染(ran)(ran)色(se)及(ji)特殊(shu)染(ran)(ran)色(se)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)觀察(cha)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)形(xing)態特征(zheng)的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)式來(lai)鑒定真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)感染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)種屬(shu)較(jiao)(jiao)為(wei)困(kun)難(nan)(nan)。雖然基(ji)于(yu)(yu)形(xing)態學(xue)的(de)(de)(de)(de)組織病(bing)(bing)(bing)理(li)學(xue)特殊(shu)染(ran)(ran)色(se)法(fa)(fa)(fa)簡單易(yi)操(cao)作(zuo)(zuo)，但(dan)無(wu)法(fa)(fa)(fa)精準分(fen)(fen)類(lei)，尤其難(nan)(nan)以區分(fen)(fen)曲霉、毛(mao)霉等絲狀真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)感染(ran)(ran)，多靠診斷(duan)(duan)工作(zuo)(zuo)者的(de)(de)(de)(de)個人經驗性(xing)(xing)判斷(duan)(duan)，具有(you)一定主(zhu)觀性(xing)(xing)，當真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)含量較(jiao)(jiao)少(shao)、不同(tong)種屬(shu)的(de)(de)(de)(de)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)形(xing)態有(you)重(zhong)疊均易(yi)導(dao)(dao)致誤判。真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)培養法(fa)(fa)(fa)準確性(xing)(xing)高，但(dan)陽性(xing)(xing)率低、培養周期長，且(qie)難(nan)(nan)以判定是(shi)(shi)定植(zhi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)還(huan)是(shi)(shi)致病(bing)(bing)(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)，不適用(yong)(yong)于(yu)(yu)快速(su)診斷(duan)(duan)。g試驗和(he)gm實(shi)驗可實(shi)現快速(su)檢(jian)(jian)測，但(dan)只能鑒定部分(fen)(fen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)屬(shu)，不能鑒別(bie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)種，且(qie)藥(yao)物(wu)治療后(hou)可能會(hui)影響(xiang)到(dao)結(jie)(jie)果(guo)的(de)(de)(de)(de)準確性(xing)(xing)。目前真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)檢(jian)(jian)測常(chang)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子檢(jian)(jian)測方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)為(wei)pcr法(fa)(fa)(fa)，必須在(zai)特定檢(jian)(jian)測閾值(zhi)內才能檢(jian)(jian)出，陽性(xing)(xing)率在(zai)15-90％，檢(jian)(jian)測樣本多限定在(zai)血液(ye)(ye)、支氣管肺泡灌洗(xi)液(ye)(ye)、痰液(ye)(ye)等體液(ye)(ye)標本，尚(shang)沒(mei)有(you)適用(yong)(yong)于(yu)(yu)石蠟標本的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測，樣本中真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)載菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)量對檢(jian)(jian)測結(jie)(jie)果(guo)有(you)重(zhong)要影響(xiang)，還(huan)存在(zai)難(nan)(nan)以排除非致病(bing)(bing)(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)及(ji)環境(jing)污(wu)染(ran)(ran)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、實(shi)驗室硬件配置及(ji)技(ji)術操(cao)作(zuo)(zuo)要求高、不適宜(yi)基(ji)層醫院普及(ji)開展等問題(ti)。這些檢(jian)(jian)測方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)存在(zai)的(de)(de)(de)(de)問題(ti)，會(hui)導(dao)(dao)致早期特異性(xing)(xing)診斷(duan)(duan)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)感染(ran)(ran)較(jiao)(jiao)困(kun)難(nan)(nan)，嚴重(zhong)影響(xiang)抗(kang)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)藥(yao)物(wu)的(de)(de)(de)(de)最佳使用(yong)(yong)時(shi)機(ji)，導(dao)(dao)致患者預(yu)后(hou)不良。

3、通過分子方(fang)法(fa)(fa)從(cong)福爾馬林(lin)固定(ding)的(de)(de)石蠟包埋組織(zhi)中原(yuan)(yuan)位(wei)鑒定(ding)出(chu)感染(ran)的(de)(de)致病真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)病原(yuan)(yuan)體(ti)是快速確(que)定(ding)侵襲性真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)感染(ran)的(de)(de)有效方(fang)法(fa)(fa)，能克(ke)服形(xing)態學(xue)染(ran)色法(fa)(fa)、真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)培養(yang)法(fa)(fa)、g試驗(yan)和gm實(shi)驗(yan)法(fa)(fa)、pcr檢測法(fa)(fa)所(suo)存在的(de)(de)不(bu)(bu)足(zu)；且不(bu)(bu)受樣本(ben)真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)載量的(de)(de)影響，即便僅(jin)存在一根真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)dna也可檢測。目前對于曲霉(mei)菌(jun)(jun)的(de)(de)原(yuan)(yuan)位(wei)雜交檢測，尚未有標準統一的(de)(de)雜交方(fang)法(fa)(fa)，也未見大規模(mo)的(de)(de)實(shi)驗(yan)數據(ju)，本(ben)發明不(bu)(bu)僅(jin)開發特異性曲霉(mei)檢測探針而且提出(chu)一種標準的(de)(de)曲霉(mei)菌(jun)(jun)屬鑒別方(fang)法(fa)(fa)。

技術實現思路

1、(一)要解(jie)決的技術問(wen)題

2、鑒于現有技術的上述缺點、不足，本發明提供(gong)一(yi)種曲(qu)霉(mei)菌(jun)屬鑒別(bie)用原(yuan)位分子標(biao)記(ji)探針(zhen)、試劑盒及(ji)曲(qu)霉(mei)菌(jun)屬的鑒別(bie)方法，可快速靈敏(min)、特異性地鑒別(bie)出感染的致病真菌(jun)病原(yuan)體(ti)是否(fou)屬于曲(qu)霉(mei)菌(jun)屬，有利于及(ji)早(zao)確定(ding)準確的抗真菌(jun)治療方案(an)。

3、(二)技術方案

4、第(di)一方面，本發明提(ti)供一種曲霉菌屬(shu)鑒別用原位分子標(biao)記(ji)探針(zhen)，其包括堿基(ji)序(xu)列為(wei)seq?id?no.1或seq?id?no.2的寡(gua)核苷酸(suan)。

5、seq?id?no.1序列(lie)為(wei)atcatagaaacaccgcccgatccctagtc，seq?id?no.2序列(lie)為(wei)ccccgaagggcattggttttttatctaat。所(suo)述seq?id?no.1-2的寡核(he)苷酸是以曲(qu)霉基因(yin)組18srrna的保守(shou)序列(lie)為(wei)靶(ba)基因(yin)進(jin)行設(she)計，能與(yu)靶(ba)基因(yin)雜交(jiao)產(chan)生強信號。

6、根(gen)據(ju)本發明的較(jiao)佳(jia)實(shi)施例，所(suo)(suo)述(shu)曲霉菌屬鑒別用原位(wei)分子標(biao)(biao)(biao)記(ji)探針還包括耦合(he)到所(suo)(suo)述(shu)寡核苷酸上(shang)的標(biao)(biao)(biao)記(ji)物(wu)；所(suo)(suo)述(shu)標(biao)(biao)(biao)記(ji)物(wu)為放射性(xing)標(biao)(biao)(biao)記(ji)物(wu)或非放射性(xing)標(biao)(biao)(biao)記(ji)物(wu)。

7、其中，放(fang)射(she)性標(biao)(biao)記物(wu)(wu)為(wei)32p、35s、3h中至少一(yi)種(zhong)；非放(fang)射(she)性標(biao)(biao)記物(wu)(wu)為(wei)生物(wu)(wu)素(su)、地高辛、熒光素(su)、酶標(biao)(biao)記中的至少一(yi)種(zhong)；前述(shu)標(biao)(biao)記物(wu)(wu)可以(yi)通過末端標(biao)(biao)記、隨機引物(wu)(wu)標(biao)(biao)記、缺口(kou)平移(yi)標(biao)(biao)記或體外轉(zhuan)錄標(biao)(biao)記等(deng)方(fang)法(fa)進行標(biao)(biao)記。

8、根(gen)據本(ben)發明的(de)較佳(jia)實施例(li)，所述標(biao)記物為地高辛，地高辛在(zai)seq?id?no.1或seq?idno.2所示堿基序列的(de)3’-端進行標(biao)記。

9、地高(gao)辛(digoxigenin,dig)作(zuo)探針標(biao)記(ji)物(wu)(wu)具(ju)有(you)如(ru)下優點：①安全性(xing)好、無(wu)放(fang)射性(xing)污(wu)染的(de)(de)(de)(de)風險，對(dui)人體和環境更(geng)(geng)加(jia)安全；②靈敏(min)度(du)較高(gao)：抗地高(gao)辛抗體與(yu)地高(gao)辛結(jie)合的(de)(de)(de)(de)親和力高(gao)，能(neng)夠實(shi)現相當(dang)高(gao)的(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)靈敏(min)度(du)，尤其在(zai)原位(wei)雜交(jiao)(ish)、southern/northern/westernblotting等(deng)實(shi)驗中表現優秀。③易于檢(jian)測(ce)：地高(gao)辛標(biao)記(ji)可(ke)以通過多(duo)種(zhong)檢(jian)測(ce)方法(fa)進行可(ke)視化，如(ru)酶聯反應(如(ru)與(yu)堿性(xing)磷酸酶或辣根(gen)過氧化物(wu)(wu)酶耦聯后，再與(yu)相應的(de)(de)(de)(de)底物(wu)(wu)反應顯(xian)色或發光(guang)(guang))、熒(ying)光(guang)(guang)檢(jian)測(ce)(如(ru)與(yu)熒(ying)光(guang)(guang)素結(jie)合后在(zai)熒(ying)光(guang)(guang)顯(xian)微鏡下觀察)等(deng)，提(ti)供了(le)靈活多(duo)樣的(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)方案(an)。④穩定性(xing)好：地高(gao)辛標(biao)記(ji)物(wu)(wu)相對(dui)穩定，不(bu)易降解，延長(chang)了(le)標(biao)記(ji)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)儲存時間(jian)和使(shi)用(yong)壽(shou)命。⑤成(cheng)本低(di)：與(yu)同位(wei)素標(biao)記(ji)相比，地高(gao)辛標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)(de)成(cheng)本更(geng)(geng)低(di)，使(shi)用(yong)起(qi)來更(geng)(geng)加(jia)便捷，無(wu)需特殊(shu)的(de)(de)(de)(de)安全防(fang)護設施。

10、根據本發明的(de)較佳實施例，所述原位分(fen)子(zi)標記探針能(neng)夠以(yi)細胞、組織切片(pian)、dna/rna樣本等(deng)(deng)作(zuo)為檢測樣本進行檢測鑒別(bie)，并能(neng)特異性(xing)、高靈(ling)敏(min)度地檢測臨床(chuang)常見的(de)多種曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)致病(bing)菌(jun)，包括黑曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(aspergillus?niger)、煙曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(aspergillus?fumigatus)、黃(huang)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(aspergillus?flavus)、土曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(aspergillus?terreus)、構(gou)巢曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)(aspergillusnidulans)、在個(ge)別(bie)病(bing)例中被(bei)報道(dao)為致病(bing)性(xing)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)菌(jun)的(de)其他(ta)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)，如aspergillusversicolor、aspergillus?ustus、aspergillus?glaucus、aspergillus?tubingensis等(deng)(deng)，并能(neng)準確地區分(fen)毛霉(mei)(mei)(mei)菌(jun)和(he)曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)菌(jun)。當曲(qu)(qu)(qu)霉(mei)(mei)(mei)菌(jun)為前述任(ren)一種時(shi)，檢測結果為陽性(xing)。

11、第二方面，本發(fa)明提供一種曲霉菌屬(shu)的(de)鑒別試(shi)劑盒，其包括上述任一實(shi)施例的(de)原位分子標記探針。

12、根據本發明的較佳實施例，所述鑒別試(shi)劑(ji)盒包括：地高辛(xin)標(biao)記的原位分子標(biao)記探(tan)針(zhen)、抗(kang)地高辛(xin)抗(kang)體、dab顯色劑(ji)、蘇木素(su)和返藍液。

13、第三方面(mian)，本(ben)發明提供(gong)一種曲霉菌屬(shu)的鑒別方法(fa)，其采(cai)用上述任一實(shi)施例的原(yuan)位分子標(biao)記探(tan)針進行檢測鑒別。

14、根據本(ben)發明(ming)的較佳實(shi)施例，所述檢測方法包括：

15、s1、以組織石蠟切片為檢測樣本(ben)，依次經烤片、脫蠟、使用梯度(du)濃度(du)減小的乙醇復(fu)水、通透液透化處理、修(xiu)復(fu)處理和純(chun)水洗滌；

16、s2、采用(yong)h2o2阻斷檢測樣(yang)(yang)本(ben)的內源(yuan)性過(guo)氧(yang)化物酶(mei)，采用(yong)溶(rong)菌酶(mei)對檢測樣(yang)(yang)本(ben)的真(zhen)菌細胞壁進(jin)行消化；

17、s3、采用蛋白酶(mei)對檢測樣本的蛋白質進行(xing)消化，之(zhi)后(hou)純(chun)水(shui)(shui)洗滌以(yi)終止消化，并脫水(shui)(shui)；

18、s4、向檢測樣本加地高(gao)辛標記的原位分子標記探(tan)針，在雜(za)交儀中于40-43℃進行雜(za)交2-4h，之后洗(xi)滌，加抗地高(gao)辛抗體(ti)在36.5-37.5℃下孵(fu)育(yu)20-40min，孵(fu)育(yu)結束后洗(xi)滌；

19、s5、在室(shi)溫下進行dab顯色，之后洗滌，采用蘇木素(su)復(fu)染(ran)，返藍(lan)液處理檢測樣本，使用梯度(du)(du)濃度(du)(du)增大的乙醇(chun)脫(tuo)水，封片，在顯微(wei)鏡下的觀(guan)察和分析。

20、其(qi)中(zhong)，s1中(zhong)，通透液透化(hua)處理，主(zhu)要通過化(hua)學(xue)試(shi)劑如(ru)triton?x-100、tween或nonidet?p-40(np-40)等非(fei)離子去垢劑來實(shi)現，這些試(shi)劑能夠破壞(huai)細(xi)胞(bao)膜的(de)(de)脂質雙層結(jie)構，形成臨(lin)時的(de)(de)孔洞，從而(er)(er)使探針(zhen)等能更快地穿透細(xi)胞(bao)膜進入細(xi)胞(bao)內，縮(suo)短探針(zhen)雜交(jiao)時間，提高(gao)后(hou)續檢測的(de)(de)靈敏度和準(zhun)確性(xing)。修(xiu)復處理主(zhu)要采用edta，解除金屬離子與蛋白(bai)質之(zhi)間的(de)(de)交(jiao)聯(lian)作用，從而(er)(er)恢復抗原的(de)(de)原有空間構象和活性(xing)，提高(gao)后(hou)續免疫染色的(de)(de)靈敏度和特異性(xing)。

21、(三)有益效(xiao)果

22、本(ben)發明(ming)以(yi)曲(qu)霉基因(yin)(yin)(yin)組18s?rrna的保守(shou)序列(lie)作為(wei)靶基因(yin)(yin)(yin)，設計了多條可(ke)與(yu)靶基因(yin)(yin)(yin)交聯的曲(qu)霉菌(jun)屬(shu)特異性探(tan)針(zhen)，通過(guo)篩選(xuan)，最終選(xuan)擇堿基序列(lie)為(wei)seq?id?no.1或seq?id?no.2的探(tan)針(zhen)。經(jing)過(guo)序列(lie)比對(dui)，該(gai)探(tan)針(zhen)靶向(xiang)的區段(duan)與(yu)曲(qu)霉菌(jun)屬(shu)內(nei)大部(bu)分真菌(jun)均高(gao)(gao)度(du)同(tong)(tong)(tong)(tong)源，與(yu)毛霉、根霉無(wu)(wu)同(tong)(tong)(tong)(tong)源或者同(tong)(tong)(tong)(tong)源度(du)較低，與(yu)細菌(jun)無(wu)(wu)同(tong)(tong)(tong)(tong)源或低同(tong)(tong)(tong)(tong)源，與(yu)人(ren)類(lei)基因(yin)(yin)(yin)組無(wu)(wu)同(tong)(tong)(tong)(tong)源；因(yin)(yin)(yin)此，使用該(gai)探(tan)針(zhen)鑒別(bie)曲(qu)霉菌(jun)具有高(gao)(gao)特異性，能產生高(gao)(gao)強度(du)雜(za)交信號。

23、目前對于曲(qu)(qu)霉(mei)菌(jun)的(de)原位雜交檢(jian)測(ce)(ce)，尚未(wei)有標準(zhun)(zhun)統一的(de)雜交方法(fa)，也未(wei)見(jian)大(da)規模的(de)實(shi)驗(yan)數據，本發明基于所開(kai)發的(de)曲(qu)(qu)霉(mei)檢(jian)測(ce)(ce)探(tan)針(zhen)提出一種(zhong)標準(zhun)(zhun)的(de)曲(qu)(qu)霉(mei)菌(jun)屬鑒別方法(fa)。其中(zhong)，序列(lie)seq?id?no.1的(de)寡(gua)核苷(gan)酸(suan)探(tan)針(zhen)檢(jian)測(ce)(ce)曲(qu)(qu)霉(mei)菌(jun)的(de)靈(ling)敏(min)(min)度可達(da)95％，并具有高特異性；其次(ci)是(shi)seq?id?no.2寡(gua)核苷(gan)酸(suan)探(tan)針(zhen)，其靈(ling)敏(min)(min)度雖(sui)略低于seq?id?no.1探(tan)針(zhen)，但同樣具有高特異性。它們為侵襲性真(zhen)菌(jun)病確診曲(qu)(qu)霉(mei)菌(jun)屬感(gan)染提供高效(xiao)和(he)可靠的(de)檢(jian)測(ce)(ce)手(shou)段。

24、使(shi)用組(zu)織(zhi)切片(pian)為檢(jian)測樣品時，本發明使(shi)用通透液(非離(li)子去垢劑)對組(zu)織(zhi)樣本進行(xing)室溫透化20min，42℃雜(za)交(jiao)2h便可達到與過夜雜(za)交(jiao)相(xiang)當的(de)效(xiao)(xiao)果，縮短(duan)了(le)雜(za)交(jiao)時間，提高曲(qu)霉菌屬感染的(de)鑒別效(xiao)(xiao)率，為抗真菌治(zhi)療(liao)方案(an)的(de)確(que)定提供更早更快的(de)指導依(yi)據。