本發明涉(she)及(ji)(ji)植(zhi)物基因(yin)工程，具(ju)體涉(she)及(ji)(ji)含黃素單加氧(yang)酶基因(yin)、產物及(ji)(ji)其在蒜氨(an)酸(suan)合成中的應用。

背景技術：

1、大(da)(da)蒜(suan)(allium?sativum?l.)是(shi)一(yi)(yi)種(zhong)重要的蔬(shu)(shu)菜、調(diao)(diao)味品(pin)和(he)藥(yao)用(yong)植物(wu)。蒜(suan)氨酸(suan)是(shi)自然(ran)界中僅存于(yu)大(da)(da)蒜(suan)中的含硫氨基酸(suan)，同(tong)時也是(shi)大(da)(da)蒜(suan)中主要生物(wu)活性(xing)物(wu)質之(zhi)(zhi)一(yi)(yi)。大(da)(da)蒜(suan)作(zuo)為重要的鱗莖類蔬(shu)(shu)菜之(zhi)(zhi)一(yi)(yi)，具(ju)(ju)有(you)(you)(you)辛辣(la)(la)刺(ci)鼻(bi)的味道(dao)，是(shi)一(yi)(yi)種(zhong)常見的香料(liao)和(he)食(shi)品(pin)添(tian)加劑(ji)。含硫化(hua)合物(wu)，如大(da)(da)蒜(suan)素及其代(dai)謝產物(wu)，是(shi)大(da)(da)蒜(suan)辛辣(la)(la)效果和(he)辛辣(la)(la)氣味主要原因(yin)。傳(chuan)統上，大(da)(da)蒜(suan)及其相關化(hua)合物(wu)被(bei)認(ren)為具(ju)(ju)有(you)(you)(you)多種(zhong)生物(wu)活性(xing)，包括抗(kang)(kang)癌、抗(kang)(kang)氧化(hua)劑(ji)、抗(kang)(kang)糖尿(niao)病、腎臟(zang)保護(hu)、抗(kang)(kang)真菌和(he)抗(kang)(kang)高血壓(ya)活性(xing)。此(ci)外，大(da)(da)蒜(suan)還被(bei)用(yong)于(yu)傳(chuan)統醫(yi)學中，用(yong)于(yu)治療消化(hua)不良、呼吸道(dao)和(he)尿(niao)路感染以(yi)及心臟(zang)疾病，它(ta)具(ju)(ju)有(you)(you)(you)驅蟲、解(jie)熱、鎮(zhen)靜和(he)利尿(niao)的作(zuo)用(yong)。雖然(ran)蒜(suan)氨酸(suan)有(you)(you)(you)獨特的營(ying)養和(he)藥(yao)用(yong)價值，但至(zhi)今(jin)關于(yu)蒜(suan)氨酸(suan)生物(wu)合成的分子(zi)調(diao)(diao)控途徑仍不明確，因(yin)此(ci)研究蒜(suan)氨酸(suan)生物(wu)合成分子(zi)調(diao)(diao)控機制至(zhi)關重要。

2、s-烯丙(bing)(bing)基(ji)半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)被大蒜(suan)(suan)提取物(wu)立體特異(yi)性氧(yang)化(hua)為(wei)(+)-s-烯丙(bing)(bing)基(ji)-l-半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)亞(ya)砜，表(biao)明在大蒜(suan)(suan)中(zhong)存在能(neng)催化(hua)(+)-s-烯丙(bing)(bing)基(ji)-l-半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)亞(ya)砜合(he)成的(de)(de)氧(yang)化(hua)酶(mei)。在文章“identification?of?a?flavin-containing?s-oxygenating?monooxygenase?involvedin?alliin?biosynthesis?in?garlic”中(zhong)，yoshimoto等人首次基(ji)于est在fukuchi-howaito(日本北海道(dao)的(de)(de)大蒜(suan)(suan)品種(zhong))中(zhong)發現一個編碼含黃素單加氧(yang)酶(mei)(flavin-containingmonooxygenase，fmo)的(de)(de)基(ji)因，將其(qi)命名為(wei)asfmo1(ncbi?no.ab924383.1)，通(tong)過酵(jiao)母(mu)異(yi)源表(biao)達表(biao)明asfmo1在體外(wai)參與蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)合(he)成。asfmo1與b類黃素單加氧(yang)酶(mei)一致，具有nadp、fad和fmo保守基(ji)序，其(qi)催化(hua)的(de)(de)s-氧(yang)化(hua)反應依賴于nadph和fad的(de)(de)存在。asfmo1作為(wei)s-烯丙(bing)(bing)基(ji)-1-半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)-s-加氧(yang)酶(mei)(s-allyl-1-cysteine-s-oxygenase)起作用(yong)，可能(neng)在發芽期間將儲存的(de)(de)γ-谷(gu)氨(an)(an)酰-s-烯丙(bing)(bing)基(ji)-l-半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)轉化(hua)為(wei)蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)或在葉片中(zhong)從頭合(he)成蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)，但尚未(wei)發現asfmo1調控大蒜(suan)(suan)蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)生物(wu)合(he)成過程的(de)(de)功(gong)能(neng)報(bao)道(dao)，其(qi)分子(zi)調控機理及應用(yong)仍不明確。

技術實現思路

1、針對(dui)上(shang)述現有技(ji)術，本發(fa)明的(de)目的(de)是提供(gong)含黃素單加(jia)氧酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)、產物(wu)及其在蒜(suan)(suan)(suan)氨(an)(an)酸合(he)成中(zhong)的(de)應(ying)用(yong)。本發(fa)明針對(dui)現有技(ji)術的(de)進(jin)展，結合(he)長期研究(jiu)和探索(suo)，從“金(jin)鄉四(si)六(liu)瓣”中(zhong)篩選了(le)多(duo)個(ge)蒜(suan)(suan)(suan)氨(an)(an)酸生(sheng)物(wu)合(he)成中(zhong)的(de)含黃素單加(jia)氧酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5(seq?id?no.1～5)，并(bing)從中(zhong)鑒定出兩個(ge)特別優異的(de)基(ji)(ji)因(yin)asfmo1和asfmo2(seq?idno.1～2)。本研究(jiu)進(jin)一步揭示了(le)大(da)(da)蒜(suan)(suan)(suan)蒜(suan)(suan)(suan)氨(an)(an)酸生(sheng)物(wu)合(he)成基(ji)(ji)因(yin)，并(bing)利用(yong)大(da)(da)蒜(suan)(suan)(suan)遺傳轉(zhuan)(zhuan)化方法獲(huo)得高蒜(suan)(suan)(suan)氨(an)(an)酸含量(liang)和低(di)含量(liang)蒜(suan)(suan)(suan)氨(an)(an)酸的(de)轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)大(da)(da)蒜(suan)(suan)(suan)，為大(da)(da)蒜(suan)(suan)(suan)分子育種(zhong)工作做出了(le)貢獻，具有實際應(ying)用(yong)價值。

2、為(wei)實現上述目的，本發明采用(yong)如下技(ji)術(shu)方案：

3、本發明的第一方面，提供含黃素(su)單加氧(yang)酶(mei)基(ji)因，所(suo)述含黃素(su)單加氧(yang)酶(mei)基(ji)因的核苷酸(suan)序列如seqid?no.1～seq?id?no.5任(ren)一項(xiang)所(suo)示。

4、本發明的(de)第二方(fang)面，提供(gong)所述含黃素單加氧酶基因在調(diao)控大蒜蒜氨酸合成中的(de)應用。

5、本發明的第(di)三方面，提(ti)供含(han)黃素單加(jia)氧酶基因(yin)編碼的蛋白(bai)，所(suo)述含(han)黃素單加(jia)氧酶基因(yin)編碼的蛋白(bai)的氨基酸序列如(ru)seq?id?no.50～seq?id?no.54任(ren)一項所(suo)示。

6、本(ben)發(fa)明的第四方面，提供所(suo)述(shu)含(han)黃(huang)素(su)單加(jia)氧酶(mei)基因(yin)編碼的蛋白在調控大蒜蒜氨(an)酸合成中(zhong)的應用。

7、本發明的(de)(de)第(di)五方面，提(ti)供一種含有(you)所述(shu)的(de)(de)含黃素(su)單(dan)加氧酶基因的(de)(de)表達盒。

8、本發明的第六方(fang)面，提供一(yi)種含(han)有所述的含(han)黃(huang)素單加(jia)氧酶基(ji)因的重組表(biao)達載體。

9、本發明的(de)(de)第七(qi)方面，提供(gong)一種含(han)有所述的(de)(de)含(han)黃(huang)素單加氧酶(mei)基因的(de)(de)重(zhong)組(zu)菌(jun)。

10、本發(fa)明(ming)的第八方面，提供所述(shu)的表達盒、所述(shu)的重(zhong)組(zu)表達載體或所述(shu)的重(zhong)組(zu)菌在調控大蒜蒜氨(an)酸合成中的應用。

11、本發(fa)明的第(di)九方(fang)面，提供一(yi)種調控植(zhi)物蒜氨酸合(he)成的方(fang)法，包(bao)括(kuo)：

12、促(cu)進目(mu)的植(zhi)(zhi)物中(zhong)含黃(huang)素單(dan)加(jia)氧酶基因表(biao)達，獲得蒜氨酸含量高于目(mu)的植(zhi)(zhi)物的植(zhi)(zhi)株；

13、或者，將目(mu)的(de)(de)植物中的(de)(de)含(han)黃素單加氧(yang)酶基因(yin)沉默(mo)或敲(qiao)除，獲得蒜(suan)氨酸含(han)量低于目(mu)的(de)(de)植物的(de)(de)植株；

14、所(suo)述含黃素單加氧(yang)酶基因通過表(biao)達載體轉入到目的植(zhi)物中；

15、所(suo)述含黃(huang)素(su)單加氧(yang)酶(mei)基因(yin)為如下(xia)i)～ii)任一項所(suo)示(shi)的核酸分子：

16、i)核(he)苷(gan)酸(suan)序列是seq?id?no.1～seq?id?no.5任一(yi)項所示的(de)核(he)酸(suan)分子(zi)；

17、ii)除i)以外(wai)的編碼seq?id?no.50～seq?id?no.54任一項所示氨基酸序列(lie)的核酸分子。

18、本(ben)發(fa)明的(de)第十方面(mian)，提供(gong)所(suo)述調(diao)控(kong)植(zhi)物蒜氨酸(suan)含量的(de)方法(fa)在(zai)植(zhi)物育(yu)種中(zhong)的(de)應用，所(suo)述植(zhi)物為大蒜。

19、本研(yan)究(jiu)所(suo)(suo)(suo)用的(de)(de)大(da)蒜(suan)(suan)參(can)考基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)來源為(wei)二(er)水早(ncbigeo：gse145455)，以asfmo1(ncbino.ab924383.1)為(wei)參(can)考序(xu)列在全基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)范圍內鑒定(ding)asfmo基(ji)因(yin)(yin)(yin)。為(wei)鑒定(ding)大(da)蒜(suan)(suan)fmo基(ji)因(yin)(yin)(yin)家族所(suo)(suo)(suo)有(you)(you)(you)成員，首先(xian)根(gen)據大(da)蒜(suan)(suan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)注釋進(jin)(jin)行(xing)(xing)初(chu)步篩選(xuan)，之后(hou)將初(chu)篩候選(xuan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)提交至蛋白(bai)質結(jie)構域(yu)(yu)(yu)預(yu)測網(wang)站pfam進(jin)(jin)行(xing)(xing)蛋白(bai)結(jie)構域(yu)(yu)(yu)的(de)(de)預(yu)測，然后(hou)利用在線(xian)網(wang)站interpro、smart進(jin)(jin)一步驗證，最后(hou)在大(da)蒜(suan)(suan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)中鑒定(ding)得到fmo成員，最終確定(ding)為(wei)asfmo。b類(lei)黃素單加(jia)(jia)氧(yang)酶具(ju)有(you)(you)(you)典型的(de)(de)fad和nad(p)h兩(liang)個二(er)核(he)苷酸結(jie)合結(jie)構域(yu)(yu)(yu)，在b類(lei)黃素單加(jia)(jia)氧(yang)酶參(can)與的(de)(de)催化(hua)過程中始終與nadp+的(de)(de)結(jie)合，研(yan)究(jiu)表明與nadp+的(de)(de)結(jie)合可(ke)能具(ju)有(you)(you)(you)穩定(ding)黃素過氧(yang)化(hua)物(wu)中間體的(de)(de)作用。b類(lei)黃素單加(jia)(jia)氧(yang)酶可(ke)以將底物(wu)分子上(shang)的(de)(de)碳(tan)原子、硫原子和其(qi)他(雜)原子進(jin)(jin)行(xing)(xing)氧(yang)化(hua)，所(suo)(suo)(suo)以它(ta)也被(bei)叫做多功能含黃素的(de)(de)單加(jia)(jia)氧(yang)酶，它(ta)所(suo)(suo)(suo)參(can)與的(de)(de)氧(yang)化(hua)反應具(ju)有(you)(you)(you)立體、化(hua)學(xue)和區域(yu)(yu)(yu)特異(yi)性高的(de)(de)特征(zheng)。

20、發明人(ren)基(ji)(ji)(ji)于植物fmos中(zhong)典型的(de)fad和(he)(he)(he)(he)(he)nad(p)h兩(liang)個二核苷(gan)酸(suan)結合結構域(yu)，最終鑒定(ding)到5個fmos成(cheng)員(yuan)(asa3g05097.1、asa4g04959.1、asa4g04963.1、asa5g05156.1、asa6g04803.1)，asa3g05097.1比ncbi?no.ab924383.1編碼蛋白(bai)的(de)n端少11個氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)，分(fen)別命名(ming)為asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和(he)(he)(he)(he)(he)asfmo5(asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和(he)(he)(he)(he)(he)asfmo5基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)分(fen)別為seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4和(he)(he)(he)(he)(he)seq?idno.5，asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和(he)(he)(he)(he)(he)asfmo5基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)編碼的(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)分(fen)別為seq?idno.50、seq?id?no.51、seq?id?no.52、seq?id?no.53和(he)(he)(he)(he)(he)seq?id?no.54，具(ju)體見核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)表)具(ju)體見核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)表)。此(ci)外，fmos成(cheng)員(yuan)均存在(zai)四(si)個保守基(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(fad-binding、nadp-binding、tgy和(he)(he)(he)(he)(he)fmo-identifying)。進一步序(xu)(xu)列(lie)比對發現(xian)5個fmos成(cheng)員(yuan)均含有fad-binding、nadp-binding、tgy和(he)(he)(he)(he)(he)fmo-identifying特征序(xu)(xu)列(lie)，與(yu)b類(lei)黃素單加氧酶的(de)四(si)個保守基(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)一致，其中(zhong)fad結合基(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)和(he)(he)(he)(he)(he)tgy基(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)的(de)保守性極高。此(ci)外asfmo1蛋白(bai)在(zai)氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)155-160位置相比于其他4個成(cheng)員(yuan)多(duo)一個nadp結合基(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(gggeeg)。簡要過程如(ru)下：

21、1.asfmo1和asfmo2基因過(guo)表達載(zai)體的構建(jian)

22、為(wei)了鑒定asfmo1和asfmo2在蒜氨酸(suan)生物合成中起關鍵作(zuo)(zuo)用。利用金鄉四(si)六瓣的rna反轉錄的cdna作(zuo)(zuo)為(wei)模板(ban)，

23、asfmo1引物對(dui)：

24、正向引物-1(seq?id?no.6)：5′-cggatccgatggtttcctcatct-3′；

25、反向引物(wu)-1(seq?id?no.7)：5′-cccgggtgaaagaaatttgctgaa-3′；

26、asfmo2引物對：

27、正向引物-2(seq?id?no.8)：5v-cgggatccatggtctctgaatatatcaactcc-3′；

28、反向引物-2(seq?id?no.9)：5′-tcccccgggtattttaataacatctggatctagctg

29、-3′；

30、進行pcr擴增出(chu)1300bp左右的條帶，經(jing)測序(xu)長(chang)度分(fen)別為1374bp和(he)1371bp，獲得asfmo1基(ji)因(yin)和(he)的asfmo2基(ji)因(yin)的cds序(xu)列(lie)。

31、將擴增(zeng)后(hou)的目的條(tiao)帶膠(jiao)回收后(hou)，利用t4連接(jie)酶與(yu)雙酶切(qie)后(hou)的pcombia3300-egfp載體相連，轉(zhuan)化大腸(chang)桿菌，篩選(xuan)陽性克隆進行菌液pcr并(bing)測序。

32、2.asfmo1和asfmo2基因crispr/cas9的構建

33、利(li)用(yong)在線網站(zhan)ssc預(yu)測合適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)高分(fen)靶點(dian)，并對靶點(dian)序(xu)(xu)列(lie)進(jin)行(xing)比對，選(xuan)(xuan)擇特異性好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶點(dian)。按此原則，最終在asfmo1和asfmo2基因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)編碼區上(shang)各選(xuan)(xuan)擇了2個靶點(dian)，asfmo1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶點(dian)1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)為(wei)(wei)5′-tttgtggagaaaacgaacgg-3′(seq?id?no.10)，靶點(dian)2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)為(wei)(wei)5′-tggaagggaaaagatggagg-3′(seq?id?no.11)；asfmo2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶點(dian)1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)為(wei)(wei)5′-aattctccgagggagatcat-3″(seq?id?no.12)，靶點(dian)2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)為(wei)(wei)5′-tgtaggcatgacgaatacca-3′(seq?id?no.13)。載(zai)(zai)體(ti)構建過程中包(bao)含兩個反應(ying)：第(di)一個反應(ying)是以(yi)sv-cas9載(zai)(zai)體(ti)(crispr/cas9載(zai)(zai)體(ti))為(wei)(wei)模(mo)(mo)板，用(yong)含靶點(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)引物(wu)進(jin)行(xing)擴增；第(di)二(er)個反應(ying)是以(yi)第(di)一步(bu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)擴增產物(wu)為(wei)(wei)模(mo)(mo)板進(jin)行(xing)擴增，隨后純(chun)化pcr產物(wu)，利(li)用(yong)無縫克隆(long)技術與單酶切的(de)(de)(de)(de)(de)(de)sv-cas9載(zai)(zai)體(ti)進(jin)行(xing)連(lian)接，轉化大腸(chang)桿菌。經菌液pcr的(de)(de)(de)(de)(de)(de)初(chu)步(bu)篩選(xuan)(xuan)，得到多個陽性克隆(long)，將(jiang)測序(xu)(xu)結(jie)果利(li)用(yong)dnaman進(jin)行(xing)比對，確認正(zheng)(zheng)確的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單克隆(long)，獲得含有正(zheng)(zheng)確靶點(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)sv-cas9載(zai)(zai)體(ti)。

34、3.轉基(ji)因株系的獲得(de)

35、獲(huo)得(de)上述的(de)目標載體(ti)后，選擇大(da)(da)蒜(suan)根尖誘導的(de)胚(pei)(pei)性愈(yu)傷組(zu)織(zhi)為(wei)受體(ti)材料，用(yong)農(nong)桿菌(jun)介導法將重(zhong)組(zu)質粒sv-cas9-asfmo1-bar、sv-cas9-asfmo2-bar和(he)(he)pcombia3300-asfmo1-egfp、pcombia3300-asfmo2-egfp轉(zhuan)(zhuan)入(ru)到大(da)(da)蒜(suan)中。將分別(bie)(bie)含有重(zhong)組(zu)質粒sv-cas9-asfmo1-bar、sv-cas9-asfmo2-bar和(he)(he)pcombia3300-asfmo1-egfp、pcombia3300-asfmo2-egfp的(de)lba4404農(nong)桿菌(jun)活化后；利用(yong)侵染(ran)液(ye)侵染(ran)繼代(dai)次(ci)數少(shao)于2次(ci)的(de)胚(pei)(pei)性愈(yu)傷組(zu)織(zhi)，獲(huo)得(de)了asfmo1和(he)(he)asfmo2轉(zhuan)(zhuan)基因(yin)(yin)過表(biao)達(da)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)和(he)(he)轉(zhuan)(zhuan)基因(yin)(yin)敲除株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)。提取轉(zhuan)(zhuan)化后植(zhi)(zhi)株(zhu)(zhu)(zhu)與未轉(zhuan)(zhuan)化植(zhi)(zhi)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)基因(yin)(yin)組(zu)，分別(bie)(bie)以(yi)重(zhong)組(zu)質粒sv-cas9-asfmo1-bar、sv-cas9-asfmo2-bar和(he)(he)pcombia3300-asfmo1-egfp、pcombia3300-asfmo2-egfp為(wei)陽(yang)性對(dui)照，以(yi)未轉(zhuan)(zhuan)化的(de)大(da)(da)蒜(suan)葉片基因(yin)(yin)組(zu)為(wei)陰性對(dui)照，以(yi)水為(wei)空白對(dui)照，通(tong)過使(shi)用(yong)特(te)異性引物分別(bie)(bie)對(dui)其進行pcr檢測，分別(bie)(bie)獲(huo)得(de)5株(zhu)(zhu)(zhu)to代(dai)植(zhi)(zhi)株(zhu)(zhu)(zhu)。敲除突變體(ti)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)通(tong)過pcr擴增(zeng)除草(cao)劑(ji)基因(yin)(yin)bar片段表(biao)明外源基因(yin)(yin)已整合(he)到基因(yin)(yin)組(zu)，目的(de)片段發(fa)生基因(yin)(yin)編輯時間，asfmo1突變體(ti)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)按順序(xu)依次(ci)命(ming)名(ming)為(wei)asfmol-1和(he)(he)asfmol-2；asfmo2的(de)突變體(ti)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)依次(ci)命(ming)名(ming)為(wei)asfmo2-1和(he)(he)asfmo2-2。過表(biao)達(da)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)通(tong)過pcr擴增(zeng)egfp基因(yin)(yin)表(biao)明外源基因(yin)(yin)已整合(he)到基因(yin)(yin)組(zu)，asfmo1轉(zhuan)(zhuan)基因(yin)(yin)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)按順序(xu)依次(ci)命(ming)名(ming)為(wei)oe-1、oe-2和(he)(he)oe-3；asfmo2轉(zhuan)(zhuan)基因(yin)(yin)株(zhu)(zhu)(zhu)系(xi)(xi)(xi)按順序(xu)依次(ci)命(ming)名(ming)為(wei)oe-4、oe-5和(he)(he)oe-6。

36、取(qu)t0代轉基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)株(zhu)系(xi)(xi)(xi)與(yu)未(wei)轉化植株(zhu)的(de)幼(you)嫩(nen)的(de)葉(xie)提取(qu)rna并反轉錄，通過(guo)(guo)熒光(guang)定量pcr檢測asfmo1基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)和asfmo2基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)量。在(zai)asfmo1和asfmo2基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)量方(fang)面，與(yu)未(wei)轉化植株(zhu)相(xiang)比，asfmol-1、asfmol-2突變體株(zhu)系(xi)(xi)(xi)asfmo1基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)明顯(xian)下調(diao)，asfmo2-1和asfmo2-2突變體株(zhu)系(xi)(xi)(xi)asfmo2基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)明顯(xian)下調(diao)，asfmo1過(guo)(guo)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)株(zhu)系(xi)(xi)(xi)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)上調(diao)3倍，asfmo2過(guo)(guo)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)株(zhu)系(xi)(xi)(xi)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)上調(diao)2.5倍。在(zai)蒜氨(an)酸含(han)量方(fang)面，與(yu)未(wei)轉化的(de)植株(zhu)相(xiang)比，asfmo1過(guo)(guo)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)株(zhu)系(xi)(xi)(xi)提高了(le)82％，突變體株(zhu)系(xi)(xi)(xi)下降(jiang)了(le)37％；asfmo2過(guo)(guo)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)株(zhu)系(xi)(xi)(xi)提高了(le)50％，突變體株(zhu)系(xi)(xi)(xi)下降(jiang)了(le)27％。

37、根據(ju)最終測定(ding)蒜(suan)氨酸(suan)含量(liang)，結合(he)(he)asfmos基(ji)因(yin)(yin)(yin)家族的(de)(de)生物(wu)信(xin)息學分析(xi)和(he)表(biao)達特征(zheng)分析(xi)，蒜(suan)氨酸(suan)生物(wu)合(he)(he)成中的(de)(de)含黃素單加氧酶為asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和(he)asfmo5。由于asfmo1和(he)asfmo2蛋白結構極其相似，并且(qie)均在(zai)鱗莖膨大期(qi)的(de)(de)葉片(pian)中表(biao)達量(liang)最高，因(yin)(yin)(yin)此asfmo1和(he)asfmo2是蒜(suan)氨酸(suan)合(he)(he)成的(de)(de)關鍵基(ji)因(yin)(yin)(yin)。

38、本發明的有益(yi)效果：

39、本(ben)發明根(gen)據二水(shui)早(zao)大蒜(suan)(suan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組注(zhu)釋信息初步(bu)篩選出49條fmos候選序列(lie)，基(ji)(ji)于植物fmos中(zhong)典型的(de)fad和(he)nad(p)h兩個二核(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)結合(he)結構域，最終(zhong)鑒定到5個fmos成(cheng)員：asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和(he)asfmo5(seq?id?no.1～5)，并從中(zhong)鑒定出兩個特別優(you)異(yi)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)asfmo1和(he)asfmo2(seq?id?no.1～2)。本(ben)研究揭示了(le)大蒜(suan)(suan)蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)生物合(he)成(cheng)關鍵基(ji)(ji)因(yin)(yin)，并利用大蒜(suan)(suan)遺傳轉(zhuan)化方法(fa)獲(huo)得高蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)含量(liang)和(he)低蒜(suan)(suan)氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)含量(liang)的(de)轉(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)大蒜(suan)(suan)，為大蒜(suan)(suan)育種工(gong)作(zuo)做出了(le)貢(gong)獻(xian)，具有實際應用價值。