組織蛋白酶S因其在蛋白水解消化不變鏈蛋白伴侶分子，從而控制抗原通過主要組織相容性復合體(MHC)II類分子呈遞給CD4+T細胞或通過CD1分子呈遞給NK1.1+T細胞中的重要功能而聞名。組織蛋白酶S似乎還參與通過MHCII類呈遞給CD4+T細胞的外源抗原的直接加工，或參與通過MHCI類分子交叉呈遞給CD8+T細胞。此外，組織蛋白酶S以其分泌形式涉及胞外基質降解，這可促成許多疾病的病理，包括關節炎、動脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺疾病。因此，對于開發用于多種適應癥的新治療劑，組織蛋白酶S的抑制是有前景的靶標。MHCII類分子結合并展示抗原肽，作為抗原呈遞細胞(APC)的細胞表面上的由CD4+輔助細胞識別的II類-肽復合體。導致形成II類-肽復合體并在細胞表面呈遞抗原的分子機制始于內質網中的II類αβ異二聚體合成。在生物合成期間，這些αβ異二聚體與II型膜蛋白(不變鏈li的同種型)結合，形成αβli的九聚復合體。αβli復合體穿過高爾基體，遞送至胞內區室。在這些酸性區室中，li被降解，并最終從αβli復合體釋放，允許II類分子結合抗原肽。li的蛋白水解加工產生更短的片段。在APC中，半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶S在加工li中發揮關鍵作用。組織蛋白酶S降解來自II類-li復合體的的不變鏈li，產生II類-CLIP。因此，組織蛋白酶S的抑制導致CLIP肽減少，前體片段(即不變鏈li降解肽p10(lip10))累積。EP1315966公開了用于監測體內施用組織蛋白酶S抑制劑的作用的方法。該方法包括從用組織蛋白酶S抑制劑處理的個體的血樣純化白細胞，制備所純化的白細胞的全細胞裂解物，并針對不變鏈li的lip10片段的存在分析全細胞裂解物。此方法需要約10-30ml血樣，且耗費勞力(分離白細胞和制備全細胞裂解物)。lip10的檢測通過ELISA或Western印跡進行。本發明的目的是提供監測組織蛋白酶S抑制的測定，該測定克服現有技術方法的至少一些缺點。在第一目的中，本發明提供用于監測動物組織樣品中的組織蛋白酶S抑制劑活性的方法，其包括：a)提供已對其施用組織蛋白酶S抑制劑的動物的組織樣品，或提供在體外與組織蛋白酶S抑制劑接觸過的動物組織樣品，其中組織樣品包含白細胞；b)通過流式細胞術測量步驟a)的組織樣品的白細胞中的lip10肽水平；和c)使白細胞中的lip10肽水平與組織蛋白酶S抑制劑劑量關聯，其中組織蛋白酶S抑制劑導致白細胞中lip10肽水平提高。在第二目的中，本發明提供用于鑒定組織蛋白酶S抑制劑的方法，其包括：a)用測試化合物處理非人動物；b)提供步驟a)的動物的包含白細胞的組織樣品；c)測量步驟b)的組織樣品的白細胞中的lip10肽水平；其中與未經處理的動物的組織樣品中的白細胞中lip10肽的水平相比，步驟a)的樣品中的白細胞中lip10肽水平的提高指示組織蛋白酶S抑制劑。在本發明方法的優選實施方案中，該組織樣品是血液。在本發明方法的另一優選實施方案中，該白細胞是抗原呈遞細胞(APC)，優選地，該APC選自B細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞，更優選選自B細胞和單核細胞。本文所用的術語抗原呈遞細胞(APC)指將抗原肽作為(MHC)II類-抗原肽復合體展示在其表面的細胞。APC包括樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞和B細胞。在第三目的中，本發明提供抗lip10抗體，其包含：包含含有氨基酸序列Seq.Id.No.4的CDR1、含有氨基酸序列Seq.Id.No.5的CDR2、含有氨基酸序列Seq.Id.No.6的CDR3的VH結構域，及包含含有氨基酸序列Seq.Id.No.7的CDR1、含有氨基酸序列Seq.Id.No.8的CDR2、含有氨基酸序列Seq.Id.No.9的CDR3的VL結構域。在本發明的具體實施方案中，抗lip10抗體的VH結構域包含氨基酸序列Seq.Id.No.10，抗lip10抗體的VL結構域包含氨基酸序列Seq.Id.No.11.本發明的抗li-p10特異性抗體在本文中稱為源自家兔(Oryctologouscuniculus)的7B8新表位抗體。此抗體的特征在于Seq.Id.No.4-11中所公開的CDR和VH、VL序列。術語組織蛋白酶S指木瓜蛋白酶超家族中的半胱氨酸蛋白酶。人組織蛋白酶S的氨基酸序列在Seq.Id.No.1中提供。術語“不變鏈li”指主要組織相容性復合體或CD74的不變多肽。人不變鏈li的氨基酸序列在Seq.Id.No.2中提供。術語lip10肽指II類結合li肽。人lip10的氨基酸序列在Seq.Id.No.3中提供。本文所用的術語“MHCII多肽”指組成MHCII復合體的α鏈和β鏈。本文所用的術語動物包括人類和非人動物，如猴、狗、豬、兔、豚鼠和嚙齒動物。本文在與本發明的測定結合描述的“測試化合物”或“候選藥物化合物”的背景中使用術語“化合物”。因此，這些化合物包括合成來源或來自自然來源的有機或無機化合物。化合物包括無機或有機化合物，如多核苷酸、脂質或表征為相對低的分子量的激素類似物。其他生物聚合有機測試化合物包括含有約2至約40個氨基酸的肽和含有約40至約500個氨基酸的更大的多肽，如抗體或抗體綴合物。本發明的發明人驚奇地發現，可以在白細胞中檢測lip10肽。與現有技術中所述的方法相比，本發明的方法具有可以直接測定組織樣品(優選血液)而不涉及分離白細胞的優勢。在本發明的方法中，無需為了能夠在本發明的方法中處理而從全血樣品分離例如白細胞。如果在必須處理大量樣品的臨床環境中使用，則這具有重要意義。本發明的方法需要比現有技術方法小的組織樣品，優選血樣。用于檢測和/或測量生物樣品中的多肽的方法為本領域公知，包括但不限于Western印跡、流式細胞術、ELISA或RIA、或多種蛋白質組學技術。可以為了檢測多肽或肽片段的目的而例如通過用純化的蛋白質免疫兔來產生識別lip10肽或其片段的單克隆或多克隆抗體，或者可以使用識別多肽或肽片段的已知抗體。例如，在Western印跡中，可以用能夠結合變性蛋白質的抗體(如多克隆抗體)來檢測LIP10肽或MHCII多肽。ELISA是測量多肽的方法的實例。此類蛋白質定量基于能夠捕獲特異性抗原的抗體和能夠檢測所捕獲的抗原的第二抗體。用于制備和使用抗體的方法及上文提到的測定描述于Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,(1988),ColdSpringHarborLaboratoryPress中。用于檢測lip10肽的優選方法是流式細胞術。流式細胞術方法描述于HandbookofFlowCytometryMethod,J.PaulRobinson(編輯)；FlowCytometry-ABasicIntroduction,MichaelGOrmerod(2008)和CurrentProtocolsinCytometry(2010),Wiley中。在此方法中，蛋白質不變性，而是保持其天然形式。WO2010/121918公開了可在本發明的方法中測試的組織蛋白酶S抑制劑。附圖簡述圖1：用新表位抗體檢測B細胞和T細胞上的Iip10表達。用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑1或溶媒(vehicle)孵育從健康供體(R213)的獻血分離的PBMC20小時。用不同的新表位抗體7B8(黑色)通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)和T細胞(CD3+)上的Iip10檢測。圖2：用新表位抗體檢測B細胞上的Iip10表達。用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑1或溶媒孵育從健康供體(R172)的獻血分離的PBMC20小時。用兩種不同的新表位抗體(即7B8(黑色)和13C4(灰色))通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)和T細胞(CD3+)上的Iip10檢測。染色指數＝平均熒光強度(MFI)B細胞/MFIT細胞。圖3A：用組織蛋白酶S抑制劑處理時Iip10累積在B細胞中。用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑1或溶媒孵育從11個健康供體(R39、R185、R198、R204、R209、R140、R154、R175、R213、R4、R214)的獻血分離的PBMC20小時。用7B8新表位抗體通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)和T細胞(CD3+)上的Iip10檢測。染色指數＝MFIB細胞/MFIT細胞。圖3B：用組織蛋白酶S抑制劑處理時Iip10累積在B細胞中。用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑2或溶媒孵育從11個健康供體(R39、R185、R198、R204、R209、R140、R154、R175、R213、R4、R214)的獻血分離的PBMC20小時。用7B8新表位抗體通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)和T細胞(CD3+)上的Iip10檢測。染色指數＝MFIB細胞/MFIT細胞。圖4：組織蛋白酶S抑制劑IC50濃度。用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑1、組織蛋白酶S抑制劑2或溶媒孵育從11個健康供體(R39、R185、R198、R204、R209、R140、R154、R175、R213、R4、R214)的獻血分離的PBMC20小時。用7B8新表位抗體通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)和T細胞(CD3+)上的Iip10檢測。用GraphPadPrism軟件計算反應曲線和IC50值。圖5A-F：Iip10新表位測定縱向變異性。在兩個時間點從11個健康供體(R198、R209、R154、R213、R214)的獻血分離PBMC，并用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑1或溶媒孵育20小時。用7B8新表位抗體通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)和T細胞(CD3+)上的Iip10檢測。圖6A：通過新表位測定檢測B細胞中的Iip10累積。用7B8新表位抗體克隆通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)上的Iip10檢測。用遞增濃度的組織蛋白酶S抑制劑1或溶媒孵育從3份食蟹猴(Macacafascicularis)獻血分離的PBMC20小時。通過用B細胞的平均熒光強度(MFI)除以前向散射低CD20陰性(FSCloCD20-)細胞的MFI來測定食蟹猴樣品的p10染色指數。圖6B：組織蛋白酶S抑制劑單個口服劑量后通過新表位測定檢測B細胞中的Iip10累積。用7B8新表位抗體克隆通過流式細胞術測定B細胞(CD20+)上的Iip10檢測。50mg/kg的單個劑量后2小時和7小時從動物采血。在全血中進行Iip10新表位測定。通過用B細胞的平均熒光強度(MFI)除以前向散射低CD20陰性(FSCloCD20-)細胞的MFI來測定食蟹猴樣品的p10染色指數。圖7A-7D：從參與評價單劑量組織蛋白酶抑制劑1在健康男性和女性志愿者中的安全性、耐受性、藥代和藥效作用的單中心、隨機化、雙盲、安慰劑對照、單遞增劑量研究的個體獲得的樣品上的p10定量。為了解釋和限制臨床前試驗中觀察到的預期的個體間變異的影響，利用了交錯群組(“跳蛙”)設計。招募個體進入各八名個體的兩個群組(群組A和B)。對于群組內的每個個體，研究為隨機、安慰劑對照、四次治療、四個時期、四因素交叉。圖7A至7D(群組A)和圖8A至8D(群組B)上各顯示時間點0小時后立即應用的單劑量。圖8A-8D：群組B數據，參見圖7描述。實驗部分組織蛋白酶S抑制劑體外測定使用無菌聚苯乙烯24孔板加入500μl完全RPMI+遞增濃度(0至10μM)的組織蛋白酶S抑制劑向每個孔加入500μlPBMC懸液(2x106)混合孔中內容物，在濕潤培養箱中37℃、5％CO2孵育平板20小時FACS染色配制1x裂解/固定溶液每2x106PBMC或200μl血液加入4mL預熱的1x裂解/固定溶液37℃孵育10分鐘，用PBS洗滌細胞1x(250xg，5分鐘，RT)，棄上清每管加入2mL1x透化溶液RT孵育20分鐘用2mlCellStainBuffer(250xg，5分鐘，RT)洗滌細胞2x，棄上清在CellStainingBuffer中加入10μg/mL未標記的抗p10抗體，RT，1小時用2mlCellStainBuffer(250xg，5分鐘，RT)洗滌細胞1x，棄上清在CellStaining中加入1:125PE綴合山羊抗兔IgG抗體，RT避光，30分鐘用2mlCellStainBuffer(250xg，5分鐘，RT)洗滌細胞2x，棄上清向每個管中加入抗體(競爭抗體)或抗體混合物(稀釋于100μl/樣品CellStainBuffer)+4℃避光孵育20分鐘用2mlCellStainBuffer(250xg，5分鐘，RT)洗滌細胞1x，棄上清重懸沉淀在200μlCellStainBuffer中，保持細胞避光，直至在FACS上分析抗體：材料和緩沖液24孔板，BD，訂購ID：351147。保存：室溫，無菌，非組織培養處理聚苯乙烯。10xBDPhosphoflowLyse/Fix緩沖液裂解緩沖液(BD,訂購ID:558049)。保存：+4℃。使用10xPhosflowPermBufferIV透化緩沖液(BD,訂購ID:560746)前，用雙蒸水稀釋5xBDPhosphoflowLyse/Fix緩沖液至1x，并預熱至所需溫度。保存于室溫。用PBS稀釋10xBDPhosphoflowPermBufferIV至1x。1xCellSatiningBuffer(BioLegend,訂購ID:420201。保存：+4℃，1xCellSatiningBuffer為即用型。不含CaCl2且不含MgCl2的1xPBS(Gibco,訂購ID:14190-094)。保存：室溫。PBS為即用型。5ml聚苯乙烯圓底管(FACS管,BD,訂購ID:352052)。保存：室溫。氨基酸序列序列名稱Seq.Id.No.人組織蛋白酶S1人不變鏈li2人lip103抗lip10抗體7B8的VHCDR14抗lip10抗體7B8的VHCDR25抗lip10抗體7B8的VHCDR36抗lip10抗體7B8的VLCDR17抗lip10抗體7B8的VLCDR28抗lip10抗體7B8的VLCDR39抗lip10抗體7B8的VH鏈10抗lip10抗體7B8的VL鏈11當前第1頁1 2 3