本申請要求于2014年7月23日提交的美國臨時專利申請No.62/028,123的權益，該申請通過引用的方式整體并入本文。

引言

腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是一種革蘭氏陰性細菌，其定殖于人類上呼吸道，并且最值得注意的是引起腦膜炎和敗血癥的世界范圍內的偶發性和周期性流行性爆發。2歲以下兒童的侵襲和發病率最高。與其它革蘭氏陰性細菌一樣，腦膜炎奈瑟氏球菌通常具有細胞質膜、肽聚糖層、與莢膜多糖一起構成細菌壁的外膜、和突出到外部環境中的菌毛。腦膜炎奈瑟氏球菌的包囊菌株是兒童和年輕成人中細菌性腦膜炎和敗血癥的主要原因。侵襲性腦膜炎奈瑟氏球菌感染的流行和經濟重要性推動了對可賦予跨不同株，特別是跨具有不同血清型或血清亞型的遺傳多樣性血清組B的免疫性的有效疫苗的研究。

因子H結合蛋白(fHbp，在本領域中也稱為脂蛋白2086(Fletcher等人(2004)Infect Immun 72:2088-2100)，基因組來源的奈瑟氏球菌抗原(GNA)1870(Masignani等人(2003)J Exp Med 197:789-99)或“741”)是在細菌中作為表面暴露的脂蛋白表達的腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白。fHbp的一個重要功能是結合人補體因子H(fH)，其下調補體激活。fH與細菌表面的結合是病原體在非免疫人血清或血液中存活并逃避先天宿主防御的重要機制。最近，發現人因子H基因簇中的遺傳變異影響發展腦膜炎球菌病的易感性(Davila S等人(2010)Nat Genetics doi:10.1038/ng.640)。fH與fHbp的結合對人fH和幾種非人靈長類動物是特異的，并且可以部分解釋為什么腦膜炎奈瑟氏球菌嚴格地是人類病原體。fHbp出現在由標識(ID)號指定的許多天然序列變體中，如在pubmlst(dot)org/neisseria/fHbp因特網上的fHbp數據庫中指定的。

仍然需要可引發有效的殺菌性抗體應答的fHbp多肽。

概述

提供了可以引發對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株具有殺菌性的抗體的變體因子H結合蛋白、包含所述蛋白質的組合物、以及使用所述蛋白質的方法。

特征

本公開提供了因子H結合蛋白(fHbp)ID 1的變體。本公開提供了fHbp的變體，其中所述變體包含選自以下的至少一種的氨基酸取代：a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代；b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；c)在氨基酸130處用甘氨酸取代精氨酸(R130G)；d)在氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)，其中所述氨基酸取代相對于fHbp ID 1(SEQ ID NO:1)，其中所述變體包含與SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體誘導對哺乳動物宿主中至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答。在一些情況下，在Q38處的氨基酸取代是Q38R、Q38K、Q38H、Q38F、Q38Y或Q38W。在一些情況下，E92處的氨基酸取代是E92K、E92R、E92H、E92F、E92Y或E92W。在一些情況下，S223處的氨基酸取代是S223R、S223K、S223H、S223F、S223Y或S223W。在一些情況下，變體fHbp還可包含相對于fHbp ID 1的R41S或R41A取代。例如，相對于fHbp ID 1，變體fHbp可以包含R41S或R41A取代和S223處的取代，例如R41S/S223R。在其它情況下，變體fHbp還可包含相對于fHbp ID 1的R41S或R41A取代和H248L取代。在某些情況下，變體fHbp可以包含兩個、三個或更多個本文公開的取代。在一個具體的實例中，變體fHbp可以包含相對于fHbp ID 1的以下取代：S223R和H248L。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的25％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的10％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的5％或更小的親和力結合人fH。

本公開提供了fHbp ID 22的變體。本公開提供了fHbp的變體，其中所述變體包含選自以下的至少一種氨基酸取代：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)；b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)；c)在氨基酸128處蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)；d)131位處的纈氨酸的氨基酸取代(V131)；e)219位處的賴氨酸的氨基酸取代(K219)；f)220位處的甘氨酸的氨基酸取代(G220)，其中所述氨基酸取代相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)，其中所述變體包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的25％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的10％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的5％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，V131處的氨基酸取代是V131D、V131E、V131K、V131R、V131H、V131F、V131Y或V131W。在一些情況下，在K219處的氨基酸取代是K219N、K219Q、K219D、K219E、K219F、K219Y或K219W。在一些情況下，G220處的氨基酸取代是G220S、G220N、G220Q、G220D、G220E、G220K、G220R、G220H、G220F、G220Y或G220W。

在一些情況下，變體fHbp包括與野生型(WT)fHbp(例如WT fHbp ID 22)的熱穩定性相比增加變體fHbp的熱穩定性的雙重突變。在一些情況下，變體fHbp可包含相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)的取代L130R和G133D，其中變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答，并且其中所述變體與fHbp ID 22的熱穩定性相比具有更高的熱穩定性。在一些情況下，變體fHbp可包含取代的組合，如L130R，G133D和選自以下的至少一種氨基酸取代：a)N115I；b)D121G；c)S128T；d)V131；e)K219(例如，K219N)；和f)G220(例如，G220S)，其中所述氨基酸取代相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)，其中所述變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。變體fHbp的熱穩定性可以比WT fHbp(例如，fHbp ID 22)高至少5℃、10℃、15℃、20℃或更高，例如高5℃-30℃、5℃-25℃、5℃-20℃、10℃-20℃或15℃-20℃。如本文所用，“熱穩定性”是指當暴露于較高溫度時蛋白質的穩定性；熱穩定性變體蛋白質在比野生型蛋白質更高的溫度下保持其構象。例如，包含與野生型(WT)fHbp(例如WT fHbp ID 22)的熱穩定性相比增加熱穩定性的雙重突變的變體fHbp可以在比WT fHbp更高的溫度下解折疊。在某些情況下，變體fHbp的N端結構域可以在比WT fHbp(例如，fHbp ID 22)的N端結構域更高的溫度下解折疊。

本文還公開了fHbp變體，其包含與WT fHbp相比增強熱穩定性的突變，并且還包括已知減少fH結合的另外的突變，如US2011/0256180中公開的那些突變。在某些實施方案中，公開了因子H結合蛋白(fHbp)的變體，其中相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)，所述變體包含氨基酸取代L130R和G133D以及至少一種以下取代：R80A、D211A、E218A、E248A、G236I、T221A和H223A，其中所述變體包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。

本公開提供了fHbp ID 55的變體。本公開提供了fHbp的變體，其中所述變體包含選自以下的至少一種氨基酸取代：a)在92位處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；b)在223位處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；和c)248位處的組氨酸(H248)的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代相對于fHbp ID 55(SEQ ID NO:3)，其中所述變體包含與SEQ ID NO:3具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的小于50％的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的25％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的10％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的5％或更小的親和力結合人fH。在一些情況下，E92處的氨基酸取代是E92K，E92R，E92H，E92F，E92Y或E92W。在一些情況下，S223處的氨基酸取代是S223R，S223K，S223H，S223F，S223Y或S223W。在一些情況下，H248處的氨基酸取代是H248L，H248I，H248V，H248D，H248E，H248F，H248Y或H248W。

本公開提供了包含本公開的變體fHbp的免疫原性組合物。本公開提供了免疫原性組合物，其包含：a)根據上面段落0006-0010中任一段的變體fHbp；和b)藥學上可接受的賦形劑。在一些情況下，fHbp變體在由腦膜炎奈瑟氏球菌菌株制備的囊泡制劑中。在一些情況下，藥學上可接受的賦形劑包括佐劑；例如，其中佐劑是磷酸鋁或氫氧化鋁。在一些情況下，藥物組合物還包含奈瑟氏球菌表面蛋白A。

本公開提供了編碼根據上面段落0006-0010中任一段的變體fHbp的核酸。本公開提供了重組表達載體，其包含編碼根據上文段落0006-0010中任一段的變體fHbp的核酸。本公開提供了包含編碼根據上文段落0006-0010中任一段的變體fHbp的核酸的體外宿主細胞。本公開提供了包含重組表達載體的體外宿主細胞，所述重組表達載體包含編碼根據上文段落0006-0010中任一段的變體fHbp的核酸。

本公開提供了在哺乳動物中引發抗體應答的方法，所述方法包括對哺乳動物施用上文段落0011的免疫原性組合物。在一些情況下，哺乳動物是人。在一些情況下，抗體應答是對一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答。

附圖說明

圖1描繪了在聚丙烯酰胺凝膠上用考馬斯藍染色的純化的重組fHbp ID 1突變體。泳道1，Kaleidoscope分子量標志物(Bio-Rad Laboratories)；2，fHbp ID 1野生型；3，Q38R；4，E92K；5，R130G；6，S223R；7，H248L。

圖2A和2B描繪了通過ELISA測量的fHbp ID 1突變體與人fH的結合。顯示了重復測量的平均值和范圍。

圖3A-3E描繪了通過表面等離振子共振測量的fHbp ID 1突變體與人fH的結合。作為參考，ID 1野生型(WT)蛋白的相同數據顯示在圖3A-3E的每一個中。

圖4A-4E描繪了通過ELISA測量的鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)與fHbp ID 1突變體蛋白的結合。顯示了重復測量的平均值和范圍。

圖5A和5B描繪了來自用fHbp ID 1突變體免疫的小鼠的血清的殺菌活性。每個符號代表單個小鼠的滴度，并且水平條表示幾何平均滴度。圖5A描繪了來自用fHbp ID 1突變體免疫的野生型小鼠的血清的殺菌活性。圖5B描繪了來自用fHbp ID 1突變體免疫的人fH轉基因小鼠的血清的殺菌活性。

圖6A和6B描繪了fHbp ID 1單或雙重突變體的表征。圖6A描繪了人fH與fHbp ID 1雙重突變體的結合。圖6B描繪了鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)JAR4與突變體的結合。

圖7描繪了來自用fHbp ID 1單或雙重突變體免疫的野生型小鼠的血清的殺菌活性。每個符號代表單個小鼠的滴度，并且水平條表示幾何平均滴度。

圖8A和8B描繪了fHbp ID 55突變體的表征。圖8A顯示通過ELISA測量的人fH與固定的fHbp ID 55突變體的結合，并且圖8B顯示通過ELISA測量的鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)JAR 41與fHbp突變ID 55蛋白的結合。顯示了2至4個重復的平均值和范圍。

圖9描繪了來自用fHbp ID 55突變體免疫的野生型小鼠的血清的殺菌活性。每個符號代表單個小鼠的滴度，并且水平條表示幾何平均滴度。

圖10A和10B描繪了來自用fHbp ID 55免疫的小鼠的血清的殺菌活性。圖10A描繪了來自用獲得許可的Trumenba疫苗或研究性fHbp ID 55突變體S223R免疫的人fH轉基因小鼠的血清的殺菌活性。圖10B描繪了個體轉基因小鼠中血清人fH濃度與血清殺菌抗體滴度(圓形符號)之間的關系。為了比較，顯示了野生型(WT)小鼠的滴度(正方形)。

圖11A-11D描繪了fHbp ID 22突變體的表征。圖11A-11C描繪了通過ELISA測量的fHbp ID 22突變體與人fH的結合。顯示了2至4個重復的平均值和范圍。圖11D描繪了通過ELISA測量的鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)JAR 4與fHbp突變體ID 22蛋白的結合。fHbp ID 22野生型(WT)和D211A突變體顯示為對照。顯示了重復測量的平均值和范圍。

圖12A和12B顯示了來自用fHbp ID 22突變體免疫的小鼠的血清的殺菌活性。每個符號代表單個小鼠的滴度，并且水平條表示幾何平均滴度。圖12A和圖12B顯示了在測試不同fHbp ID 22突變體的兩個實驗中來自野生型小鼠的血清的殺菌活性。

圖13描繪了來自用fHbp ID 22突變體免疫的人fH轉基因小鼠的血清的殺菌活性。

圖14描繪了通過差示掃描微量熱法測量的fHbp ID 22野生型(WT)和L130R/G133D雙重突變體的熱解折疊。

圖15描繪了fHbp ID 22三重突變體的表征。圖15A描繪了人fH與fHbp ID 22三重突變體的結合。DM是指L130R/G133D雙重突變體。圖15B描繪了鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)JAR 4與fHbp ID 22三重突變體的結合。

圖16描繪了來自用fHbp ID 22三重突變體免疫的人fH轉基因小鼠的血清的殺菌活性。DM是指L130R/G133D雙重突變體。

圖17提供了具有降低的人fH結合的示例性fHbp突變體的表。

圖18提供了野生型人因子H的氨基酸序列。

圖19提供了來自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的fHbp ID 1，ID 22和ID 55的氨基酸序列。

圖20-24提供了fHbp ID 1變體的氨基酸序列。

圖25-30提供了fHbp ID 22變體的氨基酸序列。

圖31-33提供了fHbp ID 55變體的氨基酸序列。

圖34-36提供了fHbp ID 1雙重突變體變體的氨基酸序列。

圖37-39提供了fHbp ID 22雙重突變和三重突變變體的氨基酸序列。

圖40提供NspA的氨基酸序列。

定義

“因子H結合蛋白”(fHbp)，其在文獻中也稱為GNA1870，GNA1870，ORF2086，LP2086(脂蛋白2086)和“741”是指一類腦膜炎奈瑟氏球菌多肽。它在自然界中被發現為細菌腦膜炎奈瑟氏球菌表面上的脂蛋白。基于氨基酸序列變異性和免疫交叉反應性(Masignani等人(2003)J Exp Med 197:789-99)，fHbp已經在一些報告中細分為三種fHbp變體組(稱為變體組 1(v.1)，變體組2(v.2)和變體組3(v.3))(Masignani等人(2003)J Exp Med 197:789-99)以及在其它報告中分為亞家族A和B(參見例如Fletcher等人(2004)Infect Immun72:2088-2100))。fHbp也可以分為六個最常見的fHbp模塊組之一，稱為模塊組I至模塊組VI，如Vu等人(2012)Sci.Reports 2:341的圖2中所示。根據pubmlst.org/neisseria/fHbp/網站，在腦膜炎奈瑟氏球菌中發現的每個獨特的fHbp也被分配fHbp肽ID。因為變體2(v.2)fHbp蛋白(來自菌株8047，fHbp ID 77)和變體3(v.3)fHbp(來自菌株M1239，fHbp ID 28)的長度分別與菌株MC58的fHbp蛋白(fHbp ID 1)相差-1和+7個氨基酸殘基，所以本文中用于指v.2和v.3fHbp蛋白的殘基的編號與基于這些蛋白的實際氨基酸序列的編號不同。因此，例如，提及v.2或v.3fHbp序列的166位的亮氨酸殘基(L)是指v.2蛋白的165位的殘基和v.3蛋白的173位的殘基。除非另有說明，fHbp變體中存在的氨基酸取代的編號是參照fHbp ID 1中氨基酸殘基的編號。

如本文所用，人因子H(“人fH”)是指包含如圖18(SEQ ID NO:4)所示的氨基酸序列的蛋白質及其天然存在的人等位變體。

在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“來源自”fHbp ID 1的氨基酸序列)的上下文中的“來源自”意圖指多肽或核酸具有基于參考多肽或核酸(例如天然存在的fHbp蛋白或編碼核酸)的序列的序列，并且不意味著對制備蛋白質或核酸的來源或方法的限制。氨基酸序列或多核苷酸序列可以“來源自”的參考多肽和參考多核苷酸的非限制性實例包括天然存在的fHbp，fHbp ID 1和非天然存在的fHbp。在細菌菌株的上下文中，“來源自”是指菌株是通過親本菌株的體內傳代或體外培養獲得的，和/或是通過修飾親本菌株獲得的重組細胞。

“保守氨基酸取代”是指一種氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，所述另一種氨基酸殘基共享氨基酸側鏈的化學和物理性質(例如電荷，大小，疏水性/親水性)。“保守取代”意圖包括在以下氨基酸殘基組內的取代：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。這種取代的指導可以從呈現目標表位的多肽的氨基酸序列的比對中提取。

術語“保護性免疫”是指施用于哺乳動物的疫苗或免疫方案誘導免疫應答，其預防由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病，延緩由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的發展或降低由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的嚴重性，或減少或完全消除疾病的癥狀。保護性免疫可伴隨殺菌抗體的產生。應當注意，本領域公認針對腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌抗體的產生作為預測疫苗在人中的保護作用。(Goldschneider等人(1969)J.Exp.Med.129:1307；Borrow等人(2001)Infect Immun.69:1568)。

短語“由腦膜炎奈瑟氏球菌菌株引起的疾病”涵蓋腦膜炎奈瑟氏球菌的人感染中存在的任何臨床癥狀或臨床癥狀的組合。這些癥狀包括但不限于：由腦膜炎奈瑟氏球菌的致病菌株對上呼吸道(例如鼻咽和扁桃體的粘膜)的定植，細菌穿透進入粘膜和粘膜下血管床，敗血癥，敗血性休克，炎癥，出血性皮膚損傷，纖維蛋白溶解和血液凝固的活化，器官功能障礙，如腎，肺和心力衰竭，腎上腺出血和肌肉梗塞，毛細血管滲漏，水腫，外周肢體缺血，呼吸窘迫綜合征，心包炎和腦膜炎。

在抗原(例如多肽抗原)的上下文中，短語“特異性結合抗體”或“與…特異性免疫反應”是指基于和/或證明樣品中存在抗原的結合反應，所述樣品也可以包括其它分子的異質群體。因此，在指定的條件下，規定的一種或多種抗體與樣品中的一種或多種特定抗原結合，并且不以顯著量與樣品中存在的其它分子結合。在抗原的表位(例如多肽的表位)的上下文中，“特異性結合抗體”或“與…特異性免疫反應”是指基于和/或證明抗原(例如多肽)中存在表位的結合反應，所述抗原也可以包括其它表位的異質群體，以及異質抗原群體。因此，在指定的條件下，規定的一種或多種抗體與抗原的特定表位結合，并且不以顯著量與存在于抗原和/或樣品中的其它表位結合。

短語“以足以引發免疫應答的量”是指在施用特定抗原制劑之前和之后測量的免疫應答指標之間存在可檢測的差異。免疫應答指標包括但不限于：通過測定法如酶聯免疫吸附測定(ELISA)，殺菌測定，流式細胞術，免疫沉淀，Ouchterlony免疫擴散；例如斑點，蛋白質印跡或抗原陣列的結合檢測測定；細胞毒性測定等檢測的抗體滴度或特異性。

“表面抗原”是存在于腦膜炎奈瑟氏球菌(例如外膜，莢膜，菌毛等)的表面結構中的抗原。

“分離的”是指在與化合物可天然存在的環境不同的環境中的感興趣的實體。“分離的”意在包括在基本上富集感興趣的化合物的樣品內和/或其中感興趣的化合物部分或基本上純化的化合物。在一些情況下，純化分離的組分(例如，多肽，如本公開的fHbp變體；本公開的核酸；本公開的重組載體)，例如，分離的組分是至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或大于99％純的。

“富集的”是指非天然操縱(例如，由實驗者或臨床醫生)樣品，使得感興趣的化合物以比起始樣品中化合物的濃度大的濃度(例如，大至少3倍，大至少4倍，大至少8倍，大至少64倍或更多)存在，所述起始樣品如生物樣品(例如，樣品，其中化合物天然存在或其中它在施用后存在)，或其中制備化合物(例如，如在細菌多肽，抗體，核酸等中一樣)。

在進一步描述本發明之前，應當理解，本發明不限于所描述的具體實施方案，因此當然可以改變。還應當理解，本文使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不旨在限制，因為本發明的范圍將僅由所附權利要求書限制。

在提供值的范圍的情況下，應當理解，除非上下文另有明確說明，否則在該范圍的上限和下限之間的每個居間值(至下限單位的十分之一)，以及任何其它所述的范圍或在所述范圍內的居間值包括在本發明內。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在較小范圍內，并且也包括在本發明內，服從所述范圍中任何特別排除的限制。當所述范圍包括一個或兩個限制時，排除那些所包括的限制中的一個或兩個的范圍也包括在本發明中。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然與本文所述的那些類似或等同的任何方法和材料也可以用于本發明的實踐或測試中，但是現在描述優選的方法和材料。本文提及的所有出版物通過引用的方式并入本文，以公開和描述與所引用的出版物相關的方法和/或材料。

必須注意，如本文和所附權利要求書中所使用的，單數形式“一”，“一個/種”和“該/所述”包括復數指示物，除非上下文另有明確指示。因此，例如，提及“因子H結合蛋白”包括多種此類因子H結合蛋白，并且提及“免疫原性組合物”包括提及一種或多種免疫原性組合物及本領域技術人員已知的其等同物，等等。還應注意，權利要求書可以撰寫為排除任何任選的要素。因此，本說明書旨在充當使用與權利要求要素的敘述有關的諸如“單獨”，“僅”等排他性術語或使用“否定”限制的引用基礎。

應當理解，為了清楚起見在單獨實施方案的上下文中描述的本發明的某些特征也可以在單個實施方案中組合提供。相反，為了簡明起見，在單個實施方案的上下文中描述的本發明的各種特征也可以單獨地或以任何合適的子組合提供。屬于本發明的實施方案的所有組合特別地被本發明所涵蓋，并且在本文中公開，就像每個組合單獨地和明確地公開一樣。另外，各種實施方案及其元件的所有子組合也特別地被本發明涵蓋，并且在本文中公開，就如同每個此類子組合在本文中單獨地和明確地公開一樣。

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具體實施方式

本公開提供了可以引發對腦膜炎奈瑟氏球菌的至少一種菌株具有殺菌性的抗體的變體因子H結合蛋白(fHbp)。本公開提供了包含本公開的變體fHbp的組合物，包括免疫原性組合物。本公開提供了本公開的變體fHbp或包含本公開的變體fHbp的組合物的使用方法。

變體FHBP

本公開提供了變體fHbp，其在氨基酸序列上與野生型腦膜炎奈瑟氏球菌fHbp的差異為1至10個氨基酸(例如從1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸)，10個氨基酸至15個氨基酸，15個氨基酸至20個氨基酸，20個氨基酸至30個氨基酸，30個氨基酸至40個氨基酸或40個氨基酸至50個氨基酸，使得與參考fHbp相比，變體fHbp表現出與人因子H(fH)的親和力降低，并且其中變體fHbp當施用于哺乳動物宿主時誘導對一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性免疫應答。在一些情況下，變體fHbp在氨基酸序列上與參考野生型腦膜炎奈瑟氏球菌fHbp的差異不超過1至10個酸取代。在一些情況下，變體fHbp在氨基酸序列上與參考野生型腦膜炎奈瑟氏球菌fHbp僅相差一個氨基酸取代。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與參考fHbp序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；其中變體fHbp相對于參考fHbp序列包含一個或多個氨基酸取代，使得變體fHbp表現出為參考fHbp對人fH的結合親和力的85％或更小的對人fH的親和力，例如變體fHbp表現出為參考fHbp對人fH的親和力的結合親和力的約85％至約75％，約75％至約65％，約65％至約55％，約55％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％或約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％的對人fH的親和力；并且當施用于哺乳動物宿主(例如人；或非人動物模型)時，變體fHbp誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性免疫應答。

當參考fHbp處于其天然構象時，本公開的變體fHbp保持與人fH結合的參考(例如野生型)fHbp的基本上相同的構象。本公開的變體fHbp是否保持結合人fH的參考(例如野生型)fHbp的基本上相同的構象可以使用當野生型fHbp處于其天然構象時結合野生型fHbp的抗體來確定。這樣的抗體包括例如JAR 41；JAR 4；和JAR 31。參見，例如Vu等人(2012)Sci.Reports 2:341。產生JAR 4單克隆抗體的雜交瘤具有美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號PTA-8943；也參見USPN 8,470,340。例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp保留與JAR 4的結合；例如本公開的變體fHbp保留參考fHbp(例如fHbp ID1，fHbp ID 22或fHbp ID 55)在其天然構象中對JAR 4的結合的至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％。

fHbp ID的變體1

來源本公開的變體fHbp的“參照fHbp”在一些情況下是fHbp ID 1.fHbp ID 1的氨基酸序列如下所示。

fHbp ID 1：

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO:1).

在一些情況下，本公開的變體fHbp是變體組1fHbp。在一些情況下，本公開的變體fHbp是變體組1fHbp，并且是模塊組I fHbp。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；其中變體fHbp相對于fHbp ID 1包含一個或多個氨基酸取代，使得變體fHbp展示為fHbp ID 1對人fH的結合親和力的85％或更小的對人fH的親和力，例如變體fHbp表現出為fHbp ID 1對人fH的親和力的結合親和力的約85％至約75％，約75％至約65％，約65％至約55％，約55％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％的對人fH的親和力；并且當施用于哺乳動物宿主(例如人；或非人動物模型)時，變體fHbp誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性免疫應答。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中基于fHbp ID 1的編號，所述變體fHbp包含選自以下至少一種的氨基酸取代：a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代；b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；c)在氨基酸130處用甘氨酸取代精氨酸(R130G)；d)氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代。在一些情況下，變體fHbp包含Q38R取代。具有帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如賴氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可在該位置取代。因此，在一些情況下，變體fHbp包含Q38K取代，Q38H取代，Q38F取代，Q38Y取代或Q38W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖20所示和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含E92K取代。具有帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在該位置取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含E92R取代，E92H取代，E92F取代，E92Y取代或E92W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖21所示和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含氨基酸130處的用甘氨酸取代精氨酸(R130G)。例如，本公開的變體fHbp可以包含圖22所示和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。具有帶負電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在R130處取代。因此，例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，，并且其中變體fHbp包含R130D取代，R130E取代，R130F取代，R130Y取代或R130W取代。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含S223R取代。具有帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如賴氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可在該位置取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含S223K取代，S223H取代，S223F取代，S223Y取代或S223W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖23所示和SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)。例如，本公開的變體fHbp可以包含圖24所示并且在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。具有非極性，帶負電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如異亮氨酸，纈氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在H248處取代。因此，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含H248I取代，H248V取代，H248D取代，H248E取代，H248F取代，H248Y取代或H248W取代。

氨基酸取代的組合

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中基于fHbp ID 1的編號，所述變體fHbp包含選自以下的兩個或更多個的氨基酸取代：a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代；b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；c)在氨基酸130處用甘氨酸取代精氨酸(R130G)；d)氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)。

可以包括取代的組合，其中兩個取代在不同的結構域中，并且各自獨立地降低fH與fHbp的結合(例如，在N-末端結構域中的一個取代，與C端結構域中的氨基酸取代組合)。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在N-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在C-末端結構域內的第二氨基酸取代。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在N-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在N-末端結構域內的第二氨基酸取代。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在C-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在C-末端結構域內的第二氨基酸取代。

例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中基于fHbp ID 1的編號，所述變體fHbp包含：a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代和b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代，和c)在氨基酸130用甘氨酸取代精氨酸(R130G)；或其中變體fHbp包含a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代和d)在氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含a)在氨基酸38處的谷氨酰胺(Q38)的氨基酸取代，和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)。

作為另外的非限制性實例，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，其中基于fHbp ID 1的編號，所述變體fHbp包含：b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代和c)在氨基酸130處用甘氨酸取精氨酸(R130G)；或其中變體fHbp包含b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代和d)在氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含b)在氨基酸92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)；或其中所述變體fHbp包含c)在氨基酸130處用甘氨酸取代精氨酸(R130G)，和d)在氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含c)在氨基酸130處用甘氨酸取代精氨酸(R130G)，和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)；或其中變體fHbp包含d)氨基酸223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代和e)在氨基酸248處用組氨酸取代亮氨酸(H248L)。

作為另外的非限制性實例，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 1對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中基于fHbp ID 1的編號，所述變體fHbp包含：i)Q38R取代；和ii)R130G取代。

本文還提供了變體fHbp蛋白，其包含相對于如上所述的fHbp ID 1的氨基酸序列的一個或多個取代，并且還包含取代R41S。示例性變體fHbp包含相對于fHbp ID 1的R41S取代和在S223處的取代，例如R41S/S223R，或者相對于fHbp ID 1的R41S取代和H248L取代。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:1具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中基于fHbp ID 1的編號，所述變體fHbp包含兩個或更多個以下氨基酸取代：a)在氨基酸41處用絲氨酸取代精氨酸(R41S)；b)在氨基酸223處用精氨酸取代絲氨酸(S223R)；c)在氨基酸248處用亮氨酸取代組氨酸(H248L)。

本文還公開了變體fHbp蛋白，其包含相對于如上所述的fHbp ID 1的氨基酸序列的一個或多個取代，并且還包含US2011/0256180中公開的取代，其通過引用的方式整體并入本文。

fHbp ID 22的變體

來源本公開的變體fHbp的“參照fHbp”在一些情況下是fHbp ID 22。fHbp ID 22的氨基酸序列如下所示。

fHbp ID 22：

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:2)。

在一些情況下，本公開的變體fHbp是變體組2fHbp。在一些情況下，本公開的變體fHbp是變體組2fHbp，并且是模塊組III fHbp。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；其中變體fHbp相對于fHbp ID 22包含一個或多個氨基酸取代，使得變體fHbp表現出為fHbp ID 22對人fH結合親和力的85％或更少的對人fH的親和力，如變體fHbp表現出為fHbp ID 22對人fH親和力的結合親和力的約85％至約75％，約75％至約65％，約65％至約55％，約55％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％或約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％的對人fH的親和力；并且當施用于哺乳動物宿主(例如人；或非人動物模型)時，變體fHbp誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性免疫應答。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 22的氨基酸序列，變體fHbp包含選自以下至少一種的氨基酸取代：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)；b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)；c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)；d)131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代；e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代；f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代。如本文所述，氨基酸殘基的編號基于fHbp ID 1的編號。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)。例如，本公開的變體fHbp可以包含圖25所示和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。具有非極性，帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如纈氨酸，亮氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在N115處取代。因此，例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp相對于fHbp ID 22的氨基酸序列包含N115V取代，N115L取代，N115K取代，N115R取代，N115H取代，N115F取代，N115Y取代或N115W取代。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)。例如，本公開的變體fHbp可以包含圖26所示和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。具有非極性，帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可在D121處取代。因此，例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp相對于fHbp ID 22的氨基酸序列包含D121L取代，D121I取代，D121V取代，D121K取代，D121R取代，D121H取代，D121F取代，D121Y取代或D121W取代。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)。例如，本公開的變體fHbp可以包含圖27所示和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在S128也可以取代具有極性，帶電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如甲硫氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸。因此，例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 22的氨基酸序列，變體fHbp包含S128M取代，S128N取代，S128D取代，S128E取代，S128K取代，S128R取代，S128H取代，S128F取代，S128Y取代或S128W取代。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含在131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含V131D取代。具有帶電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含V131E取代，V131K取代，V131R取代，V131H取代，V131F取代，V131Y取代或V131W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含相對于fHbp ID 22的氨基酸序列的圖28所示和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含K219N取代。具有極性，帶負電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含K219Q取代，K219D取代，K219E取代，K219F取代，K219Y取代或K219W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖29所示和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含G220S取代。具有極性，帶電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含G220N取代，G220Q取代，G220D取代，G220E取代，G220K取代，G220R取代，G220H取代，G220F取代，G220Y取代或G220W取代。例如，本公開的變體fHbp可以包含圖30所示和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

氨基酸取代的組合

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 22的氨基酸序列，所述變體fHbp包含選自以下的兩個或更多個的氨基酸取代：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)；b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)；c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)；d)131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代；e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代；f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代。如本文所述，殘基的編號基于fHbp ID 1中氨基酸的編號。

可以包括取代的組合，其中兩個取代在不同的結構域中，并且各自獨立地降低fH與fHbp的結合(例如，在N末端結構域中的一個取代，與C端結構域中的氨基酸取代組合)。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在N-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在C-末端結構域內的第二氨基酸取代。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在N-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在N-末端結構域內的第二氨基酸取代。在一些情況下，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在C-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在C-末端結構域內的第二氨基酸取代。

例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，其中相對于fHbp ID 22的氨基酸序列，基于fHbp ID 1的氨基酸序列的取代的殘基的編號，所述變體fHbp包含：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)，和b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)；或其中變體fHbp包含：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)，和c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)；或其中變體fHbp包含：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)，和d)在131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)，和e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：a)在氨基酸115處用異亮氨酸取代天冬酰胺(N115I)，和f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代。

作為另外的非限制性實例，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 22的氨基酸序列，所述變體fHbp包含：b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)，和c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)；或其中變體fHbp包含：b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)，和d)在131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)，和e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：b)在氨基酸121處用甘氨酸取代天冬氨酸(D121G)，和f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代。取代的殘基的編號是基于fHbp ID 1的氨基酸序列的編號。

作為另外的非限制性實例，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 22的氨基酸序列，所述變體fHbp包含：c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)，和d)在位置131處的纈氨酸(V131)的氨基酸替換；或其中變體fHbp包含：c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)，和e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：c)在氨基酸128處用蘇氨酸取代絲氨酸(S128T)，和f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：d)131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代和e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：d)131位處的纈氨酸(V131)的氨基酸取代和f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：e)219位處的賴氨酸(K219)的氨基酸取代和f)220位處的甘氨酸(G220)的氨基酸取代。取代的殘基的編號是基于fHbp ID 1的氨基酸序列的編號。

可以包括取代的組合，其中兩個取代在不同的結構域中，并且各自獨立地降低fH與fHbp的結合(例如，來自N-末端結構域的一個(例如，N115I，D121G，S128T或V131D)與來自C末端結構域的一個(例如，D211A，K219N，G220S)組合)。

例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中所述變體fHbp包含：i)N115I取代；和ii)D211A取代。

作為另一個實例，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含：i)N115I取代；和ii)K219N取代。

作為另一個實例，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含：i)N115I取代；和ii)G220S取代。

本文中還公開了與野生型fHbp ID22相比具有增加的熱穩定性的變體fHbp多肽。在一些情況下，變體fHbp可以包含相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)的取代L130R和G133D，其中變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答，并且所述變體具有比WT fHbp ID 22更高的熱穩定性。變體fHbp的熱穩定性可以比WT fHbp(例如fHbp ID 22)高至少5℃，10℃，15℃，20℃，或更高，例如高5℃-30℃，5℃-25℃，5℃-20℃，10℃-20℃或15℃-20℃。如本文所用，“熱穩定性”是指當暴露于較高溫度時蛋白質的穩定性；熱穩定性變體蛋白質在比野生型蛋白質更高的溫度下保持其構象。例如，包含與野生型(WT)fHbp(例如WT fHbp ID 22)的熱穩定性相比增加熱穩定性的雙重突變的變體fHbp可以在比WT fHbp更高的溫度下解折疊。在某些情況下，變體fHbp的N端結構域可以在比WT fHbp(例如，fHbp ID 22)的N端結構域更高的溫度下解折疊。

在某些實施方案中，公開了因子H結合蛋白(fHbp)的變體，其中相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)，所述變體包含氨基酸取代L130R和G133D以及至少一個以下取代：R80A，N115I，D121G，S128T，V131，D211A，E218A，K219(例如，K219N)，G220(例如G220S)，E248A，G236I，T221A和H223A，其中所述變體包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更低的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。

在一些情況下，變體fHbp可包括取代的組合，如L130R，G133D和選自以下的至少一種氨基酸取代：a)N115I；b)D121G；c)S128T；d)V131D；e)K219(例如，K219N)；和f)G220(例如，G220S)，其中所述氨基酸取代相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)，其中所述變體fHbp包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。

在某些實施方案中，公開了因子H結合蛋白(fHbp)的變體，其中相對于fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)，所述變體包含氨基酸取代L130R和G133D和至少一個以下取代：R80A，D211A，E218A，E248A，G236I，T221A，和H223A，其中所述變體包含與SEQ ID NO:2具有大于85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 22對人fH的親和力的50％或更小的親和力結合人因子H(fH)，并且其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導殺菌性抗體應答。

示例性變體fHbp包括多肽，其具有與SEQ ID NO:2具有大于85％的氨基酸序列同一性(例如，至少90％同一性，至少95％，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性)的氨基酸序列，并且相對于SEQ ID NO:2的氨基酸序列包含以下取代：L130R和G133D；L130R，G133D和K219N；或L130R，G133D，和G220S。

本文中還公開了變體fHbp蛋白，其包含相對于如上所述的fHbp ID 22的氨基酸序列的一個或多個取代，并且還包含US2011/0256180中公開的取代，其通過引用的方式整體并入本文。

fHbp ID 55的變體

來源本公開的變體fHbp的“參照fHbp”在一些情況下是fHbp ID 55。fHbp ID 55的氨基酸序列如下所示。

fHbp ID 55：

CSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO:3)。

在一些情況下，本公開的變體fHbp是變體組1fHbp。在一些情況下，本公開的變體fHbp是變體組1fHbp，并且是模塊組IV fHbp。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；其中變體fHbp相對于fHbp ID 55包含一個或多個氨基酸取代，使得變體fHbp表現出fHbp ID 55對人fH的結合親和力的85％或更小的對人fH的親和力，例如變體fHbp表現出fHbp ID 55對人fH的親和力的結合親和力的約85％至約75％，約75％至約65％，約65％至約55％，約55％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％的對人fH的親和力；并且當施用于哺乳動物宿主(例如人；或非人動物模型)時，變體fHbp誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性免疫應答。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 55的氨基酸序列，所述變體fHbp包含選自以下至少一種的氨基酸取代：a)92位處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；b)223位處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；和c)在248位處的組氨酸(H248)的氨基酸取代，其中氨基酸殘基的編號基于fHbp ID 1的編號。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含位置92處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含E92K取代。具有帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如精氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可以在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含E92R取代，E92H取代，E92F取代，E92Y取代或E92W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖31所示和SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含位置223處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含S223R替換。具有帶正電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如賴氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含S223K取代，S223H取代，S223F取代，S223Y取代或S223W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖32所示和SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中變體fHbp包含248位的組氨酸(H248)的氨基酸取代。在一些情況下，fHbp變體包含H248L取代。具有非極性，帶負電荷或芳族側鏈的其它氨基酸，如異亮氨酸，纈氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸也可在該位置處取代。因此，例如，在一些情況下，fHbp變體包含H248I取代，H248V取代，H248D取代，H248E取代，H248F取代，H248Y取代或H248W取代。作為一個實例，本公開的變體fHbp可以包含圖33所示和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

氨基酸取代的組合

在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID 55對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 55，所述變體fHbp包含兩個或更多個選自以下的氨基酸取代：a)92位處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代；b)223位處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；和c)在248位處的組氨酸(H248)的氨基酸取代，其中殘基的編號基于fHbp ID 1的序列中氨基酸的編號。

可以包括取代的組合，其中兩個取代在不同的結構域中，并且各自獨立地降低fH與fHbp的結合(例如，在N-末端結構域中的一個取代，與C結構域中的氨基酸取代的組合)。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在N-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在C-末端結構域內的第二氨基酸取代。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在N-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在N-末端結構域內的第二氨基酸取代。在一些情況下，本公開的變體fHbp包含在C-末端結構域內的第一氨基酸取代；和在C-末端結構域內的第二氨基酸取代。

例如，在一些情況下，本公開的變體fHbp包含與SEQ ID NO:3具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體fHbp以fHbp ID55對人fH的親和力的50％或更小(例如，約50％至約45％，約45％至約35％，約35％至約25％，約25％至約15％，約15％至約10％，約10％至約5％，約5％至約2％，約2％至約1％，或約1％至約0.1％，或小于0.1％)的親和力結合人fH，其中所述變體在哺乳動物宿主中誘導對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答，并且其中相對于fHbp ID 55，變體fHbp包含：a)92位處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代和b)223位處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：a)92位處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代和c)248位處的組氨酸(H248)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：b)223位處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代和c)248位處的組氨酸(H248)的氨基酸取代；或其中變體fHbp包含：a)92位處的谷氨酸(E92)的氨基酸取代和b)223位處的絲氨酸(S223)的氨基酸取代，和c)，在248位處的組氨酸(H248)的氨基酸取代，其中殘基的編號基于fHbp ID 1的序列中氨基酸的編號。

本文還公開了變體fHbp蛋白，其包含相對于如上所述的fHbp ID 55的氨基酸序列的一個或多個取代，并且還包含US2011/0256180中公開的取代，其通過引用的方式整體并入本文。

融合多肽

本公開的變體fHbp可以是融合多肽，例如包含如上所述的變體fHbp和異源多肽(例如，融合配偶體)的多肽。融合配偶體可以在變體fHbp的N末端，在變體fHbp的C末端，或在fHbp內的內部位點。

合適的融合配偶體包括賦予體內增強的穩定性(例如，增加的血清半衰期)的肽和多肽；提供易于純化，例如(His)_n，例如6His等；提供融合蛋白從細胞的分泌；提供表位標簽，例如GST，血凝素(HA；例如YPYDVPDYA；SEQ ID NO:26)，FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO:27)，c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO:28)等；提供可檢測信號，例如產生可檢測產物的酶(例如β-半乳糖苷酶，螢光素酶)或可自身檢測的蛋白質，例如綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白等；提供多聚化，例如多聚化結構域，例如免疫球蛋白的Fc部分；等等。

產生方法

本公開的fHbp可以通過任何合適的方法產生，包括重組和非重組方法(例如化學合成)。當使用重組技術產生主題fHbp時，所述方法可涉及任何合適的構建體和任何合適的宿主細胞，其可以是原核或真核細胞，通常是細菌或酵母宿主細胞，更通常是細菌細胞。將遺傳物質引入宿主細胞的方法包括例如轉化，電穿孔，接合，磷酸鈣方法等。可以選擇轉移的方法以提供引入的編碼fHbp的核酸的穩定表達。編碼fHbp的核酸可以作為可遺傳的游離元件(例如質粒)提供或者可以是基因組整合的。

本公開提供了包含編碼本公開的fHbp變體的核苷酸序列的核酸(包括分離的核酸)。在一些實施方案中，編碼fHbp變體的核苷酸序列可操作地連接于轉錄控制元件，例如啟動子。在一些情況下，啟動子是組成性的。在一些情況下，啟動子是誘導型的。在一些情況下，啟動子適合用于原核宿主細胞(例如，在原核宿主細胞中有活性)。在一些情況下，啟動子適合用于真核宿主細胞(例如，在真核宿主細胞中有活性)。

在一些情況下，包含編碼本公開的fHbp變體的核苷酸序列的核酸存在于表達載體中。本公開提供了包含編碼本公開的fHbp變體的核苷酸序列的重組表達載體(例如，分離的重組表達載體)。在一些實施方案中，編碼fHbp變體的核苷酸序列可操作地連接于轉錄控制元件，例如啟動子。在一些情況下，啟動子是組成性的。在一些情況下，啟動子是誘導型的。在一些情況下，啟動子適合用于原核宿主細胞(例如，在原核宿主細胞中有活性)。在一些情況下，啟動子適合用于真核宿主細胞(例如，在真核宿主細胞中有活性)。

用于轉移編碼fHbp的核酸的合適載體可以在組成上不同。整合載體可以是條件性復制或自殺質粒，噬菌體等。構建體可以包括各種元件，包括例如啟動子，可選擇的遺傳標志物(例如賦予抗生素(例如卡那霉素，紅霉素，氯霉素或慶大霉素)抗性的基因)，復制起點(促進宿主細胞，例如細菌宿主細胞中的復制)等。載體的選擇將取決于多種因素，例如其中需要增殖的細胞類型和增殖的目的。某些載體可用于擴增和制備大量的期望的DNA序列。其它載體適于在培養物中的細胞中表達。其它載體適合于在整個動物中的細胞中轉移和表達。合適載體的選擇完全在本領域的技術內。許多此類載體可商購獲得。

在一個實例中，載體是基于附加體質粒的表達載體，所述附加體質粒含有可選擇的藥物抗性標志物和提供在不同宿主細胞(例如在大腸桿菌和腦膜炎奈瑟氏球菌二者中)中自主復制的元件。這種“穿梭載體”的一個實例是質粒pFP10(Pagotto等人(2000)Gene 244:13-19)。

構建體(重組載體)可以通過例如將目標多核苷酸插入構建體主鏈中來制備，其通常依靠DNA連接酶附著到載體中切割的限制酶位點進行。或者，可以通過同源重組或位點特異性重組插入期望的核苷酸序列。通常，通過在期望的核苷酸序列的側翼上附著與載體的同源區域來完成同源重組，而位點特異性重組可以通過使用促進位點特異性重組的序列(例如cre-lox，att位點，等等)來實現。可以通過例如寡核苷酸的連接或通過使用包含同源性區域和期望的核苷酸序列的一部分二者的引物的聚合酶鏈式反應來添加包含此類序列的核酸。

載體可以在宿主細胞中提供染色體外維持，或者可以提供整合到宿主細胞基因組中。載體充分描述于本領域技術人員熟知的許多出版物中，包括例如Short Protocols in Molecular Biology，(1999)F.Ausubel等人編，Wiley&Sons。載體可以提供編碼主題fHbp的核酸的表達，可以提供用于增殖主題核酸，或兩者。

可以使用的載體的實例包括但不限于來源自重組噬菌體DNA，質粒DNA或粘粒DNA的載體。例如，可以使用質粒載體如pBR322，pUC19/18，pUC118，119和M13mp系列載體。pET21也是可以使用的表達載體。噬菌體載體可以包括λgt10，λgt11，λgt18-23，λZAP/R和EMBL系列噬菌體載體。可以利用的其它載體包括但不限于pJB8，pCV 103，pCV 107，pCV 108，pTM，pMCS，pNNL，pHSG274，COS202，COS203，pWE15，pWE16和charomid 9系列載體。

對于主題fHbp的表達，可以采用表達盒。因此，本公開提供了包含主題核酸的重組表達載體。表達載體提供轉錄和翻譯調節序列，并且可提供誘導型或組成性表達，其中編碼區在轉錄起始區，以及轉錄和翻譯終止區的轉錄控制下可操作地連接。這些控制區可以是來源主題fHbp的fHbp天然的，或可以源自外源來源。通常，轉錄和翻譯調節序列可以包括但不限于啟動子序列，核糖體結合位點，轉錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，以及增強子或激活子序列。啟動子可以是組成性或誘導型，并且可以是強的組成性啟動子(例如T7等)。

表達載體通常具有位于啟動子序列附近的方便的限制性位點，以提供編碼感興趣的蛋白質的核酸序列的插入。可以存在在表達宿主中有效的選擇標志物，以促進含有載體的細胞的選擇。另外，表達構建體可以包括另外的元件。例如，表達載體可以具有一個或兩個復制系統，因此允許其維持在生物體中，例如在用于表達的哺乳動物或昆蟲細胞中和在用于克隆和擴增的原核宿主中。此外，表達構建體可以含有選擇標志物基因以允許選擇轉化的宿主細胞。選擇基因是本領域熟知的，并且將隨所用的宿主細胞而變化。

應當注意，本公開的fHbp可以包含另外的元件，如可檢測標記物，例如放射性標記物，熒光標記物，生物素標記物，免疫學可檢測標記物(例如血凝素標記物，多組氨酸標簽)等。可以通過各種方法(例如，親和捕獲等)提供fHbp的額外元件以促進分離(例如，生物素標簽，免疫可檢測標簽)。主題fHbp可以任選地通過共價或非共價附著固定在支持物上。

fHbp的分離和純化可以根據本領域已知的方法完成。例如，可以通過免疫親和純化從經遺傳修飾以表達fHbp的細胞的裂解物中或從合成反應混合物中分離fHbp，所述免疫親和純化通常涉及使樣品與抗fHbp抗體(例如抗fHbp單克隆抗體抗體(mAb)，如本領域已知的JAR 4MAb或其它合適的JAR MAb)接觸，洗滌以除去非特異性結合的物質，以及洗脫特異性結合的fHbp。分離的fHbp可以通過透析和蛋白質純化方法中通常使用的其它方法進一步純化。在一個實例中，fHbp可以使用金屬螯合色譜分離。

宿主細胞

許多合適的宿主細胞中的任何一種可以用于fHbp的產生。一般而言，本文所述的fHbp可根據常規技術在原核生物或真核生物，例如細菌，如大腸桿菌或奈瑟氏球菌(例如腦膜炎奈瑟氏球菌)中表達。因此，本公開進一步提供了遺傳修飾的體外宿主細胞，其含有編碼主題fHbp的核酸。用于產生(包括大規模生產)主題fHbp的宿主細胞可以選自多種可用的宿主細胞中的任一種。用于表達的宿主細胞的實例包括原核或真核單細胞生物體的那些，如細菌(例如大腸桿菌菌株)，酵母(例如釀酒酵母，畢赤酵母屬物種等)，并且可以包括最初來源自高等生物體，如昆蟲，脊椎動物，例如哺乳動物的宿主細胞。合適的哺乳動物細胞系包括但不限于HeLa細胞(例如，美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號CCL-2)，CHO細胞(例如ATCC編號CRL9618，CCL61，CRL9096)，293細胞(例如ATCC No.CRL-1573)，Vero細胞，NIH 3T3細胞(例如ATCC No.CRL-1658)，Huh-7細胞，BHK細胞(例如ATCC No.CCL10)，PC12細胞(ATCC No.CRL1721)，COS細胞，COS-7細胞(ATCC No.CRL1651)，RAT1細胞，小鼠L細胞(ATCC No.CCLI.3)，人胚胎腎(HEK)細胞(ATCC No.CRL1573)，HLHepG2細胞等)。在一些情況下，細菌宿主細胞和酵母宿主細胞對于主題fHbp生產是特別感興趣的。

主題fHbp可以以基本上純的或基本上分離的形式(即，基本上不含其它奈瑟氏球菌或宿主細胞多肽)或基本上分離的形式制備。主題fHbp可以存在于相對于可能存在的其它組分(例如，其它多肽或其它宿主細胞組分)富集多肽的組合物中。可以提供純化的主題fHbp，使得多肽存在于基本上不含其它表達的多肽的組合物中，例如，由其它表達的多肽構成的組合物的小于90％，通常小于60％，更通常小于50％。

用于囊泡生成的宿主細胞

當要在膜囊泡中提供主題fHbp(如下文更詳細討論的)時，遺傳修飾奈瑟氏球菌宿主細胞以表達主題fHbp。可以經修飾以產生主題fHbp，并且任選地產生或可以經修飾以產生其它感興趣的抗原，如PorA的多種奈瑟氏球菌屬物種菌株的任一種可以用于本文公開的方法中。

提供奈瑟氏球菌菌株的遺傳修飾和期望多肽的表達的方法和載體是本領域已知的。載體和方法的實例可以在WO 02/09746和O'Dwyer等人(2004)Infect Immun 72:6511-80中找到。強啟動子，特別是組成性強啟動子是特別感興趣的。啟動子的實例包括porA，porB，lbpB，tbpB，p110，hpuAB，lgtF，opa，p110，lst，hpuAB和rmp的啟動子。

致病性奈瑟氏球菌或源自致病性奈瑟氏球菌的菌株，特別是對于人致病性或源自對于人致病性或共生的菌株的菌株，對于用于膜囊泡產生是特別感興趣的。奈瑟氏球菌的實例包括腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)，淺黃奈瑟氏球菌(N.flavescens)，淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)，乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)，多糖奈瑟氏球菌(N.polysaccharea)，灰色奈瑟氏球菌(N.cinerea)，粘液奈瑟氏球菌(N.mucosa)，淡黃色奈瑟氏球菌(N.subflava)，干燥奈瑟氏球菌(N.sicca)、長形奈瑟氏球菌(N.elongata)等。

腦膜炎奈瑟氏球菌菌株對于表達主題fHbp的遺傳修飾和對于在囊泡產生中的用途是特別感興趣的。用于囊泡產生的菌株可以根據可能期望的許多不同特征來選擇。例如，可以根據以下選擇菌株：期望的PorA類型(“血清亞型”)，莢膜組，血清型等；減少的莢膜多糖產生；等等。例如，產生菌株可以產生任何期望的PorA多肽，并且可以表達一種或多種PorA多肽(天然或由于遺傳工程)。菌株的實例包括產生賦予P1.7,16；P1.19,15；P1.7,1；P1.5,2；P1.22a,14；P1.14；P1.5,10；P1.7,4；P1.12,13；以及此類PorA多肽的變體的血清亞型的PorA多肽的那些，所述變體可保留或不可保留與血清亞型分型中使用的常規血清學試劑的反應性。還感興趣的是根據PorA可變區(VR)分型表征的PorA多肽(參見例如Russell等人(2004)Emerging Infect Dis 10:674-678；Sacchi CT等人(1998)Clin Diagn Lab Immunol 5:845-55；Sacchi等人(2000)J.Infect Dis 182:1169-1176)。已經鑒定了大量不同的VR類型，其可以分類為VR1和VR2家族“原型”。在neisseria.org/nm/typing/pora上可以找到描述此命名及其與以前的分型方案的關系的web可訪問的數據庫。在Russell等人(2004)Emerging Infect Dis 10:674-678中提供了某些PorA VR1和VR2類型的比對。

或者或另外，產生菌株可以是莢膜缺陷型菌株。莢膜缺陷型菌株可以提供基于泡囊的疫苗，其提供在施用疫苗的受試者中引發顯著的自身抗體應答(例如，由于產生與宿主細胞表面上的唾液酸交叉反應的抗體)的降低的風險。如本文所用，“莢膜缺陷型”或“莢膜多糖缺陷型”是指細菌表面上的莢膜多糖水平低于天然存在的菌株的水平，或者當菌株經遺傳修飾時，其水平低于來源莢膜缺陷型菌株的親本菌株的水平。莢膜缺陷型菌株包括表面莢膜多糖產量降低至少10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，75％，80％，85％，90％或更多的菌株，并且包括其中在細菌表面上檢測不到莢膜多糖的菌株(例如，通過使用抗莢膜多糖抗體的全細胞酶聯免疫吸附測定(ELISA))。

莢膜缺陷型菌株包括由于天然存在的或重組產生的遺傳修飾而莢膜缺陷的那些。天然存在的莢膜缺陷菌株(參見例如Dolan-Livengood等人(2003)J.Infect.Dis.187:1616-28)，以及鑒定和/或產生莢膜缺陷型菌株的方法(參見例如Fisseha等人(2005)Infect.Immun.73:4070-4080；Stephens等人(1991)Infect Immun 59:4097-102；Frosch等人(1990)Mol Microbiol.4:1215-1218)是本領域中已知的。

修飾奈瑟氏球菌宿主細胞以提供莢膜多糖的減少的產生可以包括修飾參與莢膜合成的一個或多個基因，其中所述修飾提供例如相對于修飾前的親本細胞的降低的莢膜多糖水平。此類遺傳修飾可以包括使得菌株莢膜變為缺陷(例如，由于一個或多個莢膜生物合成基因中的一個或多個插入，缺失，取代等)的一個或多個莢膜生物合成基因中的核苷酸和/或氨基酸序列的變化。莢膜缺陷型菌株可以缺乏一種或多種莢膜基因或對于一種或多種莢膜基因是非功能的。

特別感興趣的是唾液酸生物合成缺陷的菌株。此類菌株可以提供具有引發與人唾液酸抗原交叉反應的抗唾液酸抗體的降低風險的囊泡的產生，并且可以進一步提供改善的制造安全性。具有唾液酸生物合成缺陷(由于天然存在的修飾或工程化修飾)的菌株在唾液酸生物合成途徑中的許多不同基因中的任一個中可以是有缺陷的。特別感興趣的是在由N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向異構酶基因(稱為synX AAF40537.1或siaA AAA20475)編碼的基因產物中有缺陷的菌株，其中該基因失活的菌株是特別感興趣的。例如，在一個實施方案中，通過破壞功能性synX基因產物的產生來產生莢膜缺陷型菌株(參見例如Swartley等人(1994)J Bacteriol.176:1530-4)。

莢膜缺陷型菌株也可以使用非重組技術從天然存在的菌株產生，例如通過使用殺菌性抗莢膜抗體來選擇具有降低水平的莢膜多糖的菌株。

當本公開涉及使用兩種或更多種菌株(例如，產生含有來自不同菌株的主題fHbp呈遞泡囊的抗原組合物)時，可以選擇菌株，以在一種或多種菌株特征方面不同，例如，以提供在所使用的主題fHbp，PorA等中不同的囊泡。

囊泡的制備

本公開涵蓋的抗原性組合物通常包括從表達主題fHbp的奈瑟氏球菌細胞制備的囊泡。如本文中提及，“囊泡”意圖涵蓋外膜囊泡以及微囊泡(其也稱為水泡)。

抗原組合物可以含有從腦膜炎奈瑟氏球菌的培養菌株的外膜制備的外膜囊泡(OMV)，所述腦膜炎奈瑟氏球菌經遺傳修飾以表達主題fHbp。OMV可以從在肉湯或固體培養基培養物中培養的腦膜炎奈瑟菌獲得，優選通過從培養基中分離細菌細胞(例如通過過濾或通過使細胞沉淀的低速離心等)，裂解細胞(例如，例如通過加入去污劑，滲透壓休克，超聲處理，空化，均質化等)，并將外膜級分與細胞質分子分離(例如通過過濾；或通過外膜和/或外膜囊泡的差異沉淀或聚集，或通過使用特異性識別外膜分子的配體的親和分離方法；或通過沉淀外膜和/或外膜囊泡等的高速離心)；外膜級分可用于產生OMV。

抗原性組合物可以含有包含主題fHbp的微囊泡(MV)(或“水泡”)，其中在培養經遺傳修飾以表達主題fHbp的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的培養過程中釋放MV或水泡。例如，可以通過在肉湯培養基中培養腦膜炎奈瑟氏球菌菌株，從培養基中分離全細胞(例如通過過濾，或通過低速離心，其僅使細胞而非水泡等沉淀)，然后收集存在于無細胞培養基中的MV(例如通過過濾，MV的差異沉淀或聚集，或通過使水泡沉淀的高速離心等)。用于產生MV的菌株通常可以基于培養物中產生的水泡量來選擇(例如，細菌可以以合理數量培養以提供適于在本文所述的方法中分離和施用的水泡)。在PCT公開號WO 01/34642中描述了產生高水平水泡的示例性菌株。除了水泡產生之外，還可以基于NspA產生來選擇用于MV產生的菌株，其中產生更高水平的NspA的菌株可能是特別感興趣的(對于具有不同NspA產生水平的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的實例，參見例如Moe等人(1999Infect.Immun.67:5664)。用于在產生水泡中的用途的其它感興趣的菌株包括具有滅活的GNA33基因的菌株，所述基因編碼細胞分離，膜結構和毒力所需的脂蛋白(參見，例如，Adu-Bobie等(2004)Infect Immun.72:1914-1919)。

本公開的抗原性組合物可以含有來自一個菌株或來自2、3、4、5或更多種菌株的囊泡，所述菌株可以彼此同源或異源，通常是異源的。例如，菌株相對于PorA和/或來源主題fHbp的fHbp可以是同源或異源的。囊泡可以由表達多于一種主題fHbp(例如，1、2、3或更多種主題fHbp)的菌株制備，所述主題fHbp可以由來自不同變體(v.1，v.2或v.3)或子變體(例如，v.1，v.2或v.3的子變體)的fHbp氨基酸序列組成。

抗原性組合物可以包含呈現相同或不同主題fHbp的OMV和MV的混合物，其中主題fHbp可以任選地呈現來自fHbp變體和/或子變體的不同組合的表位，并且其中OMV和/或MV可以是來自相同或不同的菌株。來自不同菌株的囊泡可以作為混合物施用，或者可以連續施用。

當期望時(例如，當用于產生囊泡的菌株與內毒素或特定高水平的內毒素相關時)，任選地對囊泡進行處理以降低內毒素，例如降低施用后的毒性。盡管如下討論不太期望，內毒素的減少可以通過用合適的去污劑(例如BRIJ-96，脫氧膽酸鈉，月桂酰肌氨酸鈉，Empigen BB，Triton X-100，非離子型去污劑TWEEN 20(脫水山梨醇單月桂酸酯聚氧乙烯(sorbitan monolaurate polyoxyethylene))，非離子型去污劑TWEEN 80，濃度為0.1-10％，例如0.5-2％，和十二烷基硫酸鈉(SDS))。當使用去污劑提取時，優選使用脫氧膽酸鹽以外的去污劑。

抗原性組合物的囊泡可以在沒有去污劑的情況下制備，例如不使用脫氧膽酸鹽。盡管去污劑處理可用于去除內毒素活性，但其可通過在囊泡產生期間提取而耗盡天然fHbp脂蛋白和/或主題fHbp(包括脂化的fHbp)。因此，可能特別期望使用不需要去污劑的技術來降低內毒素活性。在一種方法中，使用相對低的內毒素(脂多糖，LPS)生產菌的菌株，以避免在用于人之前從最終制劑中除去內毒素的需要。例如，囊泡可以從奈瑟氏球菌突變體制備，其中減少或消除疫苗(例如Rmp)中可能不需要的脂寡糖或其它抗原。

囊泡可以從含有導致脂質A的降低或檢測不到的毒性活性的遺傳修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株制備。例如，此類菌株可以在脂質A生物合成中遺傳修飾(Steeghs等人(1999)Infect Immun 67：4988-93；van der Ley等人(2001)Infect Immun 69:5981-90；Steeghs等人(2004)J Endotoxin Res 10:113-9；Fissha等人(2005)Infect Immun 73:4070)。免疫原性組合物可以通過LPS的修飾來解毒，如分別由lpxL1或lpxL2編碼的酶的下調和/或失活。在lpxL1突變體中制備的五酰化脂質A的產生表明由lpxL1編碼的酶在GlcN II的2'位置將C12添加到N-連接的3-OH C14。在lpxL2突變體中發現的主要脂質A種類是四酰化的，表明由lpxL2編碼的酶添加另一個C12，即，添加到GlcN I的2位處的N-連接的3-OH C14。導致減少(或無)這些基因的表達(或這些基因的產物的活性降低或沒有活性)的突變導致脂質A的毒性活性改變(van der Ley等人(2001)Infect Immun 69:5981-90)。四酰化(lpxL2突變體)和五酰化(lpxL1突變體)脂質A的毒性低于野生型脂質A。脂質A 4'-激酶編碼基因(lpxK)中的突變也降低脂質A的毒性活性。用于產生囊泡(例如，MV或OMV)的特別感興趣的是腦膜炎奈瑟氏球菌菌株，其經遺傳修飾以提供減少的或檢測不到的功能性LpxL1編碼的蛋白質，例如，其中奈瑟氏球菌細菌(例如腦膜炎奈瑟氏球菌菌株)被遺傳修飾以提供lpxL1基因的基因產物的降低的活性或無活性。例如，奈瑟氏球菌細菌可以被遺傳修飾以具有lpxL1基因敲除，例如，其中lpxL1基因被破壞。參見例如美國專利公開號2009/0035328。奈瑟氏球菌細菌可以被遺傳修飾以提供lpxL2基因的基因產物的降低的活性或無活性。奈瑟氏球菌細菌可以被遺傳修飾以提供lpxL1基因和lpxL2基因的基因產物的活性降低或無活性。與對于LPS產生而言野生型的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株相比，此類囊泡提供了降低的毒性，同時保留主題fHbp的免疫原性。

LPS毒性活性也可以通過在涉及多粘菌素B抗性的基因/基因座中引入突變來改變(這種抗性已經與在脂質A的4'磷酸上添加氨基阿拉伯糖相關)。這些基因/基因座可以是編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的pmrE，或許多腸桿菌科(enterobacteriaciae)共有的抗微生物肽抗性基因的區域，其可能參與氨基阿拉伯糖的合成和轉移。存在于該區域中的基因pmrF編碼多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶(Gunn J.S.,Kheng、B.L.,Krueger J.,Kim K.,Guo L.,Hackett M.,Miller S.I.1998.Mol.Microbiol.27:1171-1182)。

PhoP-PhoQ調節系統(其是磷酸中繼(phospho-relay)雙組分調節系統(例如PhoP組成性表型，PhoPc))中的突變，或低Mg⁺⁺環境或培養條件(其激活PhoP-PhoQ調節系統)導致4'-磷酸酯上的氨基阿拉伯糖的添加和2-羥基肉豆蔻酸酯代替肉豆蔻酸酯(肉豆蔻酸酯的羥基化)。該修飾的脂質A顯示刺激人內皮細胞的E-選擇蛋白表達和從人單核細胞分泌TNF的降低的能力。

多粘菌素B抗性菌株也適合使用，因為此類菌株已顯示具有降低的LPS毒性(參見例如van der Ley等(1994)于：Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference.The Guildhall，Winchester，England)。或者，可以將模擬多粘菌素B的結合活性的合成肽添加到抗原組合物以降低LPS毒性活性(參見，例如，Rustici等人(1993)Science 259:361-365；Porro等人(1998)Prog Clin Biol Res.397:315-25)。

內毒素也可以通過選擇培養條件來減少。例如，在每升培養基中含有0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生長培養基中培養菌株提供降低的脂質毒性(參見例如WO 02/097646)。

組合物和配制劑

為了方便起見，本文中使用“組合物”，“抗原組合物”，“抗原性組合物”或“免疫原性組合物”，一般指包含如本文中公開的主題fHbp的組合物，所述主題fHbp可任選是綴合的，以進一步增強免疫原性。本公開特別涵蓋用于引發抗體的組合物，例如針對腦膜炎奈瑟氏球菌的抗體，例如針對腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌性抗體。抗原性組合物可以含有1、2或更多種不同的主題fHbp。當有多于一種類型的fHbp時，每種主題fHbp可以呈現來自fHbp變體和/或子變體的不同組合的表位。

抗原性組合物含有免疫有效量的主題fHbp，并且根據需要還可包含其它相容性組分。本公開的組合物可以含有作為低fH結合劑的fHbp。該組合物含有一種或多種fHbp，其中至少一種fHbp是低fH結合物。當組合物中存在多于一種fHbp時，每種fHbp可以是不同的(例如在氨基酸序列和/或綴合中)。

在一些情況下，本公開的抗原性組合物僅包含本公開的一種fHbp變體。在一些情況下，本公開的抗原性組合物包含本公開的兩種或更多種不同的fHbp變體。作為非限制性實例，在一些情況下，本公開的抗原組合物包含：

1)fHbp ID 1的第一變體，其中第一fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；和fHbp ID 1的第二變體，其中第二fHbp ID 1變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；

2)fHbp ID 1的第一變體，其中第一fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；和fHbp ID 1的第二變體，其中第二fHbp ID 1變體包含在R130處的氨基酸取代(例如，R130G)；

3)fHbp ID 1的第一變體，其中第一fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；和fHbp ID 1的第二變體，其中第二fHbp ID 1變體包含在S223處的氨基酸取代(例如，S223R)；

4)fHbp ID 1的第一變體，其中第一fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；和fHbp ID 1的第二變體，其中第二fHbp ID 1變體包含H248處的氨基酸取代(例如H248L)；

5)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在N115處的氨基酸取代(例如，N115I)；和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；

6)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在D121處的氨基酸取代(例如，D121G)；和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；

7)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在S128處的氨基酸取代(例如，S128T)；和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含H248處的氨基酸取代(例如H248L)；

8)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在V131處的氨基酸取代(例如V131D)；和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；

9)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在K219處的氨基酸取代(例如，K219N)；和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；

10)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在G220處的氨基酸取代(例如，G220S)；和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含在Q38處的氨基酸取代(例如，Q38R)；

11)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在N115處的氨基酸取代(例如，N115I)；和fHbp ID 55的變體，其中fHbp ID 55變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；

12)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在D121處的氨基酸取代(例如，D121G)；和fHbp ID 55的變體，其中fHbp ID 55變體包含S223處的氨基酸取代(例如，S223R)；

13)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在S128處的氨基酸取代(例如，S128T)；和fHbp ID 55的變體，其中fHbp ID 55變體包含H248處的氨基酸取代(例如H248L)；

14)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在V131處的氨基酸取代(例如V131D)；和fHbp ID 55的變體，其中fHbp ID 55變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；

15)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在K219處的氨基酸取代(例如，K219N)；和fHbp ID 55的變體，其中fHbp ID 55變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；

16)fHbp ID 22的變體，其中fHbp ID 22變體包含在G220處的氨基酸取代(例如，G220S)；和fHbp ID 55的變體，其中fHbp ID 55變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；

17)fHbp ID 1的第一變體，其中第一fHbp ID 1變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；和fHbp ID 1的第二變體，其中第二fHbp ID 1變體包含H248處的氨基酸取代(例如H248L)；

18)fHbp ID 1的第一變體，其中第一fHbp ID 1變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；和fHbp ID 1的第二變體，其中第二fHbp ID 1變體包含在S223處的氨基酸取代(例如，S223R)；

19)fHbp ID 22的第一變體，其中第一fHbp ID 22變體包含在N115處的氨基酸取代(例如，N115I)；和fHbp ID 22的第二變體，其中第二fHbp ID 22變體包含在D211處的氨基酸取代(例如，D211A)；

20)fHbp ID 22的第一變體，其中第一fHbp ID 22變體包含在N115處的氨基酸取代(例如，N115I)；和fHbp ID 22的第二變體，其中第二fHbp ID 22變體包含在K219處的氨基酸取代(例如，K219N)；

21)fHbp ID 22的第一變體，其中第一fHbp ID 22變體包含在N115處的氨基酸取代(例如，N115I)；和fHbp ID 22的第二變體，其中第二fHbp ID 22變體包含在G220處的氨基酸取代(例如，G220S)；

22)fHbp ID 22的第一變體，其中第一fHbp ID 22變體包含在D 121處的氨基酸取代(例如，D121G)；和fHbp ID 22的第二變體，其中第二fHbp ID 22變體包含在G220處的氨基酸取代(例如，G220S)；

23)fHbp ID 22的第一變體，其中第一fHbp ID 22變體包含在S128處的氨基酸取代(例如，S128T)；和fHbp ID 22的第二變體，其中第二fHbp ID 22變體包含在G220處的氨基酸取代(例如，G220S)；

24)fHbp ID 22的第一變體，其中第一fHbp ID 22變體包含V131處的氨基酸取代(例如V131D)；和fHbp ID 22的第二變體，其中第二fHbp ID 22變體包含在G220處的氨基酸取代(例如，G220S)；

25)fHbp ID 55的第一變體，其中第一fHbp ID 55變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；和fHbp ID 55的第二變體，其中第二fHbp ID 55變體包含在S223處的氨基酸取代(例如，S223R)；

26)fHbp ID 55的第一變體，其中第一fHbp ID 55變體包含在E92處的氨基酸取代(例如，E92K)；和fHbp ID 55的第二變體，其中第二fHbp ID 55變體包含H248處的氨基酸取代(例如H248L)；

27)fHbp ID22的變體，其包含氨基酸取代：L130R和G133D，和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含S223處的氨基酸取代(例如S223R)；

28)fHbp ID22的變體，其包含氨基酸取代：L130R和G133D，和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含在H248處的氨基酸取代(例如H248L)；

29)fHbp ID22的變體，其包含氨基酸取代：L130R，G133D和K219N，和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含S223處的氨基酸取代(例如S223R)或H248(例如H248L)；或

30)fHbp ID22的變體，其包含氨基酸取代：L130R，G133D和G220S，和fHbp ID 1的變體，其中fHbp ID 1變體包含S223處的氨基酸取代(例如S223R)或H248(例如H248L)。

本公開涵蓋的免疫原性組合物包括但不限于包含以下的組合物：

1)本公開的至少一種變體fHbp；和

2)NspA；

其中fHbp和/或NspA可以作為重組蛋白和/或在基于囊泡的組合物(例如，OMV或MV)中提供。應當注意，當組合物包含NspA和fHbp二者時，通過施用組合物引起的抗體的殺菌性活性可以源自針對一種或兩種抗原的抗體的協作。本公開提供的免疫原性組合物的實例包括：

a)免疫原性組合物，其包含如上所述的fHbp變體(例如，其中變體fHbp引發對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答)；

b)免疫原性組合物，其包含如上所述的fHbp變體(例如，其中變體fHbp引發對至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌性抗體應答)；和重組NspA蛋白；

c)免疫原性組合物，其包含從遺傳修飾的奈瑟氏球菌宿主細胞獲得的天然OMV，所述宿主細胞用編碼本公開的變體fHbp的核酸進行遺傳修飾，使得編碼的變體fHbp由遺傳修飾的宿主細胞產生，其中所述OMV包含編碼的變體fHbp；和

d)免疫原性組合物，其包含從遺傳修飾的奈瑟氏球菌宿主細胞獲得的天然OMV，所述宿主細胞用編碼本公開的變體fHbp的核酸進行遺傳修飾，使得編碼的非天然存在的fHbp由遺傳修飾的宿主細胞產生，其中所述OMV包含編碼的變體fHbp；并且其中奈瑟氏球菌宿主細胞還產生更高水平的NspA，使得OMV還包含NspA。例如，奈瑟氏球菌宿主細胞可以是經遺傳修飾以實現增加的NspA表達的細胞。

“免疫有效量”是指以單劑，作為一系列相同或不同抗原性組合物的一部分向個體施用所述量有效引發抗體應答，其有效治療或預防由例如奈瑟氏球菌屬，特別是腦膜炎奈瑟氏球菌感染，更特別是B型腦膜炎奈瑟氏球菌感染引起的癥狀或疾病。此量隨待治療的個體的健康和身體狀況，年齡，個體免疫系統產生抗體的能力，期望的保護程度，疫苗的配制劑，治療臨床醫生對醫療狀況的評估，和其它相關因素而變化。預期所述量將落在可以通過常規試驗確定的相對寬的范圍內。

NspA多肽的氨基酸序列是本領域中已知的。參見例如WO 96/29412；和Martin等人(1997)J.Exp.Med.185:1173；GenBank登錄號U52066；和GenBank登錄號AAD53286。“NspA多肽”可包含與在圖40中所描繪并且SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的約75個氨基酸至約100個氨基酸，約100個氨基酸至約150個氨基酸或約150個氨基酸至約174個氨基酸的連續區段具有至少約80％，至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，至少約99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。“NspA多肽”可以包含與圖40中描繪和SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列的氨基酸20至174的約75個氨基酸至約100個氨基酸，或約100個氨基酸至約155個氨基酸的連續區段具有至少約80％，至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，至少約99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情況下，NspA多肽缺少信號序列；在其它情況下(例如，為了在宿主細胞中表達)，NspA多肽包含信號序列。

劑量方案可以是單劑日程表或多劑日程表(例如，包括加強劑量)，其中在不同時間施用抗原性組合物的單位劑型。如本文所用，術語“單位劑型”是指適合作為人和動物受試者的單位劑量的物理上分散的單位，每個單位以足以產生期望的效果的量含有預定量的本公開的抗原組合物，所述組合物與藥學上可接受的賦形劑(例如，藥學上可接受的稀釋劑，載體或賦形劑)聯合提供。抗原性組合物可以與其它免疫調節劑聯合施用。

抗原性組合物可以在藥學上可接受的賦形劑中提供，所述賦形劑可以是溶液，如無菌水溶液，通常是鹽水溶液，或者它們可以以粉末形式提供。若期望的話，此類賦形劑可以是基本上惰性的。

在一些實施方案中，主題免疫原性組合物包含存在于囊泡中的主題fHbp。在一些實施方案中，主題免疫原性組合物包含MV中存在的主題fHbp。在一些實施方案中，主題免疫原性組合物包含存在于OMV中的主題fHbp。在一些實施方案中，主題免疫原性組合物包含MV和OMV的混合物，其包含主題fHbp。上文描述了囊泡，如MV和OMV。

抗原性組合物可以進一步含有佐劑。可用于人的已知合適的佐劑的實例包括但不必限于鋁佐劑(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)，MF59(4.3％w/v角鯊烯，0.5％w/v Tween 80^TM，0.5％w/v Span 85)，含CpG的核酸(其中胞嘧啶是未甲基化的)，QS21，MPL，3DMPL，來自Aquilla的提取物，ISCOMS，LT/CT突變體，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，Quil A，白細胞介素等。對于實驗動物，可以使用弗氏佐劑(弗氏不完全佐劑；完全弗氏佐劑)，N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱為去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)和RIBI，其在2％角鯊烯/Tween 80乳劑中含有從細菌提取的三種組分，即單磷酰脂質A，海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可以通過測量針對免疫原性抗原或其抗原性表位的抗體的量來確定佐劑的有效性。

用于增強組合物有效性的其它示例性佐劑包括但不限于：(1)水包油乳液配制劑(具有或不具有其它特異性免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或細菌細胞壁組分)，如例如(a)含有5％角鯊烯，0.5％Tween80和0.5％Span 85(任選地含有MTP-PE)的MF59(WO 90/14837；Vaccine design中的第10章：the subunit and adjuvant approach，Powell和Newman編，Plenum Press 1995)，其使用微流化器配制成亞微米顆粒，(b)含有10％角鯊烷，0.4％Tween 80、5％普朗尼克(pluronic)封閉聚合物L121和thr-MDP的SAF，其微流化為亞微米乳液或渦旋以產生較大粒度的乳液，和(c)含有2％角鯊烯，0.2％Tween 80和一個或多個細菌細胞壁，如單磷脂A(MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的RIBI佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)，例如MPL+CWS(Detox TM)；(2)可以使用皂苷佐劑，如QS21或Stimulon^TM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或由其產生的顆粒，例如ISCOM(免疫刺激復合物)，所述ISCOMS可以不含額外的去污劑，例如WO 00/07621；(3)完全弗氏佐劑(CFA)或不完全弗氏佐劑(IFA)；(4)細胞因子，如白細胞介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12(WO99/44636)等)，干擾素(例如γ干擾素)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷酰脂質A(MPL)或3-O-脫酰化MPL(3dMPL)，例如GB-2220221，EP-A-0689454，任選在基本上不存在明礬中在與肺炎球菌糖一起使用時，例如WO 00/56358；(6)3dMPL與例如QS21和/或水包油乳液的組合，例如，EP-A-0835318，EP-A-0735898，EP-A-0761231；(7)包含CpG基序的寡核苷酸(參見例如WO 98/52581)，例如含有至少一個CG二核苷酸的寡核苷酸，其中胞嘧啶是未甲基化的；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(參見例如WO 99/52549)；(9)聚氧乙烯脫水山梨醇酯表面活性劑與辛苯聚醇(octoxynol)的組合(WO 01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種別的非離子型表面活性劑，如辛苯聚醇的組合(WO 01/21152)(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(11)免疫刺激劑和金屬鹽顆粒，例如WO 00/23105；(12)皂苷和水包油乳劑，例如WO 99/11241；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任選地+固醇)，例如WO 98/57659；(14)充當免疫刺激劑以增強組合物功效的其它物質。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰(thr-MDP)，N-25乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(去甲-MDP)，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰--sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)等。適合于對人施用的佐劑是特別感興趣的。在一些情況下，佐劑是鋁鹽佐劑(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)。

抗原組合物可以含有其它組分，如藥物級的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，鎂，碳酸鹽等。根據需要，組合物可含有藥學上可接受的輔助物質，以接近生理條件，如pH調節和緩沖劑，毒性調節劑等，例如乙酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，乳酸鈉等。

配制劑中主題fHbp的濃度可以廣泛地變化(例如，按重量計，從小于約0.1％，例如，處于或至少約2％至多達20％至50％或更多)，并且將通常主要基于根據所選擇的具體施用模式和患者需要的液體體積，粘度和基于患者的因素進行選擇。

含有fHbp的配制劑可以以溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，粉末，凝膠，乳膏，洗劑，軟膏劑，氣霧劑等的形式提供。認識到口服施用可需要保護組合物免于消化。這通常通過將組合物與使其抗酸和酶水解的試劑結合或通過將組合物包裝在有適當抗性的載體中來實現。防止消化的方法是本領域中熟知的。

還可以提供含fHbp的配制劑，以便在施用后增加fHbp的血清半衰期。例如，當將分離的fHbp配制用于注射時，fHbp可以在脂質體配制劑中提供，制備為膠體或用于延長血清半衰期的其它常規技術。多種方法可用于制備脂質體，如例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，如美國專利號4,235,871、4,501,728和4,837,028。制劑還可以以受控釋放或緩慢釋放形式提供。

誘導免疫應答的方法

本公開提供了在哺乳動物宿主中誘導對至少一種奈瑟氏球菌菌株的免疫應答的方法。所述方法通常涉及向有需要的個體施用有效量的主題免疫原性組合物。

通常將含有fHbp的抗原性組合物施用于處于獲得奈瑟氏球菌疾病風險的人類受試者，以預防或至少部分阻止疾病及其并發癥的發展。足以實現這點的量定義為“治療有效劑量”。對治療施加有效的量將取決于例如抗原性組合物，施用方式，患者的體重和一般健康狀況，以及主治內科醫生的判斷。可以根據患者需要和耐受的劑量和頻率以及施用途徑施用單劑或多劑的抗原性組合物。

含有fHbp的抗原性組合物通常以有效引發宿主中的免疫應答，特別是體液免疫應答，例如殺菌性抗體應答的量施用。如上所述，免疫的量將變化，并且通常可以為每70kg患者約1μg至100μg，通常為5μg至50μg/70kg。基本上較高的劑量(例如10mg至100mg或更多)可以適合于口服，鼻或局部給藥途徑。初始施用之后可以加強免疫相同的含有不同fHbp的抗原性組合物。在一些情況下，疫苗接種涉及至少一種加強劑，在一些情況下包括兩種加強劑。

一般而言，免疫可以通過任何合適的途徑施用，包括在含或不含添加的賦形劑的情況下口服，鼻內，鼻咽，胃腸外，腸內，胃，局部，經皮，皮下，肌肉內，以片劑，固體，粉末，液體，氣霧劑形式，局部或全身施用組合物。用于制備可胃腸外施用的組合物的實際方法是本領域技術人員已知或顯而易見的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)的出版物中更詳細地描述。

抗fHbp免疫應答可以通過已知的方法評估(例如通過在初始免疫之前和之后從個體獲得血清，并證明個體免疫狀態的變化，例如免疫沉淀測定，ELISA或殺菌測定，蛋白質印跡測定或流式細胞術測定等)。

本公開的變體fHbp是否在哺乳動物宿主中引起對腦膜炎奈瑟氏球菌的一種或多種菌株的殺菌應答可以使用任何公知的測定法來確定。例如，可以使用人fH轉基因小鼠，其中小鼠表達人fH(例如，人fH以約100μg/ml或大于100μg/ml的濃度存在于小鼠血清中)。將本公開的變體fHbp施用于人fH轉基因小鼠。在一段時間后，測試來自小鼠的血清的針對一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌活性。合適的對照包括例如fHbp ID 1。合適的測定法的實例描述于Vu等人(2012)Sci.Reports 2:341。

可以將抗原性組合物施用于就腦膜炎奈瑟菌而言免疫學活性的哺乳動物宿主(例如人受試者)。在一個具體的實施方案中，受試者是約5歲以下，優選地約2歲齡以下的人兒童，并且抗原性組合物在以下時間中的任何一個或多個時間施用：出生后的2周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月，或1年或15、18或21個月，或2、3、4或5歲齡。

通常可能期望在疾病癥狀的第一種體征之前或在可能或實際暴露于感染或疾病(例如，由于奈瑟氏球菌的暴露或感染)的第一種體征時啟動免疫。

實施例

提出以下實施例以向本領域普通技術人員提供如何制備和使用本發明的完全公開和描述，并且不旨在限制本發明人視為其發明的范圍，它們也不旨在表示以下實驗是所進行的全部或唯一的實驗。已經做出努力以確保關于使用的數字(例如量，溫度等)的準確性，但是應該考慮一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，否則份數是重量份，分子量是重均分子量，溫度是以攝氏度計，并且壓力是大氣壓或接近大氣壓。可以使用標準縮寫，例如bp，堿基對；kb，千堿基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，氨基酸；kb，千堿基；bp，堿基對；nt，核苷酸；i.m.，肌內的(地)；i.p.，腹膜內的(地)；s.c.，皮下的(地)；等等。

實施例1：fHbp ID 1突變體的鑒定和表征

材料和方法

文庫篩選

通過易錯聚合酶鏈式反應(PCR)產生隨機突變fHbp文庫，隨后將PCR產物克隆到pET28表達質粒中，所述pET28表達質粒包括允許在大腸桿菌上表面展示的信號序列。使用熒光激活的細胞分選來分離具有人fH的低結合和對照抗fHbp單克隆抗體的高結合的突變體克隆，其確保fHbp突變體的充分表達和正確折疊。將收集的細胞鋪于瓊脂平板(含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB瓊脂)上，在37℃下溫育過夜。使用單個大腸桿菌菌落作為PCR擴增的模板，并且純化DNA擴增子(PCR純化試劑盒；Qiagen)，并經受使用與T7啟動子和T7終止子退火的引物進行的fHbp基因的DNA測序。篩選隨機突變體fHbp文庫的方法具有鑒定以下的潛力：1)影響fH結合的位置，其不能從單獨的晶體結構預測；和2)除丙氨酸以外的取代，其在丙氨酸取代不會導致fH結合的充分降低的情況下影響fH的結合。

選擇突變體以進一步研究

在與人fH片段的復合的fHbp的晶體結構中檢查從FACS實驗鑒定的氨基酸取代的位置。選擇與fH結合界面接近的突變體進行位點特異性誘變。通過位點特異性誘變重演文庫突變體是創建可溶性重組fHbp蛋白以進一步表征所必需的。該方法還除去了非期望的二級突變，其存在于許多分選的克隆中并且遠離fH結合位點。用Phusion定向誘變試劑盒(Thermo Scientific，Inc.)構建位點特異性突變體。

可溶性突變體fHbp的表達和純化

在大腸桿菌中表達可溶性重組fHbp，并且如前所述制備裂解物。通過使用HiTrap螯合HP柱(5ml；GE Life Sciences，Inc.)和Akta Purifier色譜系統(GE Life Sciences)的鎳親和色譜純化fHbp。根據柱制造商的方案制備用于使用咪唑梯度的結合和洗脫的緩沖液。將含有純化的fHbp的級分合并，針對含有3％蔗糖的PBS透析，并在使用前儲存在-80℃。

對于小鼠免疫原性研究，使用具有HiTrap SP HP柱(5ml；GE Life Sciences)的離子交換色譜進行第二純化步驟。結合和洗脫緩沖液是分別含有150mM和750mM NaCl的25mM MES，pH 5.5。使用由結合和洗脫緩沖液形成的線性梯度從SP柱洗脫結合的fHbp。將含有純化的fHbp的級分組合，針對含有3％蔗糖的PBS透析，并在使用前儲存在-80℃。

人因子H(fH)的純化

在fHbp親和柱上純化人fH。通過使用制造商的方案將5mg fHbp ID 1偶聯至NHS-活化的HP柱(5ml；GE Life Sciences)來制備柱。將來自健康個體供體的人血清在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中1:1稀釋。將血清施加于柱，并用10個體積的PBS(即50ml)洗滌柱。用5個柱體積的0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7洗脫結合的fH。將洗脫級分收集在含有50μl 1M TRIS-HCl，pH9.0的管中。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(4-12％NuPAGE；Invitrogen)鑒定含有fH的級分。使用1x MES運行緩沖液(Invitrogen)在200V下進行電泳45分鐘。通過用考馬斯G-250(SimplyBlue SafeStain；Invitrogen)染色顯現蛋白質。匯集含有fH的級分，并針對PBS透析，并在使用前將fH的等份試樣儲存在-30℃。

fHbp突變體的表征

SDS-PAGE。通過使用4-12％聚丙烯酰胺梯度凝膠(NuPAGE；Invitrogen，Inc.)的SDS-PAGE評估純化的fHbp突變體蛋白的大小和純度。將2μg的每種蛋白質上樣到凝膠上。如上對fH所述進行SDS-PAGE。

通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)使fH結合至fHb。用2μg/ml純化的重組野生型fHbp(陽性對照)或突變體fHbp(實驗)涂覆96孔微量滴定板(Immulon 2HB；Thermo Scientific)的孔。用含有1％BSA(Lifeblood Medical，Inc.)或5％脫脂奶粉(Carnation；Nestle，Inc.)的PBS封閉對孔的非特異性結合。向稀釋緩沖液(含有0.1％Tween-20、0.01％疊氮化鈉和1％BSA的PBS)中的純化人fH的5倍連續稀釋液(范圍為25至0.0016μg/ml)加入孔中，并且在室溫下溫育2小時。用含有0.1％Tween-20(Sigma)和0.01％疊氮化鈉(Sigma)的PBS洗滌三次后，用稀釋緩沖液中的綿羊抗人fH(1:7,000；Abcam，Inc.)檢測結合的fH。將板在室溫下溫育1小時。再次洗滌孔后，用稀釋緩沖液中與堿性磷酸酶綴合的驢抗綿羊IgG(1:5,000；Sigma-Aldrich，Inc。)檢測結合的一抗。將板在室溫下溫育1小時，并再次洗滌孔。用在底物緩沖液(50mM碳酸鈉，1mM MgCl₂，pH 9.8)中的磷酸酶底物(1mg/ml磷酸對硝基苯酯；Sigma)顯色ELISA。在室溫下溫育30分鐘后，在UV-VIS讀板儀(Spectromax 190；Molecular Devices，Inc.)中測量405nm處的吸光度。

通過ELISA使抗fHbp單克隆抗體結合至fHbp。用fHbp涂覆微量滴定板的孔，并如上文針對fH ELISA所述進行封閉和洗滌。加入在稀釋緩沖液中的25至0.0016μg/ml的鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)的5倍連續稀釋液，并且將板在室溫下溫育1小時。在洗滌孔后，用與堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG(1；5,000；Sigma-Aldrich)檢測一抗。如上所述開發和讀取ELISA。

通過表面等離振子共振(SPR)使fH結合至fHbp。在Biacore X100Plus儀器(GE Life Sciences)上進行SPR實驗。使用胺偶聯試劑盒(GE Life Sciences)將3000個響應單位的純化的人fH偶聯至CM5芯片(GE Life Sciences)。將fH固定在流動池2中，并且在流動池1中進行空白固定(無fH)作為參考。進行由含有3mM EDTA和0.05％表面活性劑P-20(GE Life Sciences)的HEPES緩沖鹽水組成的三個啟動循環和用100mM甘氨酸，3M NaCl，pH 2.0再生以使芯片表面條件化。注射范圍為100至1nM(野生型)或316至3.16nM的純化的重組fHbp的稀釋液150秒。監測解離300秒，并用Biacore X100評估軟件分析數據。

小鼠免疫原性。用吸附有氫氧化鋁的fHbp疫苗免疫野生型CD-1小鼠(N＝14至21)的組。每劑疫苗在10mM組氨酸，150mM NaCl，pH6.5中含有10μg fHbp和600μg Alhydrogel(Brenntag Biosector)。間隔三周給予兩劑，并且在第二劑后三周通過心臟穿刺收集血液。處理血液以獲得血清，將其保持在-80℃長期儲存(>2周)或4℃短期儲存(<2周)。

首先篩選人fH轉基因BALB/c小鼠，以使用fHbp ELISA和純化的人fH的標準曲線鑒定血清人fH濃度>240μg/ml的動物。使用固定在板上的純化的fHbp ID 1進行ELISA，并且檢測fH的一抗和二抗與上述相同(參見“通過ELISA使fH結合至fHbp”)。

用吸附有氫氧化鋁(與上述野生型CD-1小鼠相同量的抗原和佐劑)的fHbp疫苗免疫轉基因小鼠(N＝11至21)組。以三周的間隔施用三劑，并在第三劑疫苗后三周收集血液。如上所述處理和儲存血清。

血清殺菌抗體(SBA)應答。針對具有與相應疫苗抗原相比相同或緊密匹配的fHbp序列的腦膜炎球菌菌株測量人補體介導的SBA應答。在常規弗朗茨(Frantz)培養基中生長細菌(Frasch等人，“Outer membrane protein vesicle vaccines for meningococcal disease.”于Methods in Molecular Medicine，v.66.Meningococcal Vaccines:Methods and Protocols.中由Pollard，A J.和Maiden，M.C.編Humana Press Inc.Totowa，NJ)，其含有4mM乳酸鹽和0.02mM CMP-NANA至指數中期(OD620nm＝0.6)。將細菌在含有1％BSA(Equitech Bio.)的Dulbecco氏PBS中以1:25,000稀釋。人補體來自沒有內在殺菌抗體的供體，并使用HiTrap Protein G柱(5ml；GE Life Sciences)耗盡IgG抗體。每個反應物含有25％人補體、約400cfu的細菌和測試抗血清或對照抗體的稀釋液。將SBA滴度計算為血清稀釋度，其導致在37℃下溫育60分鐘后相對于陰性對照孔的cfu的50％減少。蛋白質純化：在大腸桿菌中表達具有C末端六組氨酸標簽的重組fHbp，并通過金屬螯合物色譜(HiTrap螯合HP；GE Life Sciences)，然后通過離子交換色譜(HiTrap SP；GE Life Sciences)純化。使用MES運行緩沖液(Invitrogen)在4-12％NuPAGE凝膠(Invitrogen)上分離蛋白質(各2μg)，并用考馬斯藍染色(Simply Blue Safe Stain；Invitrogen)顯色。

結果

開發了基于隨機突變體文庫的方法來鑒定具有降低的人fH結合的fHbp突變體。該方法能夠鑒定可能不能基于單獨的結構信息預測的導致fH結合減少的突變，并且能夠在任何給定位置處產生多個氨基酸取代。這種方法與在選定位置處的丙氨酸取代的常見方法形成對比，所述常見方法有時導致fH結合的少量減少。

使用隨機突變體文庫方法，我們鑒定了五種有希望的新型fHbp ID 1突變體。圖1中顯示了純化的重組突變體fHbp ID 1抗原Q38R、E92K、R130G、S223R和H248L。

圖1：fHbp ID 1突變體的純度。在大腸桿菌中表達具有C末端六組氨酸標簽的重組fHbp，并通過金屬螯合物色譜(HiTrap Chelating HP；GE Life Sciences)，然后通過離子交換色譜(HiTrap SP；GE Life Sciences)純化。使用MES運行緩沖液(Invitrogen)在4-12％NuPAGE凝膠(Invitrogen)上分離蛋白質(各2μg)，并用考馬斯藍染色(Simply Blue Safe Stain；Invitrogen)顯色。泳道1，Kaleidoscope分子量標志物(Bio-Rad Laboratories)；2，fHbp ID 1野生型；3，Q38R；4，E92K；5，R130G；6，S223R；7，H248L。

這些突變體表現出范圍為約10倍(R130G)至約20倍(Q38R)至約100倍(E92K、S223R和H248L)的fH結合降低(圖2)。

圖2A和2B。通過ELISA使fHbp ID 1突變體結合至fH。用純化的重組ID 1野生型(WT)或六種不同的突變體蛋白之一涂覆微量滴定板的孔。將不同濃度的純化的人fH加入孔中。用綿羊抗人fH(Abcam)和與堿性磷酸酶綴合的驢抗綿羊IgG(Sigma)檢測結合的fH。A，陽性對照fHbp ID 1野生型(WT)蛋白，具有人fH的高結合。陰性對照fHbp ID 1R41S突變體，具有fH的低結合。B，具有減少的fH結合的新型fHbp ID 1突變體。R130G突變體顯示中等的fH結合，Q38R顯示低結合，并且E92K、S223R和H248L顯示顯著低于R41S結合的結合。顯示了重復測量的平均值和標準偏差。

從表面等離振子實驗獲得了fH與突變體蛋白的結合減少的類似模式，其中R130G和Q38R突變體顯示一些結合，而其它三個突變體顯示不可檢測的結合(圖3A和3B)。

圖3A-3E。通過表面等離振子共振得到的fHbp ID 1突變體的fH結合。將3000個響應單位的純化的人fH偶聯到CM5芯片(GE Life Sciences)，并注射316nM純化的重組fHbp 150秒。用于參考，在每個圖中顯示了ID 1野生型(WT)蛋白的相同數據。觀察到與ELISA中相同的結合模式(圖2，上文)；R130G突變體的對fH的中等結合，Q38R的低結合和E92K、S223R和H248L的非常低的結合。所有實驗采用HBS-EP運行緩沖液和Biacore X100Plus表面等離振子共振儀。用Biacore X100評估軟件分析數據。

所有五種突變體fHbp ID 1蛋白保留了被抗fHbp單克隆抗體識別的構象性表位。五種抗fHbp單克隆抗體與野生型或突變體fHbp的濃度依賴性結合顯示于圖4中。

圖4A-4E。如通過ELISA測量的鼠抗fHbp單克隆抗體與fHbp突變體蛋白的結合。抗fHbp單克隆抗體的類似的濃度依賴性結合表明野生型和突變體fHbp以相似的量存在于微量滴定板的孔中，并且突變體fHbp保留由五種不同單克隆抗體識別的構象性表位。二抗是與堿性磷酸酶(Sigma)綴合的山羊抗小鼠IgG。顯示了重復測量的平均值和標準偏差。

突變體蛋白也保留類似于野生型fHbp ID 1的熱穩定性，除了E92K突變體，其具有稍微降低的穩定性。最后，當針對血清群B菌株H44/76進行測試時，突變體在野生型CD-1小鼠中引發相似的殺菌性抗體應答(圖5A-5B)。

圖5A和5B。小鼠中對fHbp ID 1突變體的殺菌性抗體應答。圖5A，用兩劑的以三周間隔給予的純化的重組fHbp(10μg/劑量)腹膜內免疫12至14只野生型小鼠的組。在第二劑后三周獲得血清。使用IgG耗盡的人血清作為補體來源和血清群B菌株H44/76作為測試菌株來測量血清殺菌活性。H44/76表達fHbp ID 1，其與對照fHbp ID 1WT疫苗匹配。每個符號代表單個小鼠的滴度，并且水平條表示幾何平均滴度。WT組和每個突變體組之間的差異沒有統計學顯著差異(通過t檢驗，p>0.4)。圖5B，用三劑以三周間隔給予的純化的重組fHbp(每劑10μg)腹膜內免疫14至15只人fH轉基因小鼠的組。在第三劑后三周獲得血清。如上對野生型小鼠所述測量血清殺菌活性。

圖6A和6B。通過ELISA使人fH結合至fHbp ID 1單突變體和雙重突變體。如上對于圖2A-2B所述進行實驗。圖7。小鼠中對fHbp ID 1單突變體和雙重突變體的殺菌性抗體應答。對20只野生型小鼠的組進行免疫，并如上文針對圖5A所述測定血清殺菌性抗體應答。

實施例2：fHbp ID 55突變體的表征

材料和方法

如實施例1所述進行實驗。

結果

也在fHbp ID 55中構建在fHbp ID 1中鑒定的三種有希望的突變體；這些包括E92K、S223R和H248L。所有三種fHbp ID 55突變體都顯著降低了fH的結合(圖8A)。突變體保留了構象完整性，如通過鼠抗fHbp單克隆抗體JAR 41的結合所判斷的(圖8B)。

圖8A和8B。fHbp ID 55突變體的fH結合。A.通過ELISA得到的fH與固定的fHbp ID 55突變體的結合。如圖2的圖例中所述進行實驗。顯示了二至四次重復的平均值和范圍。B.抗-fHbp單克隆抗體(mAb)JAR41的濃度依賴性結合表明重組fHbp以相似的量存在于微量滴定板的孔中，并且保留了由JAR41(N-末端結構域；Vu等人(2012)Sci.Reports，同上)識別的表位區域中的構象。二抗是與堿性磷酸酶(Sigma)綴合的山羊抗小鼠IgG。

圖9。野生型小鼠中對fHbp ID 55突變體的殺菌性抗體應答。對12只小鼠的組進行免疫，并如上文針對圖5A所述測定血清殺菌性抗體應答。針對表達fHbp ID 55的菌株H44/76的突變體測量殺菌活性。

圖10A，人fH轉基因小鼠對fHbp ID 55S223R突變體的殺菌性抗體應答。使用三劑純化的重組fHbp(12μg/劑量)或含有總共12μg fHbp的經許可的Trumenba(Pfizer)疫苗的人劑量的十分之一免疫11至12只轉基因小鼠的組。免疫轉基因小鼠，并如上文對于圖5B所述測定血清殺菌性抗體應答。圖10B，野生型和人fH轉基因小鼠中與血清人fH濃度相關的對Trumenba的殺菌性抗體應答。如前所述(Beernink等人(2011)Journal of Immunology 186(6)：3606-14)通過ELISA測量血清人fH濃度。

實施例3：fHbp ID 22突變體的鑒定和表征

材料和方法

如實施例1中所述進行實驗。

結果

使用fHbp ID 22(其在變體組2(亞家族A)中)進行具有減少的fH結合的隨機fHbp突變體的獨立搜索。該篩選產生了六個有希望的新型突變體(圖17)。通過ELISA使fH結合至ID 22野生型和前述D211A突變體示于圖11A中。與六種新型突變體ID 22蛋白的fH結合示于圖11B中。

圖11A-11D。fHbp ID 22文庫突變體的fH結合。圖11A，具有人fH的高結合的陽性對照fHbp ID 22野生型(WT)蛋白。具有fH的低結合的陰性對照fHbp ID 22D211A突變體。圖11B，具有fH結合減少的新型fHbp ID 22突變體。所有突變體顯示低結合，并且V131D顯示與D211A類似的非常低的結合。如圖2的圖例中所述進行實驗。顯示了2至4個重復的平均值和范圍。圖11C，fH濃度高達100μg/ml的fHbp ID 22突變體子集的fH結合。圖11D，抗-fHbp單克隆抗體JAR4與突變體的子集(與圖11C中使用的相同的符號)的結合。新型突變體K219N保留JAR4結合，而G220S突變體具有降低的JAR4結合。所有突變體具有與另一抗fHbp單克隆抗體JAR31的正常結合(數據未顯示)。顯示了重復測量的平均值和標準偏差。

野生型CD-1小鼠對新型突變體V131D和K219N以及對照野生型ID 22蛋白和先前表征的突變體D211A的殺菌性抗體應答顯示于圖12中。

圖12A-12B。野生型小鼠中對fHbp ID 22文庫突變體的殺菌性抗體應答。選擇具有人fH的低結合的文庫突變體用于免疫。使用以三周的間隔給予的兩劑的純化的重組fHbp(10μg/劑量)對10至21只小鼠的組進行免疫。在第二劑后三周獲得血清。使用IgG耗盡的人血清作為補體源和血清群B菌株CH597作為測試菌株測量血清殺菌活性。該菌株表達fHbp ID 23，其與對照fHbp ID 22WT疫苗緊密匹配。圖12A，測試新型突變體V131D和K219N的實驗。D211A突變體用作不降低免疫原性的對照突變體fHbp疫苗。每個符號代表單個小鼠的滴度，并且水平條表示幾何平均滴度。圖12B，測試新型突變體D121G、S128T、F129S和G220S的第二實驗。除了V131D的適度損失之外，對于新型突變體fHbp沒有觀察到免疫原性的顯著損失。

圖13。人fH轉基因小鼠中對fHbp ID 22文庫突變體K219N的殺菌性抗體應答。對照突變體D211A給出更高的應答，并且K219N突變體產生類似于fHbp ID 22野生型(WT)抗原的應答。

圖14。通過差示掃描微量熱法測量的fHbp ID 22的熱穩定性。fHbp ID 22野生型(WT，實線)在38(N-末端)和81℃(C-末端結構域)經歷解折疊轉化。與ID 22WT相比，fHbp ID 22L130R/G133D雙重突變體表現出高19℃的N末端結構域熱穩定性。

圖15A-15B。fHbp ID 22三重突變體，其組合穩定取代L130R和G133D(雙重突變體，DM)與文庫來源的突變體以降低fH結合。A，fH對fHbp ID 22三重突變體的結合。B，對照鼠抗fHbp單克隆抗體(mAb)JAR4結合(與圖A中相同的符號。所有穩定的突變體比fHbp ID 22WT更好地結合JAR 4。

圖16。人fH轉基因小鼠中對fHbp ID 22三重突變體的殺菌性抗體應答。所測試的兩種突變體分別將穩定性雙重突變體(DM)與K219N和G220S組合。三重突變體引起比對照ID 22WT抗原高8倍和18倍的應答。

在圖17中的表中呈現上文所述的示例性fHbp ID 1和ID 22突變體的概述。

盡管已經參考本發明的具體實施方案描述了本發明，但是本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明的真實精神和范圍的情況下，可以進行各種改變并且可以替換等同物。另外，可以進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、過程、一個或多個過程步驟適應本發明的目的、精神和范圍。所有這些修改都在所附權利要求書的范圍內。

序列表

<110> P·T·比爾寧克

<120> 因子H結合蛋白變體及其使用方法

<130> CHOR-076WO

<150> US 62/028,123

<151> 2014-07-23

<160> 28

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 255

<212> PRT

<213> 腦膜炎奈瑟氏球菌

<400> 1

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

 20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

 35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

 85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

 100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

 115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

 165 170 175

Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

 180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile

 195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

 245 250 255

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> 腦膜炎奈瑟氏球菌

<400> 2

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

 20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

 35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

 85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

 100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

 115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly

 165 170 175

Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

 180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

 195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 3

<211> 260

<212> PRT

<213> 腦膜炎奈瑟氏球菌

<400> 3

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp

1 5 10 15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

 20 25 30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

 35 40 45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn

50 55 60

Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg

65 70 75 80

Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu

 85 90 95

Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr

 100 105 110

Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met

 115 120 125

Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr

130 135 140

Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp

 165 170 175

Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro

 180 185 190

Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys

 195 200 205

His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys

210 215 220

Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu

 245 250 255

Ala Ala Lys Gln

260

<210> 4

<211> 1231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1 5 10 15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

 20 25 30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

 35 40 45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met

50 55 60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65 70 75 80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

 85 90 95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

 100 105 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

 115 120 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

130 135 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145 150 155 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

 165 170 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

 180 185 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

 195 200 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

210 215 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225 230 235 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

 245 250 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

 260 265 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

 275 280 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

290 295 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305 310 315 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

 325 330 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

 340 345 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

 355 360 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

370 375 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385 390 395 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

 405 410 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

 420 425 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

 435 440 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

450 455 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465 470 475 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys

 485 490 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

 500 505 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

 515 520 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

530 535 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

 565 570 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

 580 585 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

 595 600 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

610 615 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625 630 635 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

 645 650 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

 660 665 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

 675 680 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

690 695 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705 710 715 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

 725 730 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

 740 745 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

 755 760 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

770 775 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785 790 795 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

 805 810 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

 820 825 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

 835 840 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

850 855 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865 870 875 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

 885 890 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

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Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

 915 920 925

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930 935 940

Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe

945 950 955 960

Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu

 965 970 975

Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu

 980 985 990

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1070 1075 1080

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1100 1105 1110

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr

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1130 1135 1140

Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln Trp Ser

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Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile

1160 1165 1170

Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys

1175 1180 1185

Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg

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Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys

1205 1210 1215

Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg

1220 1225 1230

<210> 5

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

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 115 120 125

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Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

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Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

 165 170 175

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 180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile

 195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

 245 250 255

<210> 6

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

 20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

 35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

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Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

 180 185 190

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<212> PRT

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<220>

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<400> 19

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<220>

<223> 合成多肽

<400> 20

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<210> 21

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 21

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1 5 10 15

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 20 25 30

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50 55 60

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Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

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Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

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<210> 22

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 22

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Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 23

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 23

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1 5 10 15

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245 250

<210> 24

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 24

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

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Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

 100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

 115 120 125

Phe Arg Val Ser Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly

 165 170 175

Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

 180 185 190

Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

 195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Ser Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 25

<211> 174

<212> PRT

<213> 腦膜炎奈瑟氏球菌

<400> 25

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala

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 85 90 95

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 100 105 110

Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile Gly Leu Gly

 115 120 125

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130 135 140

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165 170

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 26

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1 5

<210> 27

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 27

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1 5

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 28

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1 5 10