專利名稱：失活無脂質被膜病毒的方法
本申請的主題是失活存在于源自血液、血漿或類似天然來源物的含蛋白質組合物中的無脂質被膜病毒的方法。
EP0131740B1公開了失活含不穩定蛋白質之組合物中病毒的方法。待失活的病毒含有脂質，并特別可具有脂質被膜。待除去的含脂質病毒的組合物得自天然來源物，所說的天然來源物可選自全血、血漿、血漿濃縮物、這些血漿的任何分級分離部分的沉淀物、這些血漿的任何分級分離部分的上清液、血清、冷沉淀物、細胞溶胞產物、血細胞中誘生的蛋白質、并非衍生于血液的正常細胞或腫瘤細胞的產物、或基因切接過程的產物。EP0131740B1中記載的方法在于，使含有不穩定蛋白質的組合物與有效量的磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯接觸一段足夠長的時間，以使含不穩定蛋白質的組合物中沒有含脂質病毒而又不造成蛋白質的實質性變性。上述失活含脂質病毒的方法可與在50至70℃下加熱至少5小時的加溫處理步驟相結合。
但在上述類型的制品中，格外重要的是，也要失活那些不含任何脂質的病毒，特別是無脂質被膜病毒。據EP0131740B1認為是不含質脂病毒的那類非脂質被膜病毒包括甲型肝類病毒、細小病毒如細小病毒B19，以及脊髓灰質炎病毒。這些病毒可作為病原體存在于血液、血漿、血清、冷沉淀物、細胞溶胞產物及類似天然來源物中。
本發明的目的是提供一種允許失活不含脂質被膜或只含很少脂質并存在于某些制品中之病毒的方法。屬于這樣的制品之列的尤其是來源于全血、血漿、血漿濃縮物、這些血漿的任何分級分離部分的沉淀物、這些血漿的任何分級分離部分的上清液、血清、冷沉淀物、細胞溶胞產物、或其他類似天然來源物的含不穩定性蛋白質的組合物。
令人驚奇的是，這一目的可用一種失活存在于含蛋白質并來源于血液、血漿或類似天然來源物的組合物中病毒，特別是那些無脂質被膜的病毒的方法而實現的，在所述方法中，同時或相繼地用有效量的磷酸二烷基或三烷基酯和必要時的潤濕劑，在55℃至67℃范圍的加溫條件下將所述來源物處理5至30小時。
磷酸二烷基或三烷基酯的量優選在0.001％至1％之間。為實施該方法，溫度以調節在60℃至65℃為佳。加溫處理時間以至少10小時為佳。
其中不含脂質的病毒應予失活的蛋白質分級分離部分尤其來源于上述各種類型的天然來源物，并且尤可在失活反應之前用沉淀法或色譜分離法富集相應的蛋白質。
業經證明，在富集蛋白質時，使用如EP0367840A1中所述的色譜分離法來富集蛋白質分級分離部分是特別可行的。色譜分離時，首先對提供蛋白質的天然來源物經進行陰離子交換色譜分離。已證明用二乙氨基乙烯基團改性的色譜分析底物材料是特別有用的。
然后，經加溫處理和用磷酸二烷基或三烷基酯處理，對天然來源物或從天然來源物中富集起來的分級分離部分進行上述病毒失活方法。
業經證實，在潤濕劑存在下用磷酸二烷基或三烷基酯進行所述處理是有利的。可用的磷酸烷基酯特別是EP0131740B1中提到的磷酸酯，例如包括有含1至10個碳原子，尤其是含2到10個碳原子的烷基的磷酸二烷基酯或三烷基酯。尤其可用諸如磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三(2-乙基己基)酯及磷酸三正癸酯之類的磷酸三烷基酯。混合的磷酸三烷基酯也是適用的。類似地，也可以使用取代的相應磷酸二烷基酯或者相應磷酸二烷基或三烷基酯的混合物。
潤濕劑尤可使用無毒的洗滌劑。應以至少0.1％(重量)的量存在的非離子型洗滌劑，可列舉下列衍生物脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、山梨醇酐的偏酯，例如已知商品名為吐溫80、吐溫20和多乙氧基醚80的產品，以及油溶性非離子型潤濕劑，特別是己知商品名為TritonX100(乙氧基化的烷基苯酚)的產品。也可以使用兩性離子試劑，例如磺基甜菜堿類(Sulfobetaine)，如N-十二烷基-N，N-二甲基-2-銨基(ammonio)-1-乙磺酸鹽或其衍生物，或者非離子型洗滌劑如辛基-β-D-吡喃葡糖苷。潤濕劑的量優選為0.01％至10％。
特別優選的是結合使用磷酸三正丁酯和吐溫，或膽酸鈉/TNBP(磷酸三正丁酯)。
證實有利的是，在蔗糖、山梨醇或短鏈中性氨基酸之類的輔助物質存在下，在加溫下進行該處理。原則上，可以以所述量使用EP0018561和/或DE4001451A1中提到的穩定化因子。輔助物質(穩定化因子)的濃度可以很高，例如蔗糖濃度優選至多達200％(重量)。短鏈氨基酸可以尤其使用甘氨酸、賴氨酸和/或精氨酸。
已出乎預料地證實的是，在加溫下即使不加入鈣離子亦可進行對來源于血液、血漿或類似天然來源物的含蛋白質組合物的處理。在EP0106269中，認為必須加入鈣離子。因此，EP0106269公開了在其中所述的巴氏消毒處理法中用Ca2+穩定抗血友病冷沉淀物分級分離部分。而根據本發明這是不必要的。
即使在加溫下，用磷酸二烷基或三烷基酯處理后，也可接著進行色譜分離純化步驟。該色譜分離純化步驟優選在陰離子交換材料，如DEAE改性的離子交換樹脂上進行。pH值應在6至8.5范圍內。
以此方法富集或得到的醫藥上有價值的蛋白質，如因子VIII、因子IX、血纖維蛋白原、r-球蛋白等不含甲型肝類病毒、細小病毒如細小病毒B19，或脊髓灰質炎病毒這類活性病毒。
下面用失活因子VIII制品中無脂質病毒的實施例來更為詳細地闡明本發明的方法。
實施例1將商業上通用的冷沉淀物加到裝有Fractogel-DEAE-樹脂的柱上。收集洗脫液并檢查因子VIII活性。然后，用含有110mM氯化鈉、10mM檸檬酸鈉×5H2O、120mM甘氨酸、1mM氯化鈣×2H2O，pH為6.9至7.0(用1M HCl調pH)的緩沖液洗柱。然后，再用組成如下的緩沖液處理柱250mM氯化鈉、20mM檸檬酸鈉×5H2O、80mM甘氨酸、16mM賴氨酸、2.5mM氯化鈣×2H2O，pH為6.9至7.0。
向如此得到的分級分離部分中加入蔗糖。然后，加入磷酸三正丁酯/吐溫(0.1％/0.3％)并于64℃保持12小時。繼之再在TSK-Fractogel0-DEAE或EMD-Fractogel-TMAE柱上進行離子交換色譜分離。
用含有250mM氯化鈉、20mM檸檬酸鈉×5H2O、80mM甘氨酸、16mM賴氨酸、2.5mM氯化鈣×2H2O的緩沖液洗脫因子VIII活性餾份。
實施例2通過在加溫處理前，緩沖液(洗滌緩沖液和洗脫緩沖液)中未加含鈣化合物的情況下，按實施例1中所述方法處理商業上通用的冷沉淀物，在沒有鈣離子的條件下進行病毒失活。然后，在未添加鈣離子的情況下進行加溫處理，再按實施例1中所述方法作進一步加工。
權利要求
1.失活存在于源自血液、血漿或類似天然來源物之含蛋白質組合物中的病毒，特別是無脂質被膜的病毒的方法，其中同時或相繼用有效量磷酸二烷基或三烷基酯及必要時的潤濕劑在55℃至67℃范圍的加溫條件下將所述來源物處理5小時至30小時。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述磷酸二烷基或三烷基酯的量在0.001％和1％之間。
3.根據權利要求1和/或2所述的方法，其中所述溫度在60℃和65℃之間。
4.根據權利要求1至3中至少一項所述的方法，其中所述加溫處理時間至少為10小時。
5.根據權利要求1至4中至少一項所述的方法，其中首先用色譜分離法或沉淀方法從所述天然來源物中富集所述蛋白質。
6.根據權利要求1至5中至少一項所述的方法，其中在用磷酸二烷基或三烷基酯處理并同時在加溫下處理之前，加入輔助物質，例如蔗糖、山梨醇或短鏈中性氨基酸。
7.根據權利要求6的方法，其中所述蔗糖的濃度至多為200％(重量)。
8.根據權利要求6和/或7的方法，其中所述的氨基酸采用甘氨酸、賴氨酸和/或精氨酸。
9.根據權利要求1至8中至少一項所述的方法，其中所述加溫處理在未添加鈣離子條件下進行。
10.根據權利要求1至9中至少一項所述的方法，其中用所述磷酸二烷基或三烷基酯處理并同時加溫處理之后接著再進行色譜分離法提純步驟。
11.根據權利要求1至10中至少一項所述的方法，其中在所述以磷酸二烷基或三烷基酯和加溫處理中，pH值為6.0至8.5。
全文摘要
失活存在于源自血液、血漿或類似天然來源物之含蛋白質組合物中的病毒，特別是無脂質被膜的病毒的方法，其中同時或相繼以有效量磷酸二烷基或三烷基酯及必要時的潤濕劑在55℃到67℃范圍的加溫條件下將所述來源物處理5小時至30小時。
文檔編號C07K14/435GK1118144SQ94191261
公開日1996年3月6日 申請日期1994年2月5日 優先權日1993年2月9日
發明者M·施塔德勒, H·施溫, D·紐西克, W·吉林格, F·巴爾 申請人:奧克塔法馬有限公司