帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用圖
【專利說明】帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用途
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于水產品精深加工技術的產品用途領域，尤其涉及一種帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用途。
[0003]
【背景技術】
[0004]膠原肽是采用酶切技術從膠原蛋白中制備的平均分子量在I 000 Da左右的水解產物，相對膠原蛋白復雜的三級超螺旋結構，膠原肽的線狀結構使其無需分解即可被人體吸收利用，消化吸收率高達80%。相對于膠原蛋白等大分子物質，膠原肽可以有效滲入真皮層，延長皮膚細胞壽命、抵抗自由基對DNA的攻擊、抑制細胞膜脂質過氧化、促進膠原蛋白和透明質酸的合成、提高皮膚免疫力和保水能力等多種作用，使其成為藥品、保健品和日化產品領域所競相關注的焦點。
[0005]鐵是人體需要量最多的微量元素，其生理作用主要有:構成血紅素，預防貧血；參與細胞色素合成，調解組織呼吸和能量代謝；維持機體的免疫力和抗感染能力。而缺鐵會導致食欲不振，煩躁不安，活動后呼吸急促、脈搏加快，還可有肝、脾腫大，貧血或者血象障礙；兒童缺鐵可出現偏食、異食癖、智力下降、易怒不安、易發生感染等癥狀。據聯合國兒童基金會統計，全球約有37億人缺鐵，發展中國家40%?50%的5周歲以下兒童和超過50%的孕婦患缺鐵病。因此，合理補鐵和提高鐵的體內吸收率至關重要。現有研宄證明而鐵與金屬螯合肽形成的螯合鹽，即可促進鐵的吸收，同時又能滿足機體對活性肽、氨基酸等的需求，是比較理想的補鐵物質。
[0006]帶魚在我國的渤海、黃海、東海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊并稱為中國的四大海產。但是帶魚加工過程中產生的魚骨多數加工成魚骨粉或者作為廢棄物丟掉，浪費的寶貴的漁業資源。經檢索，以帶魚魚骨膠原蛋白制備鐵螯合膠原肽未見報道。基于此，本發明根據鐵螯合膠原肽和帶魚魚骨的利用現狀，提供一種具有金屬鐵螯合活性的膠原肽，并提供這種鐵螯合膠原肽的制備方法。

【發明內容】

[0007]本發明所要解決的技術問題所采取的技術方案為:帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用途，其根據多肽與金屬離子螯合的理論基礎，以及多肽-Fe螯合物在補鐵上的顯著優點，以帶魚魚骨為原材料，通過對復合風味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解條件控制，制備具有高Fe螯合活性的膠原肽。本發明可為補鐵藥物和功能產品開發，以及帶魚魚骨的高值化利用提供技術支持。該帶魚魚骨鐵螯合膠原肽氨基酸序列為Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly (GPPGPffGPHG), ESI/MS檢測分子量為957.99 Da Da。該帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備方法，包括以下步驟: I)帶魚魚骨的預處理:將帶魚魚骨按照料液比I g: 15?20 mL加入到NaOH溶液(0.1mol/L)于I?4°C下浸泡2?4 h，脫除非膠原蛋白；處理后帶魚魚骨用蒸餾水反復洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 5?8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液(0.5 mol/L),于I?4°C下浸泡2?3天(每天更換I次EDTA溶液)，蒸餾水洗滌2?3次，干燥、粉碎，得脫鈣帶魚魚骨粉。
[0008]2)帶魚魚骨膠原蛋白的制備:將脫鈣帶魚魚骨粉按照料液比I g:5?8 mL加入到
0.5 mol/L乙酸溶液并在I?4°C下動態浸泡3 d，10 000貧離心20?25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0 mol/L，靜置60?90 min, 12 OOO1^離心25?30 min得沉淀物，冷凍干燥即為帶魚魚骨膠原蛋白。
[0009])帶魚魚骨膠原蛋白的酶解:將帶魚魚骨膠原蛋白按照料液比Ig: 20?25 mL加入到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0,0.2 mol/L)，按照膠原蛋白質量的1.5?2.0%向溶液中加入復合風味蛋白酶(I 000 LAPU/g)，于溫度45?50°C酶解4?6 h后，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，冷卻至45?50°C ;按照膠原蛋白質量的1.2?1.5%向溶液中加入中性蛋白酶(1.0X 15 U/g)，于溫度45?50°C下酶解4?6 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，8 OOOg離心25?30min，取上清液，即為酶解產物；
5)帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備:將制備的酶解產物采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經固定化鐵離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚骨鐵螯合膠原肽。
[0010]作為優選，所述步驟I)的帶魚為帶魚(TricAiwiw1S haumela)0
[0011]作為優選，所述步驟5)的固定化鐵離子親和層析和RP-HPLC純化的具體過程為: 固定化鐵離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為10?20 mg/mL的溶液，經過固定化鐵離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用5?8倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附多肽，然后用3?5倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對鐵離子的螯合活性得I個高Fe螯合活性膠原肽Gly-P1-P1-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly (GPPGPffGPHG)0
[0012]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 μ L ;色譜柱Zorbax C18 (250 X4.6mm, 5 μπι);流動相25%乙腈；洗脫速度1.0?1.5 mL/min ;紫外檢測波長214 nm。
[0013]
【附圖說明】
[0014]圖1是本發明的固定化鐵離子親和層析酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0015]
【具體實施方式】
[0016]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017]一種帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備方法，制備工藝流程如下:帶魚魚骨〃膠原蛋白提取〃酶解〃酶解物〃超濾〃親和層析"RP-HPLC純化〃鐵螯合膠原肽。
[0018]實施例:
I)帶魚魚骨的預處理:將帶魚(CAiwiw1S魚骨按照料液比I g: 20 mL加入到NaOH溶液(0.1 mol/L)于2°C下浸泡4 h，脫除非膠原蛋白；處理后帶魚魚骨用蒸餾水反復洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液(0.5 mol/L)，于3°C下浸泡3天(每天更換I次EDTA溶液)，蒸餾水洗3次，干燥、粉碎，得脫鈣帶魚魚骨粉。
[0019]2)帶魚魚骨膠原蛋白的制備:將脫鈣帶魚魚骨粉按照料液比I g:8 mL加入到0.5mol/L乙酸溶液并在4°C下動態浸泡3 d，10 OOO^離心25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0 mol/L，靜置90 min, 12 O00^離心30 min得沉淀物，冷凍干燥即為帶魚魚骨膠原蛋白。
[0020])帶魚魚骨膠原蛋白的酶解:將帶魚魚骨膠原蛋白按照料液比Ig:25 mL加入到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0,0.2 mol/L)，按照膠原蛋白質量的1.5%向溶液中加入復合風味蛋白酶(I 000 LAPU/g)，于溫度50°C酶解4 h后，將溶液升溫至90°C，并于此溫度保持10 min后，冷卻至50°C ;按照膠原蛋白質量的1.5%向溶液中加入中性蛋白酶(1.0XlO5 U/g)，于溫度50°C下酶解6 h，將溶液升溫至95°C，并于此溫度保持10 min后，8 OOOg離心30 min，取上清液，即為酶解產物；
5)帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備:將制備的酶解產物采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經固定化鐵離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚骨鐵螯合膠原肽。
[0021]①固定化鐵離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為10 mg/mL的溶液，經過固定化鐵離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用5倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附多肽，然后用3倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
②RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(條件:進樣量15 yL ;色譜柱Zorbax C18 (250 X 4.6mm，5 μπι);流動相25%乙腈；洗脫速度1.0 mL/min;紫外檢測波長214 nm)，根據對鐵離子的螯合活性得I個高Fe螯合活性膠原肽。
[0022]③結構檢測:收集Fe螯合活性最高的膠原肽經檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為 Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly (GPPGPffGPHG),ES I/MS檢測分子量為957.99 Da Da。
[0023]采用鄰菲羅啉比色法，測定帶魚魚骨鐵螯合膠原肽對鐵離子的螯合作用。測定結果表明:純化得到的鐵螯合肽 Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly (GPPGPffGPHG)對鐵離子的螯合能力為1.53 土 0.12 nmol/μπιο?，因而較為適合用于制備補鐵的保健食品或類似功能產品的鐵攜帶基材。
[0024]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用途，其特征在于所述的帶魚魚骨鐵螯合膠原肽用于制備補鐵藥物和功能產品的用途。
2.根據權利要求1所述的帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用途，其特征在于所述的帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly，ESI/MS檢測分子量為957.99 Da0
【專利摘要】本發明涉及一種帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的鐵螯合用途，該鐵螯合膠原肽由于其獨特的螯合和轉運機制，吸收利用度高，又可同時補充多肽/氨基酸和鐵，是一種理想的補鐵物質。其是以帶魚魚骨為原料，采用酸法提取膠原蛋白，利用復合風味蛋白酶和中性蛋白酶對膠原蛋白進行酶解，采用超濾、固定化鐵離子親和層析和反相高效液相色譜分離純化得到鐵螯合膠原肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly，ESI/MS檢測分子量為957.99Da。
【IPC分類】A23L1-304, A23L1-305, A61K33-26, A61P3-02, A61K38-39, A61P7-06
【公開號】CN104758925
【申請號】CN201510177278
【發明人】王斌, 遲長鳳, 鄧尚貴, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月15日