專利名稱：生產具有高脂質含量的藻生物質的方法
生產具有高脂質含量的藻生物質的方法本發明涉及一種生產具有高脂質含量的藻生物質的方法。更具體地說，本發明涉及一種基于培養系統如開放池與合適地結合有生物質加厚 系統的光反應器的組合，生產具有高脂質含量的藻生物質的方法。微藻目前培養用于生產高價值分子如多不飽和脂肪酸、維生素和膠凝劑，它們被 引入到營養、藥物和美容市場。藻生物質的最佳產品使用各種類型的培養系統，其在很大程度上取決于藻菌株和 氣候條件。在極其有利的溫度和光條件下，如在以色列和加利福尼亞，例如，可以成功地使 用開放池。相反地，在德國，使用安裝在溫室的管式反應器。在葡萄牙，開放池與光反應器 都使用。當培養具有嗜極端生物特性的藻種類如Dulaniella salina時，其能夠生長在鹽 濃度為10-15%的環境中，并因此抵抗許多外界形式的污染，也優選使用開放系統如開放 池。這對于能生長于淡水中的種類(為了避免污染問題，其可以在密閉的系統如光反應器 中培養)是不會發生的。用于營養，藥物和美容領域的藻的培養，特征在于相當有限的高價值產品生產能 力。為此，可以忍受相對昂貴的生產系統，如光反應器，但是用于生產在較低價值的商業領 域中使用的微藻的最廣泛使用的方法，如水培生產，是基于經濟的培養系統，如開放池。從其中微藻被傳統使用的上述領域到環境/能源領域，需要開發這樣的技術，以 便導致生產能力的巨大增加(以每年數百/數千噸到每年數百萬噸的數量級)和生產成本 的巨大降低(從幾百美元/公斤到幾百美元/噸)。可以通過旨在優化對生物學活性的輻射的吸收的巨大改善和對光抑制現象 (photo-inhibition phenomena)的降低以強烈增加葉綠素光合作用過程的效率的方式，來 實現培養系統的生產率目標。許多研究活動正在進行中，其目的在于優化不同培養系統的生物質生產率和增加 它的脂質含量。微藻的生產目前處于試驗階段，其目標是再循環工業設備釋放的CO2和生產生物 質，該生物質可以開發用于能源的目的，如例如，用于轉變成生物柴油的植物油。開發光反應器的努力仿佛不是解決性的，因為對宣稱的生產率增加存 在許多懷疑，另一方面，似乎不足以獲得必要的成本降低。(Rif.專利申請WO 03/094598〃 Photobioreactor and Process for Biomass Production and Mitigation of Pollutants in Flue Gases. Company Green Fuel Technology“)。此外，在涉及由藻生物質生產油類和它們的酯交換的總過程的文獻中沒有證據， 除了描述于2006年11月12-17日的AICHE年會中的“微藻油提取和原位酯交換”(Justin Μ· Ferrentino 禾口 Ihab H. Farag. Chemical Engineering，University of New Hampshire， Kingsbury Hall，33 College Road， Durham， NH 03824，在 New Hampshire University 進 行)的那些，其試圖避免借助于通常用于提取油類的有機溶劑，開發細胞壁破壞方法和隨 后的離心或原位酯交換。
目前發現了一種基于培養系統如開放池與合適地結合生物質增稠系統的光反應 器的組合的微藻的培養系統，其能保證高生產率，提供具有高脂質含量的生物質，防止微生 物污染，保持隨時間持續和穩定的生產。特別地，本發明的一個目標涉及一種生產具有高脂質含量的藻生物質的方法，其 包括，根據

圖1中顯示的方案(a)在光反應器中生產接種物以進行(b)階段；(b)在用(a)階段接種的開放池中大量培養藻生物質；(c)溫和地進行藻生物質的增稠階段；(d)脂質生產的誘導階段，其中使用包括光反應器或開放池的組件；(e)具有高脂質含量的生物質的分離階段。通過根據本發明的方法進行操作，以下是可能的i)培養具有高凈化度的物種，適于控制可能的外界污染(排空培養池并再接種相 同物種)；ii)培養微藻，限制光反應器的利用以單獨生產純物種的接種物，其具有隨之發生 的成本降低；iii)最小化達到通過誘導階段(C)生產脂質的誘導條件所必需的處理體積；通過 聯合使用光反應器與開放池的各種組件使該處理過程持續。iv)通過組合使用各種光反應器和開放池組件使該過程連續。用于生產接種物的(a)階段可以在具有各種形式和尺寸的光反應器中進行具有 圓柱形或橢圓形的線性管式反應器，平行六面體或圓柱形平面反應器，如描述于"Tredici M. R. (2004)Mass production of microalgae :photobioreactors. In Richmond A(ed.) Handbook of Microalgal Culture. Blackwell Publishing, Oxford (UK)，178-214 頁"中 的那些。后者是優選的，因為它們是通過塑料膜制成的并由簡單的外部金屬結構支撐的，因 此它們是便宜的。它們一般以約為1-2天的蓄水時間(hydraulic retention time)運行， 并導致大約2g干物質/升的生物質濃度。(a)階段的培養系統與(b)階段的培養系統的處 理體積之間的比例取決于當地的氣候條件和培養的藻菌株。該比例通常在0. 05-0. 15的范 圍內，優選等于0.1。獲得的培養物液體用于接種在不連續基礎上的培養系統(每天或每天多次)。可替代地，其可以在連續基礎上使用以增加(b)階段的開放池中藻生物質的濃 度，并因此防止發生外界污染現象。用必要的養份(必須的氮和磷鹽)重建的來自(C)階 段的水性再循環物料，用作為生長劑。水性補充液流可由待進行三級處理的工業廢水。在 這種情況下，藻培養代謝包含含于其中的氮和磷的物質，從而有助于它們的純化。由于CO2 是藻生長所必需的，因此可以使用工業廢氣(熱電、產氫設備，等等)中含有的C02。用于藻生長的(b)階段可發生在開放池中，開放池可以是圓形的和縱向的。優選 具有縱向形式的典型管道池。并且在這種情況下，蓄水時間是1-2天。它們的運行可以是 半連續的，早上對培養物液體進行取樣并進料生長劑(水和養份)，或以具有夜間中斷的連 續方式。后面的選擇，合適地與由藻生長指示計(光密度、葉綠素以及它們之間的可能比例 的測定)調控的培養系統的液位高度控制系統結合是優選的。在污染現象發生的情況中，可以定期凈化用于進行(a)階段和(b)階段的系統(水洗滌或用消毒劑的水溶液進行洗滌)。增稠生物質的(C)階段大大減少了處理體積(至少10倍)，使得光反應器的使用 有利或者急劇降低了池體積。通過在一般用于水處理廠的沉淀設備中的重力分離，來進行該階段。已經發現利 用陽離子聚電解質(也即聚丙烯酰胺)，以2-5ppm的量(大約1. 5小時通過0. 4-0. 5g/升 到40-50g/升的藻濃度)，大大促進了淡水藻菌株如例如柵藻屬種(Scenedesmus sp.)的沉淀。以獲得導致生物質的脂質級分含量增加的培養條件的目標進行用于細胞成熟的 (d)階段。在這方面，生長培養基將保持有限的氮，因此如果需要，來自(C)階段的液流將主 要結合磷源和可能的微量元素養份。可用于該階段的培養系統可包括開放池和光反應器。 來自(c)階段的液流中生物質濃度的形成，取決于選擇的熟化系統(以開放池為克/升，光 反應器為數十克/升的數量級)。利用那些與(C)階段中采取的系統類似的系統，來進行(e)階段。在被排放或者 再循環之前，凈化之后，可以使分離的水相直接送至終處理，以避免在整個系統中代謝產物 的積累。當藻培養不僅僅用于生產生物質，而且用于廢水凈化(三級處理)時，采用第一個 選擇。相反地，當廢水不可利用，而且需要限制對水的需求時，使用第二個選擇。凈化流通 常為通過分離產生的總水流的1到20%，優選等于10%。實施例1“利用每天的稀釋物進行半連續的培養”單藻物種異養小球藻(Chlorellasorokiniana)使用收集菌株異養小球藻，其一般生長在淡水中。如下制備待引入到以下描述的培養系統中的接種物-將之前于_85°C保藏在10%的甘油溶液中的單藻培養物樣品置于室溫下解凍， 然后離心以除去上清液。-將這樣獲得的細胞糊接種到3個含有50ml溶液的250ml燒瓶中，所述溶液含有養份。-使培養物生長于30°C恒溫的在空氣中存在0.5%的CO2的照明氣候室中。-大約一周以后，燒瓶達到0.2g/升的濃度，并且將該培養物用作接種物用于3個 含有500ml溶液的1升燒瓶中，所述溶液中含有養份，并置于人工氣候室中。-2天以后，培養物具有0. 4g/升的濃度，并形成用于實驗室實驗的5升Roux瓶的 接種物，用于制備隨后的實驗所必需的接種物。使用12個Roux瓶制備了總共60升的接種物(用于隨后的試驗，接種物相應地減 少到反應器的體積)，所述Roux瓶通過17，500Lux的鎢絲燈照明。從圓柱體提供生長所必 需的CO2，并以每個Roux瓶25升/小時的平均流量進料。隨時測定每個Roux瓶的pH，當 由于中和觀察到士0. 2單位的變化時，人工修改CO2的流量。培養基使用以下牛長培養基對所有的培養系統(燒瓶，roux瓶，光反應器，開放 池)進行試驗KNO31. 75g/ 升
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FeSO4 · 7H20MgSO4 · 7H20KH2PO4K2HPO4CaCl2
1. 25g/ 升 0. Ig/ 升 O.Olg/升 0.003g/ 升 1. 5g/ 升微量元素1ml/升的下列溶液每升H3BO3 2. 86g,MnCl2 ·4Η20 1. 8lg, CuSO4 ·5Η20 80mg, ZnSO4 7H20220mg, Na2MoO4 2IOmg，FeSO4 · 7H20 25g, EDTA 33. 5g 和 1 滴濃縮的 H2SO4。工作pH:7. 0。通過修改文獻中描述的典型培養基M4N獲得上述組成，用于微藻的培養。具體而 言，降低KNO3含量(從5. 0到1. 75g/升，在典型組成中，規定大幅過量的氮化化合物，從而 避免每天添加)，以0. Ig/升的量添加K2HPO4,并降低MgSO4 · 7H20的含量(從2. 5到1. 5g/ 升)。實驗系統使用包括開放池和戶外安裝的光反應器的臺架型系統對微藻異養小球藻進行試 驗。該設備包括4個培養單元3個375升開放池，其具有2. 5m2的照明表面，和1個 39升的光反應器，其具有0. 98m2的照明表面。開放池，其遵循那些形成大規模系統的設計 (漿輪混合的管道池)，安裝有1個漿輪以保持微藻培養物處于恒定的振蕩下(30cm/s的速 率)，而且具有縱裂以便通過槳的運動產生連續和循環流動。光反應器由一組10個管組成，每個的直徑為45mm和長度為2m。在這種情況下，通 過氣體(CO2和空氣，可相互替代地)來保證培養物的攪拌，氣體被傳送到管的內部，而且該 管安裝有冷卻系統以防止溫度高于32°c。開放池沒有安裝溫度控制系統。每個單元都安裝 有用于監控溫度、PH和溶氧濃度的傳感器。碳源包括氣態的CO2，其直接被傳送到反應器的內部，并通過pH測定進行調節。圖2顯示了如上所述的臺架設備的圖解，在該圖解中，表明使用的CO2的來源包括 來自鍋爐的耗盡的氣體，所述鍋爐由甲烷供給系統進料。下面說明了用如上所述的實驗構造進行的實驗。用如前面敘述的在實驗室roux瓶中進行的微藻培養物以光反應器和開放池的體 積的5%的量接種光反應器F-I和3個開放池？-1、？-2、？-3。在開放池后3天接種光反應器。 培養大約一周以后，達到平臺期狀況，池中的生物質濃度為0. 3-0. 5g/升，光反應器中的生 物質濃度為l_2g/升。然后這些系統以下列稀釋度不連續地運行池P-130%，池P-245%， 池P-360%，和光反應器F-130%。一早(從7到8)對培養物液體進行取樣，并以實現要求 的稀釋度所需的量的補料生長培養基。試驗期間，每天監控培養物有的干重，以及太陽輻射、溫度、溶氧濃度和pH。圖3顯示了開放池和光反應器中藻生物質的濃度趨勢。可以觀察到，如文獻中公 知的，密閉系統(光反應器)中培養物的濃度值高于開放系統的培養物的濃度值。圖4顯示了通過下面的關系式計算的不同生長系統的各自面積生產率值(CxV) /S/T
其中C=生物質濃度g/升V =每天采集的培養物體積(升)S =培養系統的表面積(底部印跡，m2)T=時間(1 天)在半連續培養中，在實驗的第1、3和6天，分析從開放池和光反應器采集的藻生物 質的樣品，以確定脂質、蛋白質、碳水化合物、類胡蘿卜素和葉綠素的含量。表1中顯示了使 用的方法和獲得的結果。可以觀察到分析的所述物質的含量證明是相對穩定的，尤其是就涉及的脂質含量而言。如在前面的附圖中可以注意到的，在一段時間期間內，這種實驗構造的開放池證 實具有較差的穩定性。實驗的大約10天以后，事實上，藻細胞遭受細菌和原生動物為代表 的突然污染，而且在大約2天以后，結果藻增殖幾乎完全消失。相反地，光反應器顯示隨時 間恒定的生產率。圖5和6顯示了污染前后，培養物的顯微鏡圖片。圖6中，可以觀察到幾種原生動 物的存在，其在培養基中增殖。這可能主要歸因于培養系統的類型，由于廣泛暴露于外界環 境，該培養系統使藻細胞很容易暴露于以其他的活物種為代表的集群，該其他的活集群與 正被培養的藻細胞競爭生長。應當注意到，通過相對較低的藻濃度，這些現象可以是有利 的，其中藻易于隨時間生產。實施例2“具有夜間中斷的連續培養”為了試圖解決在前述試驗中觀察到的池污染問題，采用了一種培養方法，其基于 用來自光反應器的單培養物中的生物質和池本身的恒定稀釋度對池進行連續接種。這將有 利于藻生物質的增殖并減少污染物種。圖7中顯示了該方法的圖解。基于前面的試驗，使用等于30%的稀釋度，其提供了生物質的最高濃度，而且生產 率保持與用最高稀釋度觀察到的生產率基本上類似。試驗了單獨的光反應器F-I和與池P-I的串聯。產生用于這兩個生長單元的接種物的方法為實施例1中描述的方法。光反應器用培養基，以1. 0升/小時的流速，1天連續進料12小時。離開光反應器 的液流被送到池P-1。池P-I也以8.4升/小時的流速進料培養基。從而證實該系統出口 處的流速等于9. 4升/小時。這樣，稀釋率保持與試驗1中使用的稀釋率相等，大約30%的 稀釋度(9. 4升/小時*12小時/天375升=0. 30)。類似地，證實光反應器的稀釋率等于30% (1.0升/小時*12小時/天40升= 0. 30)。記住池每天進料12小時，總的蓄水時間證實等于3. 3天(375升112. 8升/天= 3. 3天)，與光反應器類似(40升12升/天=3. 3天)。證實系統在這些條件下是穩定的，而且沒有觀察到在前面的試驗期間發現的污染 現象。在大約30天以后考慮終止該實驗。
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圖8和9顯示了所述兩種培養系統中發現的生物質濃度和面積生產率趨勢。對圖3與圖8進行比較顯示，光反應器中的生物質濃度證實與實施例1中觀察到 的生物質濃度一致(大約2克/升)，但是證實池的生物質濃度更高(大約0. 7到0. 5克/ 升)。池中濃度的增加可能是由于連續進料到光反應器的藻生物質的影響(大約2克/小 時)。在規定情況下，因此離開開放池的生物質流速等于大約6. 6克生物質/小時。而且在這種情況下，實驗期間，連續每3天從開放池和光反應器對藻生物質取樣。 表2中指出了脂質、蛋白質、碳水化合物、類胡蘿卜素和葉綠素的分析值。可以觀察到細胞組成與實施例1的試驗中描述的非常類似。實施例3“利用最終的熟化開放池進行連續培養”為了增加脂質含量，使生物質進行缺氮脅迫。為了該目的，通過在前面的試驗中 描述的系統下游，增加一個另外的池(P-IM)，其稱為熟化池，產生一種新的實驗構造。它具 有112. 8升的有效容積(尺寸0. 75平方米，15. Ocm培養物高度)，也是連續排列的。進入 和離開熟化池的液流等于9. 4升/小時。選擇它的有效容積以便獲得等于1天的蓄水時間 (相對于其他兩個反應器的3. 3天)。通過除去進料培養基和CO2的影響氮限制的脅迫狀況。圖10中顯示了用于該試驗的設備圖解。為了防止熟化池進料來自過量KNO3的氮，該過量KNO3被進料到池P_1 (傳統生長 系統中一般采用的條件)，盡管沒有施用培養基，但是降低進入上述池的培養基中的KNO3濃 度(1. 75克/升到0. 45克/升)以提供對于微藻生長嚴格所需的量。離開該池的液流中的氮濃度，該液流被進料到熟化池，因此是極其低的，其值為
0. 006克/升左右。應當注意，要達到該結果，沒有必要改變待進料到光反應器F-I的培養基中KNO3 的濃度(又是1. 75克/升)，從而保留它的生長條件不變。在這些實驗條件下，熟化池的生產率幾乎為零，但是干重值保持與池P-I的干重 值非常類似，圖11顯示了池P-I與P-IM的干重值，而圖12表明了由光反應器、生長池P-I 和熟化池P-IM組成的整個系統的藻生物質的日面積生產率。對細胞組成的值進行觀察，很明顯在成熟期期間，細胞通過產生更多的脂質對脅 迫狀態作出反應以應對主要是蛋白質的損失(表3)。為了每表面積單位脂質生產率的目的，如下面的計算中所示的，細胞中脂質百分 數的增加大大補償了整個系統的生物質的較低面積生產率，其證實了采用的解決方案的效 力。實施例2 (產生的脂質)22.56g生物質/m2/天(總的面積生產率)x 0. 16 (生物質中的脂質％ ) = 3. 6g 脂質/m2/天(脂質的日面積生產率)。實施例3 (產生的脂質)17g生物質/m2/天(總的面積生產率)x 0.37(生物質中的脂質％ ) = 6. 29g脂 質/m2/天(脂質的日面積生產率)。可以觀察到，記錄到脂質產量的增加大于40%。
表 1實施例1的試驗期間產生的藻生物質的分析。 表2實施例2的試驗期間產生的藻生物質的分析。 表3實施例3的試驗期間產生的藻生物質的分析。
權利要求
一種生產具有高脂質含量的藻生物質的方法，其包括(a)在光反應器中生產接種物以進行(b)階段；(b)在用(a)階段接種的開放池中大量培養藻生物質；(c)溫和地進行藻生物質的增稠階段；(d)脂質生產的誘導階段，其中使用包括光反應器或開放池的組件；(e)具有高脂質含量的生物質的分離階段。
2.權利要求1的方法，其中在平面光反應器中進行用于制備接種物的(a)階段，該光反 應器由簡單的外部金屬結構支撐，并具有通過塑料膜方式制成的圓柱狀形狀。
3.權利要求1的方法，其中(a)階段期間制備的接種物用于在不連續基礎上或連續的 基礎上接種開放池。
4.權利要求1的方法，其中來自(c)階段的再循環的水性培養基用必要的養份進行重 建，并用作(a)階段和(b)階段的生長劑。
5.權利要求4的方法，其中來自(c)階段的再循環水性培養基用由待進行三級處理的 工業廢水構成的水流重建。
6.權利要求1的方法，其中所述藻培養所必需的CO2由工業廢氣提供。
7.權利要求1的方法，其中用于培養藻生物質的(b)階段發生在開放池中，該開放池 具有“漿輪_混合的水道池”型的縱向形狀，其裝有漿輪以保持微藻培養物處于恒定的振蕩 下。
8.權利要求1的方法，其中所述開放池以早上對培養物液體進行取樣并進料生長劑的 半連續形式運行，或者以具有夜間中斷的連續形式運行。
9.權利要求1的方法，其中藻生物質的增稠階段(c)通過通常在水處理廠使用的沉淀 池中的重力分離方法進行。
10.權利要求9的方法，其中使用陽離子聚電解質獲得生物質的增稠。
11.權利要求1的方法，其中脂質產量的誘導階段發生在保持氮限制的生長培養基中。
全文摘要
本發明涉及一種用于生產具有高脂質含量的藻生物質的方法，包括(a)在光反應器中生產接種物以進行(b)階段；(b)在用(a)階段接種的開放池中大量培養藻生物質；(c)溫和地進行藻生物質的增稠階段；(d)脂質生產的誘導階段，其中使用包括光反應器或開放池的組件；(e)具有高脂質含量的生物質的分離階段。
文檔編號C12N1/12GK101918534SQ200880124455
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月3日 優先權日2007年12月14日
發明者E·N·達達里奧, E·費奧拉萬迪, F·卡普阿諾, F·德菲拉, G·里斯波利, R·比尼亞齊 申請人:艾尼股份公司