用于活的減毒病毒的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】公開了減少包括疫苗的活的減毒病毒失活和/或降解的一種或多種活的減毒病毒和組合物。這個組合物可以包括至少一種糖類、至少一種蛋白質和至少一種高分子量表面活性劑。
【專利說明】用于活的減毒病毒的方法和組合物 本申請是申請日為2008年4月4日、申請號為200880018784. 3、題為"用于活的減毒 病毒的方法和組合物"的專利申請的分案申請。 優先權
[0001] 本申請要求2007年4月6日提交的美國臨時專利申請號60/910, 579的優先權權 益，其全文通過引用并入本文。

【技術領域】
[0002] 本文實施方式涉及用于穩定活的減毒病毒的組合物和方法。其他實施方式涉及用 于減少活的減毒病毒降解的組合物和方法。其他實施方式還涉及這些組合物在便攜式應用 和方法的試劑盒中的應用。

【背景技術】
[0003] 防止病毒感染的疫苗已經被有效地用于減少人類疾病的發病率。用于病毒疫苗的 最成功的技術之一是用減弱的或者減毒的病毒（"活的減毒病毒"）株免疫動物或者人類。 由于免疫之后有限的復制，減毒株不會引起疾病。然而，該有限的病毒復制足以表達病毒抗 原全部的所有組成成分并且對該病毒產生有效和持久的免疫反應。因此，當后來暴露于致 病的病毒株時，該免疫個體被保護免于疾病。這些活的減毒病毒疫苗是用于公眾健康的最 成功的疫苗之一。
[0004] 在美國批準銷售的病毒疫苗的十六分之十是活的減毒病毒。高度成功的活的病毒 疫苗包括黃熱病17D病毒，1、2和3型薩賓脊髓灰質炎病毒（Sabin poliovirus)、麻疹病毒、 腮腺炎病毒、風疹病毒、水痘病毒以及痘苗病毒。使用痘苗病毒疫苗控制天花爆發導致第一 次和僅有的人類疾病的根除。薩賓脊髓灰質炎病毒疫苗已經幫助在全世界預防頑癥并且在 致力根除脊髓灰質炎中被使用。幼兒接種麻疹、流行性腮腺炎、風疹以及水痘疫苗在國際范 圍內防止成千上萬的死亡和疾病。
[0005] 最近的技術進展例如重配、反求遺傳學以及冷適應，已經導致用于流感和輪狀病 毒的活的減毒病毒的許可證的頒發。用重組DNA技術開發的許多活的病毒疫苗處于人類臨 床試驗中，其包括用于西尼羅河疾病、登革熱、瘧疾、肺結核以及HIV的疫苗。這些重組病毒 疫苗依賴于很好表征的減毒病毒疫苗的操作，例如腺病毒、痘苗病毒、黃熱病17D或者登革 熱病毒、DEN-2PDK-53。安全的減毒病毒被基因工程化以表達其他病毒或者細菌性病原體的 保護性抗原。幾種重組病毒疫苗已經被批準用于動物用途，其包括金絲雀/貓科動物白血 病重組病毒、金絲雀/犬瘟重組病毒、金絲雀/西尼羅河重組病毒以及黃熱病/西尼羅河重 組病毒。作為類群，活的減毒病毒疫苗是人類歷史上是最成功的醫學干涉之一，僅僅次于抗 生素的出現并且有在全世界范圍內改善公共健康的希望。
[0006] 為了使活的減毒病毒疫苗是有效的，它們必須在免疫之后能夠復制。因此,任何使 病毒失活的因素可以削弱疫苗。例如，第二次世界大戰之前天花疫苗的廣泛分發和應用被 限制，因為該病毒在環境溫度下僅僅幾天后就失活。在20世紀20年代，法國科學家證明冷 凍干燥的疫苗提供長期穩定性，并且在20世紀40年代發展了用于大規模生產冷凍干燥疫 苗的技術（參見，例如Collierl955)。除了冷凍干燥外，各種能夠幫助穩定活的減毒病毒 疫苗中的病毒的添加劑也已經被確定（參見例如Burke, Hsu等1999)。這些穩定劑典型地 包括一種或者多種以下的成分：二價陽離子、緩沖鹽溶液、螯合劑、尿素、糖（例如，蔗糖、乳 糖、海藻糖）、多元醇（例如，甘油、甘露醇、山梨糖醇、聚乙二醇）、氨基酸、蛋白水解物（例 如，酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、蛋白胨）、蛋白質（例如，明膠、人血清白蛋白）或者聚 合物（例如，葡聚糖）。
[0007] 然而，即使使用這些穩定劑，許多常用的疫苗為了穩定仍然需要冷藏。其他常用的 疫苗對溫度極限敏感；過分的熱或者意外的冷凍可以使疫苗失活。在整個分送期間維持這 種"冷鏈（低溫運輸系統，cold chain)"在發展中國家特別困難。因此，仍然存在對于改進 現有和新開發的活的減毒病毒疫苗的穩定性的需求。
[0008] 黃病毒是最不穩定的病毒之一。它們是具有大約11，〇〇〇個堿基的RNA基因組的 有包膜病毒。大多數黃病毒通過節肢動物媒介--通常為蚊子--傳播。有超過70種不 同的黃病毒，其基于血清學分組為三種主要類別：登革熱組、日本腦炎組以及黃熱病組。在 已知的黃病毒中，40種通過蚊子傳播，16種通過虱類傳播以及18種病毒沒有確定的昆蟲媒 介。因此，大多數黃病毒已經進化到既在它們的節肢動物媒介中又在它們的脊椎動物宿主 種類（通常是鳥類或者哺乳動物）中復制。擴張的都市化、世界范圍的旅行以及環境變化 (例如采伐森林或者雨水類型）已經導致威脅人類公共健康的數種黃病毒的出現。這種病 毒包括但不限于黃熱病病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒。
[0009] 通過加強的蚊子控制和接種疫苗努力，黃熱病從北美洲、中美洲和南美洲、加勒比 海和歐洲的大部分地區消除。然而，最近20年中，報道病例的國家數量已經增加。黃熱 病病毒在非洲和南美州以及一些加勒比海島嶼的主要地區現在是地方病。世界衛生組織 (WHO)估計：每年200, 000例黃熱病的病例出現，這導致30, 000人死亡。自第二次世界大 戰以來，登革黃病毒已經傳播到遍及全世界的熱帶和亞熱帶區域并且現在威脅到超過35 億人，這大約是世界人口的一半。WHO估計每年5000萬-1億的登革熱病例出現。這些中 的500, 000例為更嚴重、威脅生命的疾病類型，稱作登革出血熱，其導致每年25, 000以上的 病例死亡。西尼羅河病毒的特別致命的形式在1999年在紐約大概通過旅行被引入到西半 球。蚊子傳播的病毒感染鳥類作為第一宿主，但是也在人類和馬中引起疾病和死亡。西尼羅 病毒傳遍美國并且傳入加拿大和墨西哥。因為其傳入，西尼羅河病毒已經引起超過20, 000 例報道的西尼羅河疾病病例，在美國導致950人死亡。日本腦炎病毒每年導致30, 000到 50, 000例的神經系統疾病，主要是在東亞和南亞。報道病例的25-30%是致命的。蜱傳腦 炎病毒對于歐洲和亞洲的部分地區是地方病，并且繼續導致影響成千上萬個體的突然爆發 (episodic outbreaks)。與具有更有限的地理傳播相關的病毒包括澳洲和新幾內亞的庫京 病毒（kujing virus)(西尼羅河的近屬）和澳洲墨萊溪谷腦炎病毒、北美和南美的圣路易 斯腦炎病毒、非洲的烏蘇土、庫坦戈以及雅溫德病毒、和南美洲的Cacipacore病毒。
[0010] 已經開發了安全并且防御黃病毒疾病例如黃熱病和日本腦炎的活的減毒病毒疫 苗。活的減毒病毒疫苗17D已經被廣泛用于預防黃熱病。目前的黃病毒疫苗在穩定劑的存 在下被冷凍干燥。但是，該疫苗要求在2 - 8°C儲存和運輸，這在發展中國家和發達國家較為 偏僻的地區這是難以達到的要求。此外，一旦重構，即使儲存在2 - 8°C，該疫苗也迅速喪失 效價。 toon] 麻疹疫苗是世界范圍內使用以預防疾病的不穩定減毒病毒的另一個例子。麻疹病 毒是副黏病毒家族有包膜的、非分段（non-segmented)的負鏈RNA病毒。麻疫是高度傳染 性、季節性疾病，其幾乎可以影響每個青春期之前不接種的兒童。在發展中國家，麻疹感染 兒童的死亡率可以高達2到15%。實際上，雖然努力建立世界范圍內免疫接種，但是麻疹每 年仍然導致7, 000個以上的兒童死亡。麻疹疫苗是在原代雞成纖維細胞中制造的活的減毒 病毒。疫苗用明膠和山梨糖醇穩定并隨后凍干。如果在2到8°C下儲存，穩定的凍干疫苗 具有2年或更長的保存期。然而，該凍干的疫苗仍然需要在發展中世界里難以保持的冷鏈。 此外，一旦重構，該疫苗在室溫（20到25°C )下一小時內喪失其效價的50%。
[0012] 因此，在該領域內存在對改進的疫苗制劑的需要。 發明概沭
[0013] 本文實施方式涉及降低或者防止活的減毒病毒組合物生物致劣或者失活的方法 和組合物。公開的一些組合物可以包括減少活的減毒病毒的生物致劣的成分的組合。本文 其他實施方式涉及大大提高活的減毒病毒的穩定性的賦形劑的組合。本文其他組合物和方 法更涉及減少對于較低溫度（例如，冷藏或者冷凍貯藏）的需求，同時增加含水和/或重構 的活的減毒病毒的保存期。
[0014] 依照這些實施方式，某些活的減毒病毒涉及黃病毒。涉及組合物的一些實施方式 可以包括但不限于一種或者多種活的減毒病毒，例如，一種或者多種活的減毒黃病毒與一 種或者多種高分子量表面活性劑、蛋白質以及糖類的結合。
[0015] 本文考慮的組合物可以提高活的減毒病毒的穩定性和/或減少活的減毒病毒的 失活和/或降解，所述活的減毒病毒包括，但不限于活的減毒黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、 棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜肝DNA病 毒、癌病毒（pestivirus)、小RNA病毒、杯狀病毒、呼腸孤病毒、細小病毒（parvovirus)、乳 多空病毒、腺病毒、皰疫病毒、或痘病毒。
[0016] 其他實施方式涉及活的減毒病毒組合物和方法，其涉及能夠減少或者防止由本文 考慮的一種或者多種病毒引起的醫學狀況發作的疫苗組合物。根據這些實施方式，醫學 狀況可以包括但不限于，西尼羅河感染、登革熱、日本腦炎、庫阿撒魯爾森林病（Kyasanur forest disease)、澳洲墨萊溪谷腦炎（murray valley encephalitis)、Alkhurma 出血熱、 圣路易腦炎（St. Louis encephalitis)、蝶源腦炎、黃熱病和丙型肝炎病毒感染。
[0017] 在某些實施方式中，本文考慮的組合物可以被部分地或者全部地脫水或者水合。 在其他實施方式中，考慮用于本文組合物的蛋白質劑包括但不限于，乳清蛋白、人血清白 蛋白、重組人血白蛋白（rHSA)、牛血清白蛋白（BSA)、其它血清白蛋白或白蛋白基因家族成 員。糖類或多元醇劑可以包括但不限于，單糖、二糖、糖醇、海藻糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、 纖維二糖（cellibiose)、龍膽二糖、昆布二糖、木乙糖、甘露二糖、乳糖、果糖、山梨糖醇、甘 露醇、乳糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、棉子糖、直鏈淀粉（amylse)、環糊精、殼聚糖、或纖維素。在 某些實施方式中，表面活性劑可以包括但不限于，非離子型表面活性劑，例如烷基聚（環氧 乙烷）、聚（環氧乙烷）和聚（環氧丙烷）的共聚物（Ε0-Ρ0嵌段共聚物）、聚（乙烯吡咯 燒酮（pyrroloidone))、燒基多聚葡糖苷（例如，鹿糖單硬脂酸酯、月桂基二葡糖苷、或山 梨聚糖單月桂酯、辛基葡糖苷和癸基麥芽糖苷）、脂肪醇（十六烷醇或油醇）、或椰油酰胺 (cocamide)(椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA)。
[0018] 在其他實施方式中，表面活性劑可以包括但不限于，普魯羅尼克（Pluronic)F127、 普魯羅尼克F68、普魯羅尼克P123,或者其他大于3, 000-4, 000MW的Ε0-Ρ0嵌段共聚物。
[0019] 在一些實施方式中，疫苗組合物可以包括但不限于，一種或者多種是血清白蛋白 的蛋白質劑；一種或者多種是海藻糖的糖劑；以及一種或者多種是Ε0-Ρ0嵌段共聚物普魯 羅尼克F127的表面活性劑聚合物。
[0020] 本文的一些實施方式涉及部分地或者全部脫水的活的減毒病毒組合物。根據這些 實施方式，組合物可以是20%或者以上、30%或者以上、40%或者以上、50%或者以上、60%或 者以上、70%或者以上、80%或者以上、或者90%或者以上脫水的。
[0021] 其他實施方式涉及用于減少活的減毒病毒失活的方法，其包括但不限于：將一種 與多種活的減毒病毒與能夠減少活的減毒病毒失活的組合物組合，該組合物包括但不限 于，一種或者多種蛋白質劑；一種或者多種糖類或者多元醇劑；以及一種或者多種高分子 量表面活性劑，其中該組合物減少活的減毒病毒的失活。根據這些實施方式，活的減毒病 毒可以包括但不限于，黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病 毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、癌病毒、小RNA病毒、杯狀病毒、呼腸 孤病毒、細小病毒、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒。此外，本文公開的方法和組合 物可以包括冷凍干燥或者其他組合的脫水方法。依照這些方法和組合物，該方法和組合物 減少冷凍干燥的或者部分或者全部脫水的活的減毒病毒的失活。在其它方法中，減少活的 減毒病毒的失活的組合物可以包括含水組合物，或者可以包括脫水后再水合的組合物。本 文描述的組合物能夠增加含水或者再水合的活的減毒病毒的保存期。
[0022] 在某些具體的實施方式中，用于本文考慮的疫苗組合物的活的減毒病毒可以包括 但不限于一種或者多種活的減毒黃病毒疫苗，其包括但不限于，減毒的黃熱病病毒（例如 17D)、減毒的日本腦炎病毒（例如SA14-14-2)、減毒的登革熱病毒（例如DEN-2/roK-53或 者DEN-4 Λ 30)或者重組嵌合的黃病毒。
[0023] 在某些實施方式中，本文考慮的組合物能夠在室溫（例如大約20°C到大約25°C ) 或者冷藏溫度（例如大約〇°C到大約10°C )下減少脫水的活的減毒病毒的失活和/或降解 24小時以上。在更具體的實施方式中，混合組合物能夠將大約100%的活的減毒病毒維持 24小時以上。此外，本文考慮的混合組合物能夠在至少2個凍融循環期間減少脫水的活的 減毒病毒的失活。其他方法涉及這樣的組合物，其能夠在冷藏溫度（例如，大約〇°C到大約 10°C )下將脫水的活的減毒病毒的失活減少大約24小時到大約50天。在這些方法中考慮 的組合物可以包括但不限于：一種或者多種血清白蛋白的蛋白質劑；一種或者多種海藻糖 的糖劑；以及一種或者多種普魯羅尼克F127的Ε0-Ρ0嵌段共聚物。在某些實施方式中，活的 減毒病毒組合物在大約21°C下在7天之后保持大約100%的病毒效價和在大約4°C的冷藏 溫度下在50天之后保持大約100%的病毒效價。本文其他實施方式可以包括在大約21°C、 7天之后保持大約90%、或者大約80%的病毒效價的活的減毒病毒組合物，和在大約4°C的 冷藏溫度下在50天之后保持大約90%、或大約80%的病毒效價的活的減毒病毒組合物。與 本領域已知的其他組合物相比，所考慮的其它實施方式包括在大約37°C下數小時（例如20 小時）之后保持在大約3X到大約10X濃度的病毒效價的活的減毒病毒組合物（參見例 如，圖4和5)。當該組合物被儲存大約37°C下時，本文公開的組合物減少活的減毒病毒的 降解。
[0024] 其他實施方式涉及用于降低活的減毒病毒組合物失活的試劑盒，其包括但不限 于，容器；和組合物，所述組合物包括但不限于一種或者多種蛋白質劑、一種或者多種糖或 者多元醇劑、和一種或者多種Ε0-Ρ0嵌段共聚物劑，其中所述組合物減少活的減毒病毒的 失活和/或降解。根據這些實施方式，試劑盒組合物可以包括一種或者多種血清白蛋白的 蛋白質劑；一種或者多種海藻糖的糖劑；以及一種或者多種Ε0-Ρ0嵌段共聚物劑。此外，本 文考慮的試劑盒還可以包括一種或者多種活的減毒病毒，所述活的減毒病毒包括但不限于 黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒 病毒、反轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、癌病毒、小RNA病毒、杯狀病毒、呼腸孤病毒、細小病毒、乳 多空病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒。某些實施方式中，本文的組合物可以包括作為糖劑 的海藻糖。根據這些實施方式，海藻糖濃度可以等于或者大于5%(w/v)。在某些實施方式 中，本文組合物可以包括作為Ε0-Ρ0嵌段共聚物劑的聚合物F127。根據這些實施方式，聚合 物F127濃度可以是大約0. 1到大約4%(w/v)。
[0025] 其他實施方式中，本文考慮的組合物可以包括痕量或者無二價陽離子。例如，本文 考慮的組合物可以具有痕量或者無鈣/鎂（Ca 2+/Mg2+)。 附圖簡述 以下附圖形成本說明書的的部分并且被包括以進一步說明本文【具體實施方式】的某些 方面。通過參考一個或多個這些附圖連同本文提供的詳細描述，實施方式可以被更好地理 解。
[0026] 圖1代表使用各種組合物測試該組合物中示例性病毒DEN-2PDK53黃病毒穩定性 的實驗的示例性直方圖。
[0027] 圖2代表對于示例性病毒DEN-2PDK53病毒在各種示例性組合物中在37°C的病毒 失活的動力學分析的示例性圖。
[0028] 圖3代表示例性病毒DEN-2PDK53病毒在37°C貯藏21小時的分析的示例性直方 圖。數值被表示為在溫育后剩余的病毒效價相對于輸入效價的百分比。制劑百分比參照各 個賦形劑（w/v)。
[0029] 圖4代表示例性病毒DEN-2PDK53病毒在不同的組合物中在37°C貯藏23小時的分 析的示例性直方圖。數值被表示為在溫育后剩余的病毒效價相對于輸入效價的百分比。
[0030] 圖5代表示例性病毒DEN-2PDK53病毒在不同組合物中在37°C貯藏23小時的分析 的示例性直方圖。數值被表示為在溫育后剩余的病毒效價相對于輸入效價的百分比。每個 制劑百分比的兩個柱代表試驗中的重復。
[0031] 圖6代表示例性病毒DEN-2PDK53病毒被儲存在不同制劑中時在兩個凍-融循環 后的示例性直方圖分析。數值被表示為在凍-融循環后剩余的病毒效價相對于輸入效價的 百分比。
[0032] 圖7代表代表示例性病毒DEN-2PDK53/WN重組黃病毒在各種示例性組合物中在 25°C經過數周時間的病毒失活的動力學分析的示例性圖。.
[0033] 圖8代表示例性病毒DEN-2PDK53/WN重組黃病毒在各種示例性組合物中在4°C經 過數周時間的病毒失活的動力學分析的示例性圖。
[0034] 圖9代表示例性病毒DEN-2PDK-53病毒在各種示例性組合物中凍干后的示例性直 方圖分析。如上所述評估在不同溫度下兩周后的病毒失活。

【具體實施方式】 定義
[0035] 如本文所用，"一個（a)"或者"一個（an)"可以是指一個或者一個以上的項目。
[0036] 如本文所用，"大約"可以表示多達和包括加或減百分之五，例如，大約100可以指 95和可達105。
[0037] 如本文所用，"糖"劑可以指一種或者多種單糖（例如，葡萄糖、半乳糖、核糖、甘露 糖、鼠李糖、塔羅糖、木糖、或者阿洛糖阿拉伯糖），一種或者多種二糖（例如，海藻糖、蔗糖、 麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、龍膽二糖、昆布二糖、木乙糖、甘露二糖、乳糖、或者果糖）、三 糖（例如，阿卡波糖、棉子糖、松三糖、潘糖、或纖維三糖）或者糖聚合物（例如，葡聚糖、黃 原膠、支鏈淀粉、環糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、淀粉、纖維寡糖、纖維素、麥芽寡糖、糖原、殼 聚糖或者殼多糖）。
[0038] 如本文所用，"多元醇"劑可以指任何糖醇（例如甘露醇、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、赤 蘚糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、多羥直鏈糖醇、乙二醇、聚多羥直鏈糖醇、聚乙二醇、聚丙二醇、 或甘油）。如本文所用，"高分子量表面活性劑"可以指分子量大于1500的表面活性的兩親 分子。
[0039] 如本文所用，"Ε0-Ρ0嵌段共聚物"可以指由聚（環氧乙烷）和聚（環氧丙烷）的 嵌段組成的共聚物。另外，如本文所用，"普魯羅尼克（Pluronic)"可以指在EOx-POy-EOx 中的Ε0-Ρ0嵌段共聚物。Ε0-Ρ0嵌段共聚物的這種構型也稱為"泊咯沙姆（Poloxamer)"或 "泊洛沙姆（Synperonic)"。
[0040] 如本文所用，"減毒病毒"可以指這樣的病毒，其被施用動物時，顯示減弱的疾病臨 床癥狀或者沒有疾病臨床癥狀。 發明詳述
[0041] 在下面的部分，為了詳述各種實施方式，描述了各種示例性組合物和方法。實踐各 種實施方式不需要利用所有或者甚至一些的本文描述的具體細節，而是相反地，濃度、時間 和其他具體細節可以通過常規實驗進行修改，這對于本領域的技術人員是顯而易見的。在 一些情況中，在說明書中沒有包括眾所周知的方法或者組分。
[0042] 已經評價了現有的黃熱病和日本腦炎的活的減毒病毒的黃病毒疫苗的穩定性。當 在1987年進行測試時，在那時候制造的黃熱病疫苗僅僅有十二分之五符合穩定性的最低 標準。后來，顯示加入糖、氨基酸和二價陽離子的混合物穩定凍干的疫苗，使得疫苗在37°C 下溫育14天之后喪失小于1個log的效力。已經描述了黃熱病疫苗的穩定的凍干制劑（見， 例如美國專利4, 500, 512)。美國專利4, 500, 512描述了乳糖、山梨糖醇、二價陽離子-- 鈣和鎂--和至少一種氨基酸的組合。雖然這種制劑可以幫助穩定凍干的疫苗，但其不能 給含水形式的疫苗提供穩定性。另一研究檢驗了包括上面描述的組合物的幾種不同制劑的 能力（穩定性）以及蔗糖、海藻糖和乳清蛋白對凍干的黃熱病疫苗的影響。發現僅由10% 蔗糖組成、由2%山梨糖醇與4%肌醇組成、或者由10%蔗糖與5%乳清蛋白、0. lg/1 CaCl2 和0· 076g/l MgS04組成的制劑提供最好的穩定性（參見，例如Adebayo, Sim-Brandenburg 等，1998)。然而，在懸浮之后在所有的情況中，黃熱病疫苗仍然非常不穩定并且必須在僅 僅大約一小時之后必須被丟棄（參見，例如，Monath, 1996;Adebayo, Sim-Brandenburg等， 1998)。這導致疫苗浪費并且如果使用不穩定的疫苗，在現場條件下（field conditions)可 能導致疫苗給予無效。
[0043] 預防日本腦炎的另一種活的減毒黃病毒疫苗已經被許可使用并且在中國廣泛使 用（參見例如，Halstead和Tsai2004)。日本腦炎疫苗株，SA14-14-2在原代倉鼠腎細胞上 生長，收獲該細胞上清液并且粗過濾。一種前面的組合物包括作為穩定劑添加的1%明膠和 5%山梨糖醇。使用這些穩定劑，凍干疫苗被并隨后在2到8°C下穩定至少1. 5年，但是在室 溫下僅僅穩定4個月而在37°C下穩定10天。與黃熱病疫苗一樣，重構的疫苗是非常不穩定 的并且在室溫下僅僅穩定2小時（參見，例如Wanf，Yang等，1990)。在本文的某些實施方 式中，考慮了用于穩定或者減少日本腦炎降解的活的減毒黃病毒組合物。
[0044] 沒有鑒定出活的減毒黃病毒疫苗的制劑，所述制劑在高于2_8°C的溫度下提供凍 干制劑的長期穩定性。此外，沒有描述防止效價喪失、穩定或減少含水疫苗的降解大于幾個 小時的制劑。
[0045] 也已經描述了其它活的減毒病毒的制劑（參見，例如，Burke，Hsu等，1999)。一種 稱作為SPGA的常見的穩定劑是2%到10%的蔗糖、磷酸鹽、谷氨酸鉀以及0. 5%到2%血清白 蛋白的混合物（參見，例如Bovarnick, Miller等，1950)。已經用不同陽離子、用淀粉水解物 或者葡聚糖取代蔗糖、和用酪蛋白水解物或者聚乙烯吡咯烷酮取代血清白蛋白確定了這種 基本制劑的各種改變。其他制劑使用水解的明膠代替血清白蛋白作為蛋白質源（Burke，Hsu 等，1999)。然而，明膠可以在免疫的兒童中引起變態反應并且可能是疫苗-相關的不良事 件的原因。美國專利6, 210, 683描述了在疫苗制劑中用重組人血清白蛋白取代從人血清中 純化的白蛋白。
[0046] 本文的實施方式公開了這樣的組合物：與現有技術中的那些組合物相比，其提高 活的減毒病毒疫苗的穩定性和/或減少活的減毒病毒疫苗的生物致劣。本文公開的某些組 合物提供在37°C或大約37°C，含水病毒的穩定性高達2小時；高達3小時；高達4小時和大 于4小時。本文公開的某些組合物在室溫（例如25°C )或者大約室溫（例如25°C )下提 供含水病毒的穩定性高至1天到大約1星期或者以上。本文考慮的實施方式為活的減毒病 毒提供對例如冷凍和/或解凍、和/或升溫的保護增加。在某些實施方式中，本文的組合物 在室溫條件下（例如，大約25°C)可以穩定脫水的活的減毒病毒產品、減少脫水的活的減毒 病毒產品的生物致劣和/或防止脫水的活的減毒病毒產品的失活。在其他實施方式中，本 文考慮的組合物在大約25°C或者高至37°C或者在大約37°C下可以穩定含水的活的減毒病 毒產品、減少含水的活的減毒病毒產品的生物致劣和/或防止含水的活的減毒病毒產品的 失活。本文公開的組合物和方法可以促進病毒疫苗在發達地區和不發達地區的儲存、分送、 遞送和給予。
[0047] 其他實施方式可以包括活的減毒病毒疫苗的組合物，所述組合物包括但不限于， 小RNA病毒（例如，脊髓灰質炎病毒、口蹄疫病毒）、杯狀病毒（例如，SARS病毒、和貓傳染 性腹膜炎病毒）、披膜病毒（例如，辛德畢斯病毒（sindbis virus)、馬腦炎病毒、屈曲病毒、 風疹病毒、羅斯河病毒（Ross River virus)、牛腹瀉病毒、豬霍亂病毒）、黃病毒（例如，登 革熱病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、蜱源腦炎病毒）、 冠狀病毒（例如，人冠狀病毒（普通感冒）、豬胃腸炎病毒）、棒狀病毒（例如，狂犬病病 毒、水痛性口炎病毒）、線狀病毒（例如，馬爾堡病毒（Marburg virus)、埃博拉病毒（Ebola virus))、副黏病毒（例如，麻疹病毒、犬瘟病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合體細胞 病毒、新城疫病毒、牛瘟病毒）、正黏病毒（例如，人流感病毒、禽流感病毒、馬流感病毒），布 尼亞病毒（例如，漢坦病毒（hantavirus)、拉克羅斯病毒（LaCrosse virus)、山谷熱病毒）、 沙粒病毒（例如，拉沙病毒、波利維亞出血熱病毒（Machupo virus))、呼腸孤病毒（例如， 人呼腸孤病毒、人輪狀病毒）、雙RNA病毒（例如，傳染性腔上囊病毒、魚胰臟壞死病毒（fish pancreatic necrosis virus))、反轉錄病毒（例如， 病毒、貓免疫缺陷病毒、貓肉瘤病毒、小鼠乳腺瘤病毒）、嗜肝DNA病毒（例如，乙型肝炎病 毒）、細小病毒（例如，人細小病毒B、犬細小病毒、貓傳染性粒細胞缺乏癥病毒）、乳多空病 毒（例如，人乳頭瘤病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒）、腺病毒（例如，人腺病毒、犬腺病毒、牛腺 病毒、豬腺病毒）、皰疹病毒（例如，單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、傳染性牛鼻氣管炎 病毒、人細胞巨化病毒、人皰疫病毒6)、和痘病毒（例如，牛痘、禽痘病毒、淀熊痘病毒、臭鼠由 痘病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、接觸傳染性軟撫病毒（musculum contagiosum virus)。
[0048] 本領域技術人員將認識到：本文的組合物或者配方涉及通過任何方式減毒的病 毒，所述任何方式包括但不限于，細胞培養傳代、重配、傳染性克隆中的突變插入、反求遺傳 學，其他重組DNA或者RNA操作。此外，本領域技術人員將認識到其他實施方式涉及被工 程化以表達任何其他蛋白質或者RNA的病毒，所述病毒包括但不限于，重組黃病毒、重組腺 病毒、重組痘病毒、重組反轉錄酶病毒、重組腺相關病毒以及重組皰疹病毒。這些病毒可以 被用作傳染病疫苗、治療腫瘤狀況的疫苗、或者引入表達蛋白或RNA以治療病癥的病毒（例 如，基因治療、反義治療、核酶治療或小的抑制性RNA治療）。
[0049] 在一些實施方式中，本文組合物可以含有一種或者多種病毒，所述病毒具有下述 病毒的膜包膜（例如，有包膜的病毒）：披膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、 副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜肝DNA病毒、皰疫病毒或痘病 毒家族。在某些實施方式中，組合物含有下列病毒中的一種或多種有包膜的RNA病毒：披 膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病 毒、或者反轉錄病毒家族。在其他實施方式中，本文組合物可以含有下列病毒中的一種或多 種有包膜的、正鏈RNA病毒：披膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、或者反轉錄病毒家族。在某些實 施方式中，組合物可以包含一種或者多種活的減毒黃病毒（例如，登革熱病毒、西尼羅河病 毒、黃熱病病毒或者日本腦炎病毒）。
[0050] 本文的一些實施方式涉及含水或者凍干形式的活的減毒病毒組合物。本領域中 技術人員將認識到提高病毒熱穩定性并防止凍-融失活的制劑將改進產品，所述產品是液 體的、粉末的、冷凍干燥或凍干并通過本領域已知方法制備。在重構后，這些穩定的疫苗可 以通過各種途徑給予，所述各種途徑包括但不限于，皮內給予、皮下給予、肌肉內給予、鼻內 給予、肺部給予或者口腔給予。用于疫苗遞送的各種裝置在本領域內是已知的，其包括但 不限于，注射器和針頭注射，分叉針頭給予，通過皮內貼劑（patches)或泵給予，無針噴射 遞送（needle-free jet delivery),皮內顆粒遞送，或氣溶膠粉末遞送（aerosol powder delivery)〇
[0051] 實施方式可以包括由一種或者多種活的減毒病毒（如以上描述）和在生理上可接 受緩沖液中的一種或者多種高分子量表面活性劑和一種或者多種蛋白質的混合物組成的 組合物。在某些實施方式中，組合物包括但不限于，在生理學上可接受緩沖液中一種或者多 種活的減毒病毒、一種或者多種高分子量表面活性劑、一種或者多種蛋白質、和一種或者多 種糖類。
[0052] 在其他實施方式中，組合物可以含有增加活的減毒病毒的熱穩定性的一種或者多 種高分子量表面活性劑。表面活性劑已經被結合到疫苗制劑中，以防止物質損失到表面例 如玻璃瓶（參見，例如Burke, Hsu等，1999)。然而，本文某些實施方式包括具有用于本文公 開的組合物和方法的一些獨特的生物化學特性的高分子量表面活性劑。Ε0-Ρ0嵌段共聚物 可以包括聚環氧乙烷嵌段（_CH 2CH2〇-稱為E0)和聚環氧丙烷（-CH2CHCH3〇-稱為P0)的嵌 段。在E0 χ-P0y-E0x排列中，P0嵌段可以與兩個E0嵌段在側面連接。因為P0成分是親水 而E0成分是疏水的，整體親水性、分子量以及表面活性劑性質可以通過改變E0 x-P0y-E0x嵌 段結構中的X和y進行調整。在水溶液中，Ε0-Ρ0嵌段共聚物將自裝配成具有P0核和親水 E0基團冠的微胞。已經將Ε0-Ρ0嵌段共聚物制劑作為用于各種疏水藥物和用于蛋白質、DNA 或者失活的疫苗的潛在藥物遞送劑進行研究（例如，Todd，Lee等 1998;Kabanov，Lemieux 等2002)。在高濃度（例如：>10%)下，某些較高分子量Ε0-Ρ0嵌段共聚物將進行反凝膠化 (reverse gelation),隨著溫度升高而形成凝膠。在體溫下形成凝膠允許使用Ε0-Ρ0嵌段 共聚物凝膠以在藥物和疫苗遞送應用中起到儲庫的作用（參見，例如Coeshott, Smithson 等2004)。此外，由于它們的表面活性劑性質，這些聚合物已經被用于輔劑制劑，并且在局部 應用的乳液和凝膠中用作乳化劑。Ε0-Ρ0嵌段共聚物也顯示出促進輻射或者電穿孔介導的 損傷后的傷口和灼傷愈合以及密封細胞膜。
[0053] 在其他實施方式中，疫苗組合物可以包括一種或者多種具有1500或者以上分子 量的表面活性劑。在某些實施方式中，該表面活性劑是非離子、親水的、聚氧乙烯-聚氧丙 烯嵌段共聚物（或者Ε0-Ρ0嵌段共聚物）。雖然Ε0-Ρ0嵌段共聚物已經被用作失活疫苗、 蛋白質疫苗或者DNA疫苗的輔劑和遞送載體，但是它們阻止活病毒失活的的用途是本領域 不能預見的。在【具體實施方式】中，制劑可以包含一種或者多種具有3, 000或者以上分子量 的Ε0-Ρ0聚合物。在進一步實施方式中，組合物可以部分包括Ε0-Ρ0嵌段共聚物普魯羅尼 克F127或者普魯羅尼克P123。本領域技術人員將認識到表面活性劑的修飾可以以化學方 法進行。本文所考慮的是任何本質上等價的表面活性劑聚合物都被考慮。
[0054] 本文實施方式可以包括一種或者多種活的減毒病毒、一種或者多種表面活性劑以 及一種或者多種蛋白質的組合物。在某些實施方式中，蛋白質可以是白蛋白。血清白蛋白 是脊椎動物血液中最常見的蛋白質之一并且具有多種功能。該蛋白質具有585個氨基酸， 分子量為66500。人血清白蛋白未被糖基化并且具有涉及其多種結合活性的一些的單個游 離的硫醇基。血清白蛋白主要為α-螺旋結構，具有三個結構域，每個結構域被細分成兩個 亞域。已知白蛋白特異結合多種分子，所述多種分子包括藥物例如阿司匹林、布洛芬、氟烷、 異丙酚和華法林以及脂肪酸、氨基酸、類固醇、谷胱甘肽、金屬、膽紅素、溶血磷脂酰膽堿、高 鐵血紅素和前列腺素。不同的結構域涉及在藥物結合；大多數小分子藥物和激素與位于亞 域ΙΙΑ和ΙΙΙΑ中的兩個主要位點中的一個相結合。由于其缺乏免疫原性，白蛋白在生物產 品中通常被用作載體蛋白。由于在活的減毒病毒疫苗中包含的蛋白質劑量可以是微克分之 幾（源于103到105病毒顆粒），所以惰性載體蛋白被用于防止由于吸附和非特異結合到玻 璃、塑料或其它表面造成的損失。然而，如本文所示，對于白蛋白和Ε0-Ρ0嵌段共聚物的結 合觀察到意想不到的穩定性提高，表明兩個成分之間和/或成分和病毒顆粒之間的相互作 用。此外，白蛋白存在時病毒穩定性的增強不可能由于作為一般的載體蛋白的功能：其他蛋 白質例如明股和乳鐵蛋白未能夠提1?病毒穩定性。
[0055] 在某些實施方式中，血清白蛋白可以來自于人和其它哺乳動物源。對于意圖用于 人的疫苗，具體的實施方式可以包括人白蛋白或其它減少或消除不良免疫反應所需要的人 制品。本領域技術人員將意識到用于每個物種的特異的白蛋白可以在動物疫苗中使用（例 如犬白蛋白用于犬制品、牛白蛋白用于牛制品）。在進一步實施方式中，蛋白質是重組人白 蛋白。存在用于在各種不同表達系統中表達重組人白蛋白或其部分的標準方法，所述表達 系統包括細菌、酵母菌、藻類、植物、哺乳動物細胞或轉基因動物系統。此外，血清白蛋白或 其部分可以在無細胞系統中產生或化學合成。這些或任何類似系統中產生的重組人白蛋白 并入本文。本領域技術人員將認識到其它蛋白質可以代替白蛋白。例如，白蛋白是多基因 家族中的一員。由于它們的結構和序列的相似性，該家族的其它成員（例如甲胎蛋白、維生 素 D結合蛋白、或α白蛋白（afamin)可以代替本文考慮的組合物和方法中的白蛋白。本 領域技術人員也將認識到可以通過本領域已知的任意方法對白蛋白進行修飾，例如，通過 重組DNA技術、通過翻譯后修飾、通過蛋白酶剪切和/或通過化學方法。本文考慮了對白蛋 白的這些取代和改變，其對血清白蛋白提供了本質上等價的穩定功能而沒有取代和改變。
[0056] 在某些實施方式中，描述了具有在生理可接受緩沖液中的高分子量表面活性劑、 蛋白質和糖類的組合物。在一些實施方式中，糖類是糖或多元醇。糖可以包括但不限于， 單糖（例如葡萄糖、半乳糖、核糖、甘露糖、鼠李糖、塔羅糖、木糖或阿洛糖阿拉伯糖）、二糖 (例如海藻糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、龍膽二糖、昆布二糖、木乙糖、甘露二糖、 乳糖、或果糖）、三糖（例如阿卡波糖、棉子糖、松三糖、潘糖、或纖維三糖）或糖聚合物（例 如葡聚糖、黃原膠、支鏈淀粉、環糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、淀粉、纖維寡糖、纖維素、麥芽寡 糖、糖原、殼聚糖、或者殼多糖）。多元醇可以包括但不限于甘露醇、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、 赤蘚糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、多羥直鏈糖醇、乙二醇、聚多羥直鏈糖醇、聚乙二醇、聚丙二 醇、和甘油。
[0057] 在【具體實施方式】中，制劑可以含有在生理可接受緩沖液中的一種或者多種Ε0-Ρ0 嵌段共聚物、一種或者多種蛋白質和海藻糖的組合。在某些實施方式中，海藻糖可以以5到 50%(w/v)的濃度范圍存在。海藻糖已經被用于增強蛋白質制劑的穩定性。作為低溫保藏劑 在本領域已廣泛知道并且實際上被用于保護生物體免受應激。可以忍受低水條件的脫水生 活的生物體（anhydrobiotic organisms)含有大量的海藻糖。海藻糖已經顯示出防止可以 使膜在干燥期間不穩定的膜融合情況和相變。結構分析表明海藻糖在脂雙層中的極性頭基 團之間很適合。海藻糖也防止不穩定蛋白質在干燥期間的變性。據認為海藻糖通過與極性 蛋白質殘基氫鍵結合穩定蛋白質。海藻糖是由兩個葡萄糖分子以1:1連接組成的二糖。由 于1:1連接，海藻糖有很少或沒有還原能力并且因此基本上與氨基酸和蛋白質不反應。這 種還原活性的缺乏可以提高海藻糖對蛋白質的穩定作用。在某些實施方式中，海藻糖為活 的減毒病毒提供穩定性。海藻糖的這種活性可能是由于它同時穩定病毒的膜和外被蛋白的 能力。
[0058] 在進一步實施方式中，組合物可以包括一種或者多種Ε0-Ρ0嵌段共聚物、一種或 者多種蛋白質和一種或者多種糖類，其中糖類之一是在生理可接受緩沖液中的殼聚糖，其 為活的減毒病毒提供提高的穩定性。在某些實施方式中，組合物可以包括濃度范圍為0. 001 到2%的殼聚糖（例如，在大約6. 8的pH)。殼聚糖是由殼多糖--甲殼動物外骨骼的結構 聚合物--的脫乙酰作用衍生的陽離子多糖。它是N-乙酰基-葡糖胺和葡糖胺的聚合物； 兩種糖的含量取決于脫乙酰作用的程度。殼聚糖的正電荷使其與負電荷的表面和分子結 合。因此，它結合粘膜的表面并且被認為促進粘膜的吸附。殼聚糖也可以與DNA、RNA和其 它寡核苷酸結合并形成納米顆粒，并且已經在非病毒基因遞送中使用。本文某些實施方式 說明殼聚糖增加活的減毒病毒穩定性。
[0059] 在某些實施方式中，可以描述典型地包括生理可接受緩沖液的組合物。本領域 技術人員認識到多種生理可接受緩沖液存在，其包括但不限于含有磷酸鹽、TRIS、MOPS、 HEPES、碳酸氫鹽的緩沖液、本領域已知的其它緩沖液、和多種緩沖液的組合。此外，本領域 技術人員認識到調整鹽濃度到接近生理水平（例如，鹽水或〇. 15M的總鹽），對于腸胃外施 用組合物以防止細胞損害和/或在注射部位的疼痛是最佳的。本領域技術人員也將認識到 當糖濃度增加時，鹽濃度可以減少以維持與制劑相等的滲透性。在某些實施方式中，考慮具 有大于pH6. 8的緩沖介質；一些活的減毒病毒（例如黃病毒）在低pH是不穩定的。在另一 種實施方式中，生理可接受緩沖液可以是磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)。
[0060] 本文一些活的減毒病毒疫苗組合物涉及這樣的組合物，其除了具有減少的免疫原 性或非免疫原性之外還增加活的減毒病毒穩定性和/或減少生物致劣。依照這些實施方 式，組合物可以包括一種或者多種蛋白劑；一種或者多種糖類或多元醇劑；和一種或者多 種高分子量表面活性劑，其中組合物減少活的減毒病毒的失活。因此，本文考慮的某些組合 物在被施用給對象時已經減少了不良反應。在一些示例性組合物中，表面活性劑（一種或 多種）由一種或者多種Ε0-Ρ0嵌段共聚物組成；蛋白質劑（一種或多種）選自源于脊椎動 物種的乳清蛋白、血清白蛋白、甲胎蛋白、維生素 D結合蛋白、α白蛋白（afamin);和糖劑 (一種或多種）是糖和/或多元醇的一種或者多種。在某些實施方式中，組合物可以包括選 自海藻糖、蔗糖、殼聚糖、山梨糖醇、和甘露醇的糖劑的一種或多種。在某些更具體的實施方 式中，為了減少對疫苗的免疫反應，血清白蛋白可以源于脊椎物種，或在其它實施方式中， 源于與對象（例如人）相同的來源。在其它實施方式中，糖劑是海藻糖。在某些實施方式 中，至少一種表面活性劑是Ε0-Ρ0嵌段共聚物普魯羅尼克F127。在一些活的減毒病毒疫苗 組合物中，至少一種糖劑是海藻糖。在某些活的減毒病毒疫苗組合物中包括濃度是〇. 1到 4%(w/v)的Ε0-Ρ0嵌段共聚物普魯羅尼克F127 ;和/或濃度為0. 001到3%(w/v)的血清白 蛋白，和/或濃度為5到50%(w/v)的海藻糖。 藥物組合物
[0061] 本文實施方式提供將適合于體內藥物施用的生物相容形式的組合物施用給對象。 "適合于體內施用的生物相容形式"指的是待施用的活性劑（例如該實施方式的活的減毒病 毒組合物）的形式，其中活性劑的治療作用勝過任意毒性作用。治療活性量的治療組合物 的施用被定義為如此量，其在獲得期望結果的必須的劑量和時間段下是有效的。例如，治療 有效量化合物可以按照因素例如個體的疾病狀態、年齡、性別、和體重以及制劑引發個體中 期望反應的能力而變化。給藥方案可以調整以提供最佳的治療反應。
[0062] 在一些實施方式中，組合物（例如實施方式的藥物化學品、蛋白質、多肽）可以以 方便的方式施用，例如以皮下、靜脈內、通過口服施用、吸入、透皮應用、陰道內應用、局部應 用、鼻內或直腸施用。在更具體的實施方式中，化合物可以口服或皮下施用。在另一個實施 方式中，化合物可以靜脈內施用。在一個實施方式中，化合物可以鼻內施用，例如吸入。
[0063] 化合物可在適當的載體或稀釋劑中施用給對象，與組合物同時施用。如本文使用 的，術語"藥學上可接受載體"意圖包括稀釋劑，例如鹽水和水緩沖溶液。活性劑也可以腸 胃外或腹膜內施用。可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中以及在油中制備分散劑。在 普通的貯存和使用條件下，這些制劑可以含有防止微生物生長的防腐劑。
[0064] 適合于可注射使用的藥物組合物可以通過本領域已知的方法施用。例如，可以使 用無菌水溶液（在水中是可溶的）或分散劑和用于無菌可注射溶液或分散劑的臨時制劑的 無菌粉末。在所有情況下，組合物可以是無菌的并且可以是容易可注射性存在程度的流體。 它還可以保護免于微生物例如細菌和真菌的污染作用。藥學上可接受載體可以是含有例如 水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇和類似物）、和其適當的混合物的溶 劑或分散劑介質。例如，通過使用包衣例如磷脂酰膽堿、在分散劑情況下通過保持要求的顆 粒大小和通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性。
[0065] 按需要，通過將一定量的活性化合物與適當溶劑或與以上列舉的成分的一種或組 合進行合并，接著滅菌，可以制備無菌可注射溶液。
[0066] 在配制時，溶液可以以與劑量制劑相容方式，并且以治療有效量施用。制劑容易地 以多種劑型例如上述可注射溶液的形式施用。考慮的是緩釋膠囊、定時釋放微粒等也可以 用于施用本文組合物。這些具體的水溶液特別適合于靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內施用。
[0067] 活性治療劑可以被配制在混合物內，每劑量可以包括大約0. 0001到1. 0毫克、或 大約0. 001到0. 1毫克、或大約0. 1到1. 0克、或甚至大約1到10克。對于預先確定情形， 單劑量或多劑量可以按適當的計劃表施用。在一些實施方式中，在暴露于本文考慮的病毒 之前、期間和/或之后，施用劑量。
[0068] 在另外一個實施方式中，鼻用溶液或噴霧劑、氣溶膠或吸入劑可以用于遞送感興 趣的化合物。適合于其它施用方式的另外制劑包括栓劑和陰道栓劑。也可以使用直腸陰道 栓劑或塞劑（suppository)。一般而言，對于栓劑，傳統的粘合劑和載體可以包括例如聚亞 烷基二醇或三酰甘油；這種栓劑可以由含有〇. 5%到10%范圍內、優選為1%到2%的活性成 分的混合物形成。
[0069] 口服制劑包括這種通常使用的賦形劑，例如制藥級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸 鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在某些實施方式中，口服制劑組合物可以包括惰性稀釋劑或 可被吸收的、可食用的載體，或可以被裝入硬或軟殼明膠膠囊中，或可以壓制成為片劑、或 可以直接與飲食的食物混合。對于口服治療性施用，活性化合物可以與賦形劑合并并以可 攝取的片劑、頰含片、錠劑（troches)、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖楽、薄片（wafers)等的形式使 用。這些組合物和制劑應該含有至少〇. 1%的活性化合物。組合物和制劑的百分比當然可 以改變并且可以方便地為單位重量的大約2到大約75%之間、或優選地為25-60%之間。在 這些治療有用的組合物中活性化合物的量是這樣的以便可以獲得適當的劑量。 試劑盒
[0070] 進一步的實施方式涉及與本文描述的方法和組合物一起使用的試劑盒。在試劑盒 中可以提供組合物和活的病毒制劑。試劑盒也可以包括適當的容器、本文詳述的活的減毒 病毒組合物和任選地一種或多種另外的劑，例如其它抗病毒劑、抗真菌或抗細菌劑。
[0071] 試劑盒還可以包括在需要其的對象中使用的適當等份的組合物。此外，本文組合 物可以是部分或完全脫水或含水的。本文考慮的試劑盒可以根據具體的制劑在室溫或在如 本文公開的冷藏溫度貯存。
[0072] 試劑盒的容器方式一般包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其它容器 方式，組合物可以被放置在所述容器中并且優選地被適當分成等分。其中提供另外的成分， 試劑盒一般也含有一個或多個這種劑或成分放入的另外的容器。本文試劑盒也典型地包括 含有劑的工具、組合物和處于緊密封閉的任何其它試劑容器，用于商業銷售。這種容器可以 包括在其中保留期望的小瓶的注射或吹塑的塑料容器。 實施例
[0073] 包括以下實施例以說明本文提供的某些實施方式。本領域技術人員應該意識到實 施例中公開的技術代表發現在實踐本文公開中運作良好的技術，并且因此可以考慮組成用 于其實踐的優選方式。然而，根據本公開，本領域技術人員應該意識到在公開的具體實施方 式中可以進行許多變化并且在不偏離本文的精神和范圍的情況下仍然獲得相同或類似的 結果。 實施例1 DEN-2PDK53黃病毒在液相中的基礎穩定性
[0074] 在一個說明性方法中，研究了黃病毒在液相中的熱穩定性。依照這個方法，測定儲 存在磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS)中的DEN-2PDK53親代疫苗載體在不同溫度下的基礎穩定 性（表1)。在一個實施例中，在2ml的螺蓋小瓶中，在4°C、室溫（?21°C)或37°C下溫育 在0. 5mlPBS的總體積中的IX 104pfu的DEN-2PDK53病毒。在溫育24小時后，通過中性紅 瓊脂糖覆蓋蝕斑滴定試驗（Neutral Red agarose overlay plaque titration assay)，在 非洲綠猴腎細胞（Vero cells)中測定病毒效價和活性。如表1中說明，在PBS中、4°C溫育 DEN-2PDK53導致病毒效價平均減少四倍，而在37°C溫育相同時間段導致病毒效價完全喪 失。這些結果說明DEN-2PDK53黃病毒在不存在穩定賦形劑時的穩定性相對差。 表lDen-2roK53病毒在不同溫度貯存24小時的穩定性

【權利要求】
1. 活的減毒病毒組合物，其包括： 一種或者多種活的減毒病毒； 一種或者多種聚（環氧乙烷）和聚（環氧丙烷）（EO-PO)嵌段共聚物，所述一種或多 種EO-PO嵌段共聚物包括泊咯沙姆338 (普魯羅尼克PI088 )、泊咯沙姆335 (普魯羅尼克 P105?)和泊咯沙姆238 (普魯羅尼克F88?)的一種或多種， 一種或者多種蛋白質劑，所述一種或多種蛋白質劑是選自乳清蛋白和血清白蛋白的一 種或多種白蛋白，和 一種或者多種糖劑，所述一種或者多種糖劑包括海藻糖； 其中所述組合物能夠減少所述活的減毒病毒的失活。
2. 根據權利要求1所述的病毒組合物，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、 冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、 嗜肝DNA病毒、皰疫病毒、痘病毒家族和其組合。
3. 根據權利要求1所述的病毒組合物，其中所述活的減毒病毒是黃病毒。
4. 根據權利要求1所述的病毒組合物，其中所述組合物為含水的形式。
5. 根據權利要求1所述的病毒組合物，其中所述一種或多種白蛋白包括來自脊椎動物 種類的血清白蛋白。
6. 根據權利要求1所述的病毒組合物，其中所述一種或多種EO-PO嵌段共聚物是泊咯 沙姆338，并且至少一種蛋白質劑是血清白蛋白。
7. 根據權利要求1所述的病毒組合物，其中所述EO-PO嵌段共聚物濃度為0. 1%至 4%(w/v)。
8. 減少活的減毒病毒組合物的失活的方法，其包括：將一種或者多種活的減毒病毒與 組合物組合，所述組合物包括一種或者多種EO-PO嵌段共聚物，所述一種或多種EO-PO嵌段 共聚物包括泊咯沙姆338 (普魯羅尼克P108?)、泊咯沙姆335 (普魯羅尼克P105?)和泊咯 沙姆238 (普魯羅尼克F88s )的一種或多種、一種或者多種蛋白質劑，所述一種或多種蛋白 質劑是選自乳清蛋白和血清白蛋白的一種或多種白蛋白、和一種或者多種糖劑，所述一種 或者多種糖劑包括海藻糖，其中所述組合物能夠減少所述活的減毒病毒的失活。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠狀病 毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜肝DNA 病毒、皰疫病毒、痘病毒家族和其組合。
10. 根據權利要求8所述的方法，其還包括使所述組合部分或全部脫水。
11. 根據權利要求10所述的方法，其還包括在施用之前，使所述組合物部分或全部再 水合。
12. 根據權利要求8所述的方法，其中所述組合物增加含水病毒組合物的保存期。
13. 根據權利要求8所述的方法，其中所述組合物使含水活的減毒病毒的失活減少達 24小時或更長。
14. 根據權利要求8所述的方法，其中所述一種或多種EO-PO嵌段共聚物是泊咯沙姆 338，并且所述一種或多種蛋白質劑是血清白蛋白。
15. 根據權利要求8所述的方法，其中所述病毒組合物被施用給對象由此減少疾病發 作或預防疾病。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述疾病選自西尼羅河感染、登革熱、日本腦 炎、圣路易腦炎、蜱源腦炎和黃熱病。
17. 減少活的減毒病毒組合物失活的試劑盒，其包括： 至少一個容器；和 組合物，所述組合物包括：一種或者多種EO-PO嵌段共聚物，所述一種或多種EO-PO嵌 段共聚物包括泊咯沙姆338 (普魯羅尼克ρι〇8，、泊咯沙姆335 (普魯羅尼克P105*0和泊 咯沙姆238 (普魯羅尼克F88"的一種或多種、一種或者多種白蛋白，所述一種或多種白蛋 白選自乳清蛋白和血清白蛋白、和一種或者多種糖劑，所述一種或者多種糖劑包括海藻糖。
18. 根據權利要求17所述的試劑盒，其中至少一種白蛋白是血清白蛋白。
19. 根據權利要求17所述的試劑盒，其中所述EO-PO嵌段共聚物的濃度為0. 1%到 4%(w/v)。
20. 根據權利要求17所述的試劑盒，其中所述血清白蛋白濃度為0. 001%到3%(w/v)。
21. 根據權利要求17所述的試劑盒，其中所述組合物還包括一種或多種活的減毒病 毒。
22. 根據權利要求21所述的試劑盒，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠 狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜 肝DNA病毒、皰疫病毒、痘病毒家族和其組合。
23. 活的減毒病毒組合物，其包括： 一種或者多種活的減毒病毒； 一種或者多種蛋白質劑，所述一種或多種蛋白質劑是選自乳清蛋白和血清白蛋白的一 種或多種白蛋白，和 一種或者多種糖劑，所述一種或者多種糖劑包括海藻糖； 其中所述組合物能夠減少所述活的減毒病毒的失活。
24. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病 毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病 毒、嗜肝DNA病毒、皰疫病毒、痘病毒家族和其組合。
25. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述活的減毒病毒是黃病毒。
26. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述組合物為含水的形式。
27. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述一種或多種白蛋白包括來自脊椎動 物種類的血清白蛋白。
28. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述一種或者多種糖劑的濃度為5%至 50%(w/v)。
29. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述一種或者多種糖劑的濃度為至少 15%。
30. 根據權利要求23所述的病毒組合物，其中所述一種或者多種蛋白質劑的濃度為 0· 001% 到 3%(w/v)。
31. 減少活的減毒病毒組合物的失活的方法，其包括：將一種或者多種活的減毒病毒 與組合物組合，所述組合物包括一種或者多種蛋白質劑，所述一種或多種蛋白質劑是選自 乳清蛋白和血清白蛋白的一種或多種白蛋白、和一種或者多種糖劑，所述一種或者多種糖 劑包括海藻糖，其中所述組合物能夠減少所述活的減毒病毒的失活。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠狀 病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜肝 DNA病毒、皰疫病毒、痘病毒家族和其組合。
33. 根據權利要求31所述的方法，其還包括使所述組合部分或全部脫水。
34. 根據權利要求31所述的方法，其還包括在施用之前，使所述組合物部分或全部再 水合。
35. 根據權利要求31所述的方法，其中所述組合物增加含水病毒組合物的保存期。
36. 根據權利要求31所述的方法，其中所述組合物使含水活的減毒病毒的失活減少達 24小時或更長。
37. 根據權利要求31所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質劑是血清白蛋白。
38. 根據權利要求31所述的方法，其中所述病毒組合物被施用給對象減少疾病發作或 預防疾病。
39. 根據權利要求38所述的方法，其中所述疾病選自西尼羅河感染、登革熱、日本腦 炎、圣路易腦炎、蜱源腦炎和黃熱病。
40. 減少活的減毒病毒組合物失活的試劑盒，其包括： 至少一個容器；和 組合物，所述組合物包括：一種或者多種白蛋白，所述一種或多種白蛋白選自乳清蛋白 和血清白蛋白、和一種或者多種糖劑，所述一種或者多種糖劑包括海藻糖。
41. 根據權利要求40所述的試劑盒，其中所述一種或多種白蛋白的至少一種白蛋白是 血清白蛋白。
42. 根據權利要求41所述的試劑盒，其中所述血清白蛋白濃度為0. 001%到3%(w/v)。
43. 根據權利要求40所述的試劑盒，其中所述一種或者多種糖劑濃度為5%至50%(w/ v)。
44. 根據權利要求40所述的試劑盒，其中所述組合物還包括一種或多種活的減毒病 毒。
45. 根據權利要求40所述的試劑盒，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠 狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉錄病毒、嗜 肝DNA病毒、皰疫病毒、痘病毒家族和其組合。
【文檔編號】A61K47/36GK104083757SQ201410106277
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2008年4月4日 優先權日:2007年4月6日
【發明者】D·T·斯廷奇克姆, J·E·奧索里奧, O`N·威根 申請人:武田疫苗公司