一種基于抗菌肽制備的水產飼料的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及飼料制備技術領域，尤其涉及一種基于抗菌肽制備的水產飼料。
【背景技術】
[0002] 我國是目前世界最大的水產品養殖國，水產養殖占全世界養殖總量和70%左右， 而為提高水產動物的抗病性和生長率，在養殖過程中通常使用一定劑量的抗生素等，從而 產生的細菌耐藥性，水產品食品安全，生態安全等系列問題，使得養殖環境進入惡性循環， 養殖效益下降。
[0003] 抗菌肽（antibacterialpeptides，ABP)是生物免疫防御系統在受到外界刺激 時產生的一類具有生物活性的小分子多肽，分子量多在2000~7000Da，由20~60個氨基酸 殘基組成，是生物體天然免疫防御系統的重要組成部分。乞今為止，已在許多生物包括昆 蟲、鳥類、動物、植物及原核生物中發現2500多種抗菌肽。抗菌肽具有強堿性、熱穩定性以 及廣譜殺菌、抗菌等特點，對生物的天然免疫起關鍵作用，作用機理獨特，不僅能殺死革蘭 氏陽性及陰性菌，還具有抗真菌、病毒、原蟲及抑制癌細胞的活性。對耐藥菌株有明顯的殺 傷作用，同時對生物體的正常細胞無害，提高動物免疫力等特點，具有廣闊的發展前景。作 為一種新型飼料添加劑，其在水產養殖業的應用受到了普遍關注。與抗生素相比，具有無污 染、無毒副作用、不產生耐藥性等優點，符合綠色環保飼料的要求，是理想的抗生素替代品 因此，現有技術還有待于改進和發展。

【發明內容】

[0004] 鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于抗菌肽制備的水產飼 料，旨在解決目前水產養殖過程中傳統飼料帶來的水產生物免疫力下降、藥物殘留、微生態 失衡等問題。
[0005] 本發明的技術方案如下： 一種基于抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述水產飼料按重量份數計包括： 豆柏 25-30份； 面粉 24. 55-30份； 次粉 10~15份 菜籽柏 20~30份 朽1檬酸 5-8份； 魚粉 15-35份； 米糖柏 1CK14份； 酵母提取物 3-5份； 60%氯化膽堿 0. 5-1份； 肉骨粉 5-10份； 磷酸二氫鈣 1-2份； 中藥制劑 0. 05-0. 1份； 多維多礦預混劑 0. 5~1. 5份 氯化鉀 0. 3~0. 5份 魚油 1~2份 豆油 1~2份 抗菌肽制劑（CAD) 0? 025-0. 15份； 所述的基于對奸抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述抗菌肽制劑效價為20000~40000u/g，其以玉米淀粉為載體。
[0006] 所述的基于對奸抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述抗菌肽制劑中抗菌肽的氨基 酸序列為：KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAKN 所述的基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述抗菌肽由如下核苷酸序列的基因 編碼得到：ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTGGTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGC TGGTCCTGCTGTTGCCACTGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAGAACTAA 所述的基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述抗菌肽的制備過程如下： A、 將該抗菌肽的編碼基因與質粒PHIL-S1構建為表達載體； B、 將融合表達載體轉化入畢赤酵母GS115,構建表達工程菌； C、 發酵培養表達工程菌，并進行甲醇誘導表達； D、 發酵產物經親和層析得到純化的抗菌肽融合蛋白，抗菌肽融合蛋白經純化得到抗菌 肽產品。
[0007] 所述的基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述水產飼料按重量份數計包 括： 豆柏 30份； 面粉 24. 625份； 朽1檬酸 5份； 魚粉 25份； 米糖柏 1〇份； 酵母提取物 3份； 60%氯化膽堿 0. 5份； 肉骨粉 8份； 磷酸二氫鈣 1份； 中藥制劑 〇. 05份； 多維多礦預混劑 〇. 5份 氯化鉀 〇. 3份 魚油 1份 豆油 1份 抗菌肽制劑（CAD) 0? 025份。
[0008] 所述的基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述豆柏的粗蛋白重量百分比為 48% 〇
[0009] 所述的基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述中藥制劑按重量百分比計由 以下成分組成： 金銀花 15-20% ; 五味子 6-10% ; 丹參 20-25% ; 仙人掌 35-40% ; 蜂膠 5-15%。
[0010] 所述的基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述中藥制劑按重量百分比計由 以下成分組成： 金銀花 18% ; 五味子 10% ; 丹參 20% ; 仙人掌 40% ; 蜂膠 12%。
[0011] 有益效果：本發明提供一種基于抗菌肽制備的水產飼料，本發明結合特定的抗菌 肽制劑制備得到水產飼料，適用于養殖魚、蝦等水生動物，增強水生動物的免疫力，有效預 防疾病，提高養殖效益，有效解決動物規模化健康養殖與食品安全與生態安全問題。同時本 發明的水產飼料可提高養殖動物增重率、成活率，降低飼料系數，并大幅提高水產品質量， 從而提尚養殖效益。
【具體實施方式】
[0012] 本發明提供一種基于對蝦抗菌肽制備的水產飼料，為使本發明的目的、技術方案 及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施 例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。 本發明提供一種基于抗菌肽制備的水產飼料，其中，所述水產飼料按重量份數計包 括： 豆柏 25-30份； 面粉 24. 55-30份； 朽1檬酸 5-8份； 魚粉 25-35份； 米糖柏 1CK14份； 酵母提取物 3-5份； 60%氯化膽堿 0. 5-1份； 肉骨粉 5-10份； 磷酸二氫鈣 1-2份； 中藥制劑 0. 05-0. 1份； 多維多礦預混劑 0. 5~1. 5份 氯化鉀 0. 3~0. 5份 魚油 1份 豆油 1份 抗菌肽制劑（CAD) 0? 025-0. 15份； 其中，所述抗菌肽制劑效價為20000~40000u/g，其以玉米淀粉為載體。進一步分析得 到上述抗菌肽制劑中抗菌肽的氨基酸序列為：KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAKN 通過對編碼基因序列分析，所述抗菌肽由如下核苷酸序列的基因編碼得到：ATGAAATGG AAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTGGTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGCTGGTCCTGCTGTTGCCAC TGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAGAACTAA 該抗菌肽的制備可通過如下過程實現： 構建表達載體：根據該抗菌肽的編碼序列ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTG GTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGCTGGTCCTGCTGTTGCCACTGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAG AACTAA與pHIL-Sl質粒重組，轉化大腸桿菌DH5a，在含有Amp平板上挑選轉化子，提取質 粒，用EcoRI及XhoI酶切，和PCR擴增，電泳獲得141bp的特異區帶。再與pPICZa-A質 粒重組，得到PACAD5，經酶切，電泳后，確認本抗菌肽基因正確，用鋰鹽法將pACAD5基因轉 化于畢赤酵母GS115,用Zeocin平板篩選轉化子，獲得抗菌肽CAD基因畢赤酵母工程菌株。
[0013] 發酵培養表達工程菌，并進行甲醇誘導表達。在培養基中37°C、200轉/分發酵 培養表達工程菌約24小時至0D600達到0. 6 ;加入終濃2%甲醇、繼續誘導表達96小時。
[0014] 抗菌肽的純化，采用CM-SephroseFF樹脂，是陽離子交換樹脂，用0?lmol/L乙 酸-乙酸銨飽和后，注入抗菌肽發酵液，吸附飽和后，用0. 1~1. 0m〇l/L的乙酸-乙酸鹽梯 度洗脫，流速5mL/min，收集，噴霧干燥即得 另外，所述酵母提取物的加工過程是將以糖蜜為原料發酵的新鮮酵母，每10L計，經 過濾、洗脫離心處理后，離心機轉速為5000r/min，離心20min，在離心洗脫后的菌體中加入 木瓜蛋白酶30000IU、胰蛋白酶100000IU，在反應器中保溫反應，溫度控制在45°C，反應20 小時；隨后提高溫度到95°C，再保溫反應2小時，然后噴霧干燥，噴霧干燥的噴頭轉速為 15000r/min，進口溫度為220°C，出口溫度為100°C，負壓90mpa，即得到酵母提取物，將所 得的酵母提取物冷卻后包裝。
[0015] 本發明使用的豆柏優選二級豆柏（cp48,粗蛋白質含量彡48%)。
[0016] 優選實施例中，所述水產飼料按重量份數計包括： 豆柏 30份； 面粉 14. 625份； 次粉 10份 朽1檬酸 5份； 魚粉 25份； 米糖柏 1〇份； 酵母提取物 3份； 60%氯化膽堿 0. 5份； 肉骨粉 8份； 磷酸二氫鈣 1份； 中藥制劑 〇. 05份； 多維多礦預混劑 〇. 5份 氯化鉀 〇. 3份 魚油 1份 豆油 1份 抗菌肽制劑（CAD) 0.025份； 其中，所述中藥制劑按重量