專利名稱：甲型肝炎疫苗及其生產方法
技術領域：
本發明涉及甲型肝炎疫苗，特別是涉及制備甲型肝炎L-A-1減毒病毒株和以該病毒株為毒種生產甲型肝炎疫苗的方法，以及該疫苗在預防甲型肝炎病毒感染中的應用。
甲型肝炎是一種由自然界廣泛存在的甲型肝炎病毒(HAV)引起的全球性傳染病，全世界約有40億人口受到該疾病的威協。在包括中國在內的發展中國家，由于人口眾多、社會經濟落后及衛生條件低下等原因，時有甲型肝炎的大規模暴發或局部流行。在經濟發達的美國，每年也有高達10，000例肝炎病人與此類病毒感染有關，甲型肝炎的發病率占臨床肝炎總病例數的15～20%。據粗估計，在中國有近5億人口受到甲型肝炎的威協，每10萬人口中約有200～300人遭受感染。上海市1983年和1988年兩次甲型肝炎大流行，給當地人民的健康和國民經濟發展帶來嚴重損害，對此，至今人們仍然心有余悸。面對這樣的現實，迫切要求發展有高特異性和安全的、可適用于臨床應用的甲型肝炎疫苗，對易感人群進行大規模免疫接種，以大幅度降低甲型肝炎發病率并有效地控制其暴發性流行。
七十年代中期以來，許多研究者致力于甲型肝炎減毒活疫苗或滅活疫苗的研究。如美國專利4，164，566號公開了在亞人類靈長目動物(如狨猴)細胞培養物中連續傳代選育甲型肝炎病毒，并以其所得到的甲型肝炎病毒CR326病毒株在多種細胞系內傳代增殖制備甲型肝炎疫苗的方法。美國專利4，532，215號和4，636，469號中公開了從甲型肝炎病人糞便中至少經5次傳代以制備甲型肝炎HM-175病毒株的方法。美國專利，4，506，016號公開了使甲肝病毒首先適應于人腎細胞，然后再適應于人肺纖維母細胞，以制備可用作疫苗之減毒甲肝病毒的方法。上述這些現存技術雖然分別建立了不同的方法學并分離純化了不同的甲型肝炎減毒病毒株，但他們幾乎都只是限于動物試驗和小數目人體試驗階段，而且所獲得病毒株的免疫接種效果、和誘導動作抗體生成的能力遠不能令人滿意(如參見P.L.Provostetal.，J.ofMed.Vivol.20∶165-175，1986和K.Midthunetal.，J.ofInf.Dis.163∶735-739，1991).
中國專利申請85107525號公開了一株新的甲型肝炎H2減毒病毒株及其純化和減毒方法，但他們使用的病毒株與我們的不同，而且病毒株的分離條件和純化方法也有所差異，特別是該專利申請并沒有詳細描述以所說的種子病毒株工業化生產甲型肝炎疫苗的方法。
本發明的一個目的是提供一種制備甲型肝炎減毒活病毒株的方法，該方法包括制備甲型肝炎急性期病人糞便樣品的懸浮液，以此病毒懸浮液感染人二倍體細胞，達到病毒增殖高峰后分離細胞提取物，并以該提取物作為種子病毒來源用同一細胞基質進行連續傳代減毒。
本發明的另一個目的是提供一株以上述方法制備的甲型肝炎減毒活疫苗L-A-1病毒株，該病毒株已于1992年12月21日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏登記號為CCTCCNo。
本發明的再一個重要的和更具實際意義的目的是提供一種以L-A-1甲型肝炎減毒病毒株為毒種，大規模工業化生產甲型肝炎疫苗的方法，該方法包括用旋轉培養法培養人胚肺二倍體細胞并用Earle氏液洗細胞，然后直接接種L-A-1減毒病毒株，培養約4周后換成作為疫苗的199綜合培養液并繼續于35-36℃下培養。
根據本發明，首先直接利用人二倍體細胞從甲型肝炎急性期病人糞便樣品中分離甲型肝炎病毒顆粒，然后于低溫條件下采用同一細胞基質連續傳代，以得到本發明的甲型肝炎減毒活性疫苗L-A-1病毒株。將該疫苗病毒株加到人胚肺二倍體細胞培養物中旋轉培養，可大規模工業化生產甲型肝炎疫苗。
現對制備本發明甲型肝炎減毒活病毒和以該L-A-1甲型肝炎減毒病毒株為毒種生產甲型肝炎疫苗的方法詳細描述如下。
Ⅰ.甲型肝炎L-A-1病毒株的制備1.病毒接種物的制備采集甲型肝炎急性期病人的糞便標本，用無牛血清Eagle氏基本培養(MEM)制成5%(V/V)懸浮液。該懸浮液經高速離心后，取上清液通過200nm濾膜除菌過濾。所得濾液經常規血清學方法和免疫電鏡觀察，證實其中含有27-32nm大小的HAV顆粒，此即為病毒接種物(參見胡孟冬等，上海醫學，1988，11∶653-656)。
2.病毒的分離和純化用于分離病毒的宿主細胞為已知的人胚肺二倍體細胞系。首先將人肺二倍體細胞接種于帶有玻片的小方瓶內，于37℃下培養。培養5-7天后形成均勻致密的細胞單層，然后在該細胞單層上接種按步驟Ⅰ所述方法制得的病毒接種物。37℃吸附4小時后，補加含維生素C的維持液(pH7.4-7.8)，再于32-34℃下培養。培養期間每隔1周換液一次，以除掉不利于細胞生長的有害代謝產物，并定期用直接免疫熒光法(IF)監測細胞內病毒增殖水平。經3-4周后，待病毒增殖達到高峰時收集細胞。經用胰蛋白酶消化，三次反復凍融及超聲處理等方法以破碎細胞，離心后得到細胞提取物，該提取物即可作為種子病毒的來源，作進一步的傳代減毒。
3.病毒的傳代減毒通過在人肺二倍體細胞內連續傳代，使上述強毒力病毒減毒。為此，用不含牛血清的MEM按不同倍數稀釋上述用作種子病毒來源的細胞提取物，按前述方法于32℃在人肺二倍體細胞中連續傳代。一般可在大約5代后轉入2BS細胞于37℃下繼續傳代，其中可每隔5代以終未稀釋法進行克隆化，共連續傳15-25代，并于不同代次接種狨猴(Sauguirus fuscicollis)以評價減毒效果并進行體內免疫原性試驗。試驗表明，在連續傳10代后病毒即已明顯減毒，約20代時可獲得令人滿意的減毒效果，由此得到本發明的L-A-1減毒活疫苗病毒株。當最低稀釋倍數(一般為10-2)的病毒接種瓶內有大約90-100%的被感染細胞呈現免疫熒光陽性時即可收獲病毒。
該病毒株已按照專利法實施細則第25條的規定，于1992年12月21日保藏在中國武漢中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏登記號為CCTCCNo.
本發明的L-A-1減毒活病毒株可以疫苗液的形式直接接種在適當培養基中旋轉培養的人胚肺二倍體細胞單層上，于低溫下培養增殖，以大規模生產完全適用于人體免疫接種的甲型肝炎疫苗。
Ⅱ.甲型肝炎減毒活疫苗的生產首先取人胚肺二倍體細胞按1∶2-1∶4的比例擴增傳代，其中細胞擴增所用培養基是添加10-15%小牛血清的MEM，pH7.2-7.6。將細胞培養瓶置37℃下旋轉培養5至8天，形成均勻、致密的細胞單層。然后棄去生長液。用新鮮Earle氏液反復沖洗細胞3-5次。向培養瓶內加入適當量按前述方法制得的毒種液并于34-36℃下培養之。每周換液一次，約4周后棄去維持液及殘存的小牛血清，并向培養瓶內直接加入由199綜合培養液構成的疫苗液。繼續培養2-5天后低溫冷凍收存細胞。經三次反復凍融和超聲處理破碎細胞，然后離心除去細胞碎片和亞細胞結構部分。收集上清得到半成品甲型肝炎疫苗。
如此制得的半成品疫苗液，按新生物制品檢定規程，經病毒測定、小鼠安全性試驗、牛血清含量測定、無菌試驗、支原體污染檢測、pH值和外觀檢驗、以及猴體試驗等一系列檢驗合格后，即可作為成品甲型肝炎疫苗，用于臨床進行人體或動物的預防免疫接種。
與已有技術相比，本發明生產甲型肝炎活疫苗方法的主要改進包括(1)在病毒宿主細胞的增殖階段，以旋轉培養法代替靜止培養法，如此可顯著地擴大細胞培養面積，使細胞增殖率提高5倍以上，且可以比較容易地除去或減少牛血清殘存量，減小疫苗制品的不良反應。(2)根據甲型肝炎病毒的生物學特性，用Earle氏液沖洗細胞表面，可更加有利于病毒的吸附感染。(3)將疫苗液(199綜合培養液)直接加入培養瓶內，可減小病毒的損失，提高疫苗的產率和滴度，并可改善病毒的穩定性。
如上文所述，在本發明L-A-1病毒株減毒過程中，始終以狨猴體內試驗作為評價減毒效果和免疫原性的手段，因為狨猴與黑猩猩或其他靈長類實驗動物相比有更好的敏感性，從而保證了毒株選育結果的可靠性和安全性。對部分產生抗體的狨猴進行攻擊保護試驗，發現全部有抗HAV的動物無論抗體滴度高或低，均可抵抗強毒的攻擊，獲得100%保護。
我們曾在中國國內的近30個地區對以狨猴為實驗對象，基于L-A-1減毒病毒株制備的甲肝活疫苗進行了多達10萬余人的大規模接種觀察，并對其中約3，500人(包括對照組約1，500人)基于局部和全身臨床反應、肝臟酶分析、血清學反應、抗體水平、糞便排毒等項指標進行了精細觀察。結果表明，對不同地區、不同年齡組以多批疫苗進行的臨床試用，未見有臨床上有意義的不良反應。大量血清學試驗結果表明，接種疫苗后可使絕大部分受試者產生良好的抗體反應。僅一次免疫注射抗體陽轉率即達到95%以上，抗體滴度4周GMT為4.438-4.464，8周為5.098-6.276。
疫苗接種后進行追蹤觀察，未發現受試者發生再感染。在既往精細觀察組中，于不同時間、不同地區隨機選擇部分受試者進行中和抗體和糞便排毒檢測，結果表明可以產生保護性中和抗體，且糞便排毒試驗均為陰性(包括使用抗原直接檢測法和細胞培養法)。另外，狨猴試驗還證實，凡能產生抗體反應者，無論抗體效價高低，均具有抵抗強毒株攻擊的能力。
對既往接受本發明甲型肝炎疫苗的受試者追蹤觀察4年，發現抗體均持續陽性，表明該疫苗具有良好的免疫原性，免疫接種后至少可獲得4年以上的持續保護。局部地區的流行病學調查也顯示，接種該疫苗后可使易感者早期獲得免疫保護，并能抵抗野生病毒的感染。
迄今我們已使用按本發明方法制得的、基于L-A-1疫苗株的甲型肝炎減毒活疫苗完成了近60萬人的人體接種觀察，在安全性及免疫原性方面進行了多指標詳細考核，結果表明該疫苗株是極其安全和有效的甲型肝炎疫苗毒株。特別是我們首先證明了本發明的疫苗不僅具有流行病學保護效果，而且根據對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性志愿者的接種效果觀察，首次證明了乙型肝炎病毒感染者不但可接受本發明疫苗的接種，而且可提供與健康人相同的保護作用。
實施例1將含有L-A-1病毒株的甲型肝炎急性期病人糞便樣品懸浮在無牛血清MEM中制成5%懸浮液，經12，000轉/分鐘高速離心15分鐘后，取上清液用200nm濾膜除菌過濾。經免疫電鏡觀察和血清學分析表明所得濾液中確實含有HAV顆粒。
按常規方法培養人胚肺二倍體細胞，6天后生長成致密的單層。向其中加入上述含病毒濾液并于37℃下吸附4小時。補加維持液(pH7.6)后于32℃低溫適應傳代。每周換液一次，并于不同時間用直接免疫熒光法(IF)監測病毒增殖水平，當病毒增殖達到高峰，即被感染細胞中90%以上呈現免疫熒光陽性時收獲細胞。按常規方法用胰蛋白酶消化細胞。并經三次反復凍融及超聲處理，以破碎細胞并提取HAV。
同樣以人胚肺細胞單層為細胞基質，按上述同樣方法于32℃下進行連續傳代，傳至4代后轉入2BS細胞于37℃下繼續傳代培養，并于不同代次進行狨猴體內減毒評價和免疫原性試驗。發現在第10次傳代后病毒即已明顯減毒。將此減毒病毒株接種于同一細胞基質上繼續減毒傳代，并于第20-27代連續收獲病毒，直接用于制備本發明的甲型肝炎減毒活疫苗。
實施例2取人胚肺二倍體細胞，添加含10小牛血清的MEM(pH7.4)，以1∶4比例在37℃下旋轉培養7天，使之生長成致密單層。然后棄去生長液，用新鮮配制的Earle氏液反復沖洗細胞表面(3次)。接種按實施例1所述方法制備的毒種液后于37℃吸附4小時，并補加維持液(即加有維生素C的乳白蛋白水解液)置35℃下培養。每周換液一次，4周后棄去維持液及殘存的小牛血清，并直接加入199綜合培養液(即疫苗液)。繼續培養4天后冷凍收存細胞。經三次反復凍融破碎細胞，合并細胞溶解產物并以低速離心，收集上清即得到本發明的甲型肝炎疫苗。
權利要求
1.一種制備甲型肝炎減毒活病毒株的方法，該方法包括提供含H-L-1病毒株的甲型肝炎急性期病人糞便樣品的懸浮液，以此病毒懸浮液感染人二倍體細胞，當達到病毒增殖高峰后制備細胞提取物，并以該提取物為種子病毒來源用同一細胞基質進行連續傳代減毒。
2.根據權利要求1的方法，其中所說的人二倍體細胞和所說的同一細胞基質是指人胚肺二倍體細胞單層。
3.根據權利要求1的方法，其中所說的連續傳代是傳10至25代。
4.根據權利要求1的方法，其中所說的連續傳代減毒是用狨猴為檢測對象監測病毒減毒水平。
5.按權利要求1至4中所一項所述的方法制備的甲型肝炎L-A-1-減毒活病毒株，其保藏登記號為CCTCC No.V92004。
6.一種以甲型肝炎L-A-1減毒活病毒株為毒種大規模工業化生產甲型肝炎疫苗的方法，該方法包括用旋轉培養法培養人胚肺二倍體細胞，用Earle氏液洗細胞表面，然后直接接種H-L-1減毒活病毒并置35℃下培養，約4周后，換成199綜合培養液繼續培養。
7.根據權利要求6的方法，其中所說的繼續培養的時間為2-5天。
全文摘要
本發明提供了制備甲型肝炎L-A-1減毒病毒株和以所說的病毒株為毒種大規模工業化生產甲型肝炎疫苗的方法。
文檔編號C12N1/36GK1076726SQ92114998
公開日1993年9月29日 申請日期1992年12月29日 優先權日1992年12月29日
發明者王鵬賦, 胡孟冬, 劉景曄, 王偉, 武文煥, 趙克儉, 張玲, 張宏, 黃金風, 李光普, 謝寶生, 宋宗明, 張權一 申請人:衛生部長春生物制品研究所