一種草分枝桿菌注射液的制備方法及草分枝桿菌注射液的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及草分枝桿菌，特別涉及一種草分枝桿菌注射液的制備方法。
【背景技術】
[0002]草分枝桿菌是抗酸分枝桿菌中的一種，基于其同結核分枝桿菌的生物親緣性，可介入人體的免疫過程，調節機體免疫系統的免疫能力。滅活的草分枝桿菌進入人體后可刺激T淋巴細胞釋放出多種淋巴因子如MAF，MIF，MCF，MMF等，這些因子作用于單核巨噬細胞系統，使之向病灶部位聚集、活化，對病原菌進行吞噬、殺傷和清除；同時，自然殺傷(NK)細胞、B淋巴細胞也活化、增多；IgM，IgG趨正常，調節細胞免疫系統產生免疫功能，增強機體免疫能力。臨床驗證結果證明，在免疫功能檢查中，T淋巴細胞亞群，T3，T4，T8，T4/T8明顯增加，統計學差異顯著(P<0.001-0.002)，自然殺傷細胞，免疫球蛋白均明顯變化，統計學具有顯著差異(P<0.01)，具有顯著免疫增強作用。
[0003]對于草分枝桿菌的免疫增強乃至抗癌功能，目前在藥學、臨床學上都進行了大量的研究，在文獻DE3728367C1中，披露了用草分枝桿菌對HIV感染者進行免疫接種的方法，改善HIV感染者的生存狀況。
[0004]在《新的免疫增強劑一一草分枝桿菌的實驗和臨床研究》(實用癌癥雜志，2003.3，Vol.18，N0.2)—文中，詳細報道了臨床上的草分枝桿菌對Lovo人結腸癌細胞的抑制作用》。
[0005]文獻CN103396958A中，披露了一種動物用草分枝桿菌及其免疫增強劑的制備方法，將菌種接種到種子培養基上進行種子培養后，直接進入發酵培養。這種培養方式雖然在一定程度上保證了菌種的純度及降低了變異幾率，然而，卻也限制了其產量。
[0006]為了擴大草分枝桿菌的使用范圍，需要一種能夠工業化生產的草分枝桿菌注射液的制備方法。

【發明內容】

[0007]本發明提出了一種草分枝桿菌注射液的制備方法，包括以下步驟:
[0008]a)將將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在-70攝氏度環境下保存；
[0009]b)對原始種子批菌種進行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過濾、稀釋、接種于改良羅氏培養基上在30-40攝氏度的環境下培養120-150小時；
[0010]c)將步驟b)中獲得的菌體進行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養基上，在30-40攝氏度的環境下培養168-196小時，經洗脫、研磨、分裝，形成主種子批菌種，并進行檢驗；
[0011]d)將檢驗合格的主種子批菌種接種于改良羅氏培養基上，在30-40攝氏度的環境下培養196-240小時，經洗脫、研磨、分裝，形成工作種子批菌種，并進行檢查；
[0012]e)將工作種子批菌種通過復蘇、擴增形成工作種子液，將工作種子液按照體積比1-5%的接種量將工作種子液接種到發酵罐內的發酵培養基中，培養條件為35-42攝氏度，通氣量為0.5-1.5L/分鐘、以50-300rpm轉速的條件下培養360-450小時，收集之后用0.8-1.0%的NaCl沖洗液進行沖洗、過濾，純化、滅菌之后即獲得草分枝桿菌原液；
[0013]f)以聚山梨酯80和氯化鈉及注射用水混合，過濾配制成稀釋液，所述稀釋液中聚山梨酯80的體積百分比是0.05-0.4%，氯化鈉重量百分比是0.7-1.1%，其中過濾之后的稀釋液與草分枝桿菌原液混合，獲得草分枝桿菌藥液；
[0014]g)將草分枝桿菌藥液灌封在清潔滅菌后的安瓿瓶中，終端滅菌檢漏后，即為草分枝桿菌注射液。
[0015]如上所述的制備方法，其特征在于:
[0016]所述蘇通培養基的配方是(單位:g/L):天門冬素4g、枸櫞酸鹽2g、磷酸氫二鉀0.5g,MgSO4.7H20 0.5g、枸櫞酸鐵銨0.5g、甘油_6ml ；
[0017]調節PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進行二次滅活，步驟為:
[0018]對配制好的蘇通培養基在121攝氏度溫度下進行滅活處理30分鐘；
[0019]—次滅活完成后的蘇通培養基，在常溫下靜置4小時，然后以121攝氏度的溫度再次進行滅活處理35分鐘，完成二次滅活處理。
[0020]如上任一所述的方法，其特征在于:
[0021]所述改良羅氏培養基的配方是(單位:g/L):
[0022]磷酸二氫鉀2.4、硫酸鎂0.24、檸檬酸鎂0.6、L_谷氨酸鈉7.2、孔雀綠0.4、馬鈴薯淀粉30，并調節PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進行二次滅活，步驟為:
[0023]對配制好的改良羅氏培養基在121攝氏度溫度下進行滅活處理30分鐘；
[0024]—次滅活完成后的改良羅氏培養基，在常溫下靜置4小時，然后以121攝氏度的溫度再次進行滅活處理30分鐘，完成二次滅活處理。
[0025]如上任一所述的方法，其特征在于:
[0026]所述發酵培養基的配方是(單位:g/L):磷酸二氫鉀1.5、磷酸氫二鈉1.5、硫酸銨0.5、硫酸鎂0.055、硫酸銅0.001、味精0.5、檸檬酸鈉0.45、瓊脂粉15、甘油6、酵母膏5、馬鈴薯淀粉15、葡萄糖5，然后再用濕熱滅菌法進行滅活處理，具體方法是:
[0027]將配好的發酵培養基在121攝氏度溫度下進行滅活處理30分鐘。
[0028]本發明還提出了一種草分枝桿菌注射液，所述草分枝桿菌注射液是由如上任一所述的方法制備而成。
[0029]本發明所提出的草分枝桿菌注射液的制備方法，適宜于規模的工業生產，且顯著的降低了成本，能夠充分滿足患者需求。
【附圖說明】
[0030]圖1草分枝桿菌原液的制備流程圖
[0031]圖2從原液到注射液的制備流程圖
[0032]具體實施方法
[0033]實施例1
[0034]—、草分枝桿菌原液的制備
[0035]如圖1所示，草分枝桿菌原液采用三級培養的模式進行制備，具體步驟如下:
[0036]原始種子批的建立
[0037]將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在-70攝氏度環境下保存。
[0038]所述蘇通培養基的配方是(單位:g/L):天門冬素4g、枸櫞酸鹽2g、磷酸氫二鉀0.5g,MgSO4.7H20 0.5g、枸櫞酸鐵銨0.5g、甘油_6ml ；
[0039]調節PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進行二次滅活，步驟為:
[0040]對配制好的蘇通培養基在121攝氏度溫度下進行滅活處理30分鐘；
[0041]—次滅活完成后的蘇通培養基，在常溫下靜置4小時，然后以121攝氏度的溫度再次進行滅活處理35分鐘，完成二次滅活處理。
[0042]主種子批菌種的建立
[0043]對原始種子批菌種進行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過濾、稀釋、接種于改良羅氏培養基上在30-40攝氏度的環境下培養120-150小時；
[0044]然后將獲得的菌體進行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養基上，在30-40攝氏度的環境下培養168-196小時，經洗脫、研磨、分裝，