用于乳腺癌中血管內皮生長因子檢測的熒光生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于傳感器領域，具體涉及用于乳腺癌中血管內皮生長因子檢測的熒光生物傳感器。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著分子生物學等新技術的發展，在腫瘤疾病的研宄中，腫瘤標記物的檢測已受到許多學者的關注。腫瘤標記物是指腫瘤發生及其增殖過程中由腫瘤細胞合成的、釋放或宿主細胞對腫瘤反應而產生的一類物質，常以抗原、酶、激素等代謝產物的形式存在。已有研宄發現，乳腺癌的發生和進展過程與血管內皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)有著密切的聯系，通過檢測它的水平對乳腺癌的監測、判斷預后、治療等有重要的意義。血管內皮生長因子(VEGF)是一種重要的調節血管生成的因子，由于腫瘤在生長增殖過程中，促進大量新生血管的形成，由于這些新生血管具有管壁薄和基底膜不完整等生理特點，為腫瘤的浸潤和轉移提供了基礎條件，因此VEGF在腫瘤血管的形成、生長、轉移過程中有著重要的作用，是重要的乳腺癌腫瘤標記物之一。常用的檢測方法是酶聯免疫法，但是這種方法存在著具有成本高，操作繁瑣等缺點，因此有必要尋找一種更加準確、靈敏、經濟、簡便、無創的檢測新技術來檢測這一腫瘤標記物。
[0003]核酸適體(aptamer)是通過一種指數富集配體系統進化技術(SELEX)經體外篩選所到的寡聚核苷酸，它是一種單鏈的DNA或RNA，具有類似于抗體的功能，能識別特異性的靶分子，例如蛋白質、小分子、甚至整個細胞等。由于核酸適體具有分子量小、易于修飾和標記、化學穩定性、靶標分子范圍廣好等優點，科研工作者們開始對基于核酸適體的生物傳感器進行了大量的研宄，發現它在生物醫學領域的研宄和臨床診斷顯示出很好的應用前景。特別是Ronit Freemand等人篩選出VEGF的核酸適體并將其應用在生物傳感器的研制上，為腫癌標記物VEGF高靈敏度檢測提供了一種新的思路。
[0004]下面所述的為本發明人率先將具有簡便、靈敏、經濟等優點的熒光生物傳感器用于快速檢測乳腺癌中血管內皮生長因子，并設計出一種測定乳腺癌蛋白的熒光生物傳感器:當靶分子VEGF不存在時，DNA探針與銀離子結合形成發夾結構，碳化氮納米材料的熒光信號不受影響；當靶分子VEGF存在時，DNA探針與VEGF結合形成G-四鏈體結構，探針的發夾結構被打開，銀離子釋放出來，猝滅碳化氮納米材料的熒光信號。通過DNA探針對VEGF的識別作用，從而建立了高靈敏度、高特異性的乳腺癌蛋白檢測方法，有望應用于乳腺癌的早期診斷及篩選抗腫瘤新藥工作中，因而本發明具有巨大的潛在應用價值和深遠的意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于乳腺癌中血管內皮生長因子檢測的熒光生物傳感器。該熒光生物傳感器制備方法簡單，所制得的傳感器用于乳腺癌的檢測時，靈敏度高。
[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案: 一種用于乳腺癌中血管內皮生長因子檢測的熒光生物傳感器，包括碳化氮納米材料、銀離子、DNA 探針，所述的 DNA 探針基因為:5’ -CCCCCCTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGACCCCCC-3’ ；其中基因片段5’-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3’是VEGF的核酸適體部分，可在VEGF存在時折疊成G-四鏈體結構；銀離子、DNA探針混合反應形成發夾結構，加入到碳化氮納米材料溶液中，測其熒光；然后該體系在靶分子血管內皮生長因子的誘導下，DNA探針與革巴分子結合形成G-四鏈體結構，發夾結構打開，銀離子被釋放出來，猝滅碳化氮納米材料的焚光信號。
[0007]一種制備如上所述的用于乳腺癌中血管內皮生長因子檢測的熒光生物傳感器的方法，包括以下步驟:
1)碳化氮納米材料的制備:將2mL甲酰胺置于微波管中，160~180°C下反應30 min，用雙蒸水洗3~4遍，真空干燥8 h后，用去離子水溶解，超聲剝離24 h;將得到的液體以15000r/min離心I h，取上清液得碳化氮納米片混懸液；
2)將10yL 10 mmol/L的硝酸銀溶液和50 yL I μ mol/L的探針基因混合，并加入3-嗎啉丙磺酸緩沖液稀釋至100 μ L，混勻，反應I h ；
3)將步驟2)的混合體系加入到900UL的碳化氮納米片溶液中，混勻，檢測其熒光強度，即得熒光傳感器。
[0008]所制得的熒光生物傳感器，用于乳腺癌的早期診斷時，對血管內皮生長因子的檢測限為 3.5 pmol/Lo
[0009]本發明通過對探針基因的設計，將3’末端和5’末端含有胞嘧啶(C)和能在VEGF誘導下折疊成G-四鏈體結構的特殊序列的探針基因與硝酸銀溶液混合，通過C-Ag+-C的共價結合方式將探針基因折疊成發夾結構；當靶分子存在時，探針基因與靶蛋白結合形成G-四鏈體結構，發夾結構打開并釋放出銀離子，銀離子與碳化氮納米材料結合猝滅其熒光，實現了對乳腺癌的早期診斷。該方法對VEGF的檢測限為3.5 pmol/Lo
[0010]本發明的有益效果在于:
1)本發明的熒光傳感器不含對人體有毒、污染環境的材料，穩定性好、靈敏度高、重現性好，抗環境中其它常見離子干擾的能力強，而且傳感器易于制備；
2)本發明利用碳化氮納米材料在銀離子、探針基因和VEGF存在下的熒光猝滅-恢復的性質，制得熒光生物傳感器；該傳感器實現了對VEGF的靈敏特異性檢測，提供了一種更加準確、靈敏、經濟、簡便、無創的檢測新技術，具有巨大的應用前景。
【附圖說明】
[0011]圖1是碳化氮納米材料的光譜圖，㈧為紫外光譜，(B)為熒光光譜；
圖2是碳化氮納米材料的激發發射光譜；
圖3為加入銀離子或不同的VEGF后碳化氮納米材料熒光信號的變化；圖中:(a)碳化氮納米材料的熒光信號，Cd)碳化氮納米材料中加入銀離子的熒光信號，(b)碳化氮中加入銀離子和探針基因后的熒光信號，(c)碳化氮中加入銀離子和探針基因后再加入靶標蛋白的焚光信號；
圖4為本發明的熒光信號檢測圖。
【具體實施方式】