專利名稱：Fap活化的抗腫瘤化合物的制作方法
技術領域：
本發明是關于通過在腫瘤部位投與可轉化成藥物的藥物前體而治療腫瘤的領域。更具體而言，本發明是關于一種通過FAPα的催化作用而可轉化成藥物的藥物前體，以及其制法及藥物用途。
背景及現有技術人類成纖維細胞活化蛋白質(FAPα)是原先用單克隆抗體(mAb)F19鑒定的Mr95,000細胞表面分子(Rettig等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，3110-3114；Rettig等人(1993)Cancer Res.53，3327-3335)。FAPαcDNA編碼具有大型細胞外區域、跨膜片段及短胞質內尾部的II型整膜蛋白質(Scanlan等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5657-5661；WO 97/34927)。FAPα顯示有48％氨基酸序列類似于T-細胞活化抗原CD26，CD26已知被稱為二肽基肽酶IV(DPPIV；EC3.4.14.5)，一種具有二肽基肽酶活性的膜-結合性蛋白質(Scanlan等人，同上)。FAPα具有酶活性并為絲氨酸蛋白酶族的成員，具有對酶功能極為重要的絲氨酸624(WO97/34927)。使用膜加疊測定的研究顯示FAPα二聚物能裂解Ala-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素、Gly-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素及Lys-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素二肽(WO97/34927)。
FAPα在許多組織類型的人的上皮癌的反應性基質成纖維細胞、愈合傷口的顆粒性組織以及某些骨及軟組織肉瘤的惡性細胞中選擇性表達。正常成人組織通常沒有可檢測的FAPα，但一些胎兒間充質組織會暫時表達該分子。相反，大部分一般類型的上皮癌，包括＞90％的乳腺癌、非小細胞肺癌及結腸直腸癌，含有FAPα-反應性基質成纖維細胞(Scanlan等人，loc.cit)。這些FAPα+成纖維細胞伴生新形成的腫瘤血管，而在腫瘤微血管內皮與惡性上皮細胞壁的基底間形成明顯的細胞區間(Welt et al.(1994)J.Clin.Oncol.12(6)，1193-1203))。雖然FAPα+基質成纖維細胞在原發性及轉移性癌中都被發現，但受測試的良性及癌前期上皮損害(Welt et al.，loc.cit.)諸如乳房的纖維腺瘤及結腸直腸腺瘤，僅很少含有FAPα+基質細胞。基于FAPα在正常組織中的受限分布模式以及其在許多惡性腫瘤的支持基質中的均勻表達，因此曾對轉移性結腸癌患者啟動使用131I-標記的mAb F19進行臨床試驗(Welt等人，同上)。
對于基于細胞毒性或細胞抑制性藥物的新穎癌癥治療而言，主要考慮是通過改善細胞毒性劑或細胞抑制劑對癌性組織殺死有效及/或降低對正常組織的毒性而增加治療指數。為增加殺死腫瘤組織的特異性及降低對正常組織的毒性，可以設計一種激發機制以使合成在藥物前體或失活形式中的毒性劑，在需要時及需要之處(尤其是癌性組織)，變成具有活性(Panchal(1998)Biochem.Pharmacol.55，247-252)。激發機制包括或外源因子諸如光或化學品，或包括內源細胞因子，諸如在癌組織中限制表達的酶。另一被進一步詳述的觀念為所謂的“抗體-指引的酶藥物前體療法”(ADEPT)或“抗體指引的催化作用”(ADC)(Huennekens(1994)Trends Biotechnol.12，234-239；Bagshawe(1994)Clin.Pharmacokinet.27，368-376；Wang等人(1992)CancerRes.52，4484-4491；Sperker等人(1997)Clin.Pharmacokinet.33(1)，18-31)。在ADEPT中，針對腫瘤-相關的抗原的抗體用于使特異性酶瞄準腫瘤部位。該被定位于腫瘤的酶將接著投與的藥物前體轉變成活性細胞毒性劑。抗體-酶共軛體(AEC)與在細胞膜上的標的抗原或在細胞外液(ECF)中的游離抗原結合。投與AEC及藥物前體間的時間間隔允許AEC從正常組織中清除，以致使藥物前體在正常組織或血液中不會被活化。但是，ADEPT的一些缺點與AEC的性質有關(Bagshawe，同上)。例如，在人類中，尋靶AEC的投與劑量中只有一小部分與腫瘤組織結合，其余通過體液分布，從體液中清除要有相當的時間延遲。即使未結合的酶濃度極低，也能催化足夠的藥物前體產生毒性效應，因為血漿及正常ECF體積比腫瘤ECF的體積大得多。在許多情況下，AEC也可以是具有免疫原性的，因而防止反覆給藥。
國際專利申請WO 97/12624及WO 97/14416公開了一種寡肽，它包括下列5-及6-肽(SEQ.ID.No151及177hArg-Tyr-Gln-Ser-Ser-Pro；hArg-Tyr-Gln-Ser-Pro)，它含有能被游離前列腺特異性抗原(PSA)識別及蛋白質性裂解的氨基酸序列，以及公開一種包含該寡肽與已知治療或細胞毒性劑的共軛物的治療劑。這些包含至少谷氨酰胺-絲胺酸部分的寡肽共軛物只在前列腺癌的治療中有用。
本發明要解決的問題為提供一種改善正常組織對已知具抗廣范圍腫瘤組織有效的細胞毒性劑或細胞抑制劑的耐受性。
發明的公開本發明是關于酶-活化的抗腫瘤化合物。特別是，本發明提供一種通過在人類癌組織中存在的內源性成纖維細胞活化蛋白質(FAPα)的催化作用能轉變成藥物的藥物前體。本發明的藥物前體優選能通過FAPα的催化作用而轉化成藥物，該藥物前體具有能被FAPα識別的裂解部位，以及該藥物是在生理條件下能對抗癌細胞的細胞毒性劑或細胞抑制劑。
在本發明的內容中，“藥物”是指可投與人類或動物以幫助疾病治療的化合物。特別是，藥物為具有藥理活性的物質。
術語“細胞毒性化合物”是指對活細胞有毒性的化合物，尤其是能破壞或殺死細胞的藥物。術語“細胞抑制性化合物”是指抑制細胞生長及增殖的化合物，因此能抑制細胞的增生。適用于本發明的細胞毒性化合物或細胞抑制性化合物為蒽環類衍生物諸如阿霉素(doxorubicin)，氨甲喋呤類似物諸如甲氨喋呤(methotrexate)、普利曲西(pritrexime)、三甲曲沙(trimetrexate)或DDMP，苯丙氨酸氮芥(melphalan)，順氯氨鉑的類似物諸如順氯氨鉑(cisplatin)、JM216、JM335、二(鉑)(bis(platinum))或羰鉑(carboplatin)，嘌呤及嘧啶的類似物諸如阿糖胞苷(cytarbine)、吉西他平(gemcitabine)、氮胞苷(azacitidine)、6-硫胍、氟阿糖胞苷(flurdarabine)或2-去氧肋間型霉素，以及其他化學治療劑的類似物諸如9-氨基喜樹堿、D，L-氨基苯乙哌啶酮、甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、絲裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、環磷酰胺(cyclophosphanamide)、5-氟尿嘧啶、extramustine、鬼臼脂素(podophyllotoxin)、博來霉素(bleomycin)或紫杉醇。
“藥物前體”是指投與時，在變成藥理活性劑之前必須通過代謝過程而進行化學轉化。特別是，藥物前體為藥物的前身。在本發明的內容中，藥物前體與其通過FAPα的催化作用轉化成的藥物相比較，其細胞毒性或細胞抑制作用要低得多。專業人員已知測定化合物的細胞毒性的方法，例如見本文的實施例6，或Mosmann((1983)J.Immun.Meth.65，55-63)。在試管測定中，藥物前體的細胞毒性與藥物相比較，至少低3倍。
“在生理條件下為細胞抑制性或細胞毒性的藥物”是指在人類或動物活體中為細胞抑制性或細胞毒性的化合物，尤其是在人類或動物活體中會殺死細胞或抑制細胞增殖的化合物。
“具有會被FAPα識別的裂解部位的藥物前體”是指能作為FAPα的酶活性的基質的藥物前體。特別是，FAPα的酶活性于生理條件下能催化藥物前體的共價鍵進行裂解。通過該共價鍵的裂解，藥物前體被直接或間接轉化成藥物。間接活化是指被FAPα催化的步驟的裂解產物本身非為藥理活性劑，但再進行另一反應步驟例如水解后，變成具有活性。更優選的是，該藥物前體的裂解部位能被FAPα特異性地識別，但不會被人類或動物體中存在的蛋白分解酶識別。也優選的是，裂解位點能被FAPα特異性地識別但不會被存在于人或動物體液尤其是血漿中的蛋白分解霉所識別。在特優選的實施例中，藥物前體在血漿、其他體液或組織中是穩定的，在其中不存在或檢測不到生物活性的FAPα。優選地，如本實施例7中進行的體外測定時，超過50％，更佳超過80％，最佳超過90％的藥物前體在37℃下8小時后仍存在于含10％(v/v)人類血漿的溶液中。裂解部位最佳是具有FAPα特異性。在優選實施方案中，裂解部位包含L-脯氨酸殘基，其通過酰氨鍵與細胞毒性劑或細胞抑制劑連接。該類之一的實例為阿霉素-肽共軛物。FAPα可催化肽的C-端氨基酸殘基(優選為L-脯氨酸)與細胞毒性或細胞抑制性化合物間的肽鍵斷裂。
優選化合物表示在下述標準條件下至少有10％轉化成游離藥物。更佳的為在標準條件下有至少20％轉化成游離藥物的化合物。甚至更佳的為顯示至少50％轉化成游離藥物的化合物。在本文中，標準條件被定義如下將各化合物溶于50mM Hepes緩沖液，150mM NaCl，pH7.2，并使最終濃度為5μM，然后與100ng CD8 FAPα于37℃一起培育24小時(見實例4)。游離藥物通過CD8 FAPα的釋放如實施例5所述測定。
本發明優選關于式(I)的化合物或其醫藥上允許的鹽 R1代表氨烷酰基或寡肽酰基(尤其是二-或三-肽酰基)，其N-端氨基官能基可與封端基相接；Ra及Rb與在其間的N-C基共同形成3-至7-員飽和或不飽和雜環，它可任選地被取代或者可任選地與苯環或環己烷稠合，雜環中一或二個CH2也可被NH、O或S取代；R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基；以及Cyt’代表細胞毒性或細胞抑制性化合物的基；附帶條件為要排除N2-乙酰基-L-高精氨酰基-L-酪氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-絲氨酰基-N-[2，3，6-三去氧-1-O-[(1S，3S)-1，2，3，4，6，11-六氫-3，5，12-三羥基-3-(羥基乙酰基)-10-甲氧基-6，11-二氧基-1-并四苯基]-α-L-來蘇-己哌喃糖(L-lyxo-hexopyranos)-3-基]-L-脯氨酰胺；以及N2-乙酰基-L-高精氨酰-L-酪氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-絲氨酰基-L-絲氨酰基-N-[2，3，6-三去氧基-1-O-[(1S，3S)-1，2，3，4，6，11-六氫-3，5，12-三羥基-3-(羥乙酰基)-10-甲氧基-6，11-二氧基-1-并四苯基]-α-L-來蘇-己哌喃糖-3-基]-L-脯氨酰胺。
特別優選的為式I中其R1是式Cg-A、Cg-B-A或Cg-(D)m-B-A的基的化合物其中Cg代表氫原子或選自R5-CO、R5-O-CO-、R5-NH-CO-、R5-SO2-或R5-中的封端基，其中R5可任選地被C1-C6-烷基、C3-C8-環烷基、芳基、芳烷基或雜芳基取代；Cg優選為乙酰基、芐酰基、D-丙氨酰基、(R)-H2NCH(CH3)-或H2NCOCH2CH2-取代基，或另一供保護N-端氨基官能的封端基；A，B及D各獨立代表由式-[NR6-(X)p-CO]-的氨基羧酸衍生的部分，其中X代表CR7R8以及R6，R7及R8各獨立代表氫原子、可任選地取代的C1-C6-烷基、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基，以及p為1，2，3，4或5；或者A，B及D各獨立代表由下式的環氨基羧酸衍生的部分 其中R9代表C1-C6-烷基、OH或NH2，m為整數1至10；q為0，1或2；以及r為0，1或2。
更優選的為式I中的R6，R7及R8各獨立代表下列的化合物氫原子或CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、(CH3)2CHCH2-、CH3CH2CH(CH3)-、(CH3)3C-、HOCH2-、CH3CH(OH)-、CH3CH(OH)CH2CH2-、HOCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH(OH)CH2CH2-、H2NC(＝NH)NHCH2CH2CH2-、HSCH2-、CH3SCH2CH2-、HOOCCH2-、HOOCCH2CH2-、H2NC(＝O)CH2-、H2NC(＝O)CH2CH2-、芐基、對-羥基-芐基、 環己基或苯基；p為1，并其中在CR7R8的構型可為R或S；若R7不是氫，則R8優選為H；R6優選為氫；若p大于1，則R7及R8優選為H。
本發明的另一優選實施方案為式I化合物，其中，由Ra及Rb與在其間的N-C共同形成的雜環可被R2及R3取代，其中R2及R3各獨立代表氫或鹵素原子，或者C1-C6-烷基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、氧基、亞氨基、甲酰基、C1-C6-烷氧羰基、氨羰基、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基。
除非另有指定，單一的立體異構物以及立體異構物的混合物或外消旋物都包括在本發明中。
“C1-C6-烷基”通常代表具有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烴基。
術語“可任選地取代”在上文或下文中是指一基或部分視需要可被一個或數個選自鹵原子、羥基、氨基、C1-C6-烷氨基、二-C1-C6-烷氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、＝O、＝NH、-CHO、-COOH、-CONH2、-NHC(＝NH)NH2、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基的取代基取代，這些取代基可彼此相同或不同。
下列基列舉以作實例甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(異丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正-戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基及1-乙基-2-甲基-丙基、HOCH2-、CH3CH(OH)-、CH3CH(OH)CH2CH2-、HOCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2-、H2NCH2CH2CH2CH2-、H2NCH2CH(OH)CH2CH2-、H2NC(＝NH)NHCH2CH2CH2-、HSCH2-、CH3SCH2CH2-、HOOCCH2-、HOOCCH2CH2-、H2NC(＝O)CH2-、H2NC(＝O)CH2CH2-、芐基、對羥基-芐基、 若C1-C6烷基被取代，則取代基優選為羥基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、＝O、＝NH、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2、-NHC(＝NH)NH2、環己基、苯基、芐基、對羥基芐基、 若C1-C6烷基被芳基或雜芳基取代，則C1-C6烷基優選為C1，更佳為亞甲基。
在上述或下述的有關R1基中的“氨烷酰基”及包括“二-或三-肽酰基”的“寡肽酰基”是指其中的氨基酸或包含至多12個(優選2或3個)氨基酸部分的寡聚物以C-端通過酰氨鍵與雜環的氮原子連接。
熟習有機酸及寡肽化學的一般人士易于了解某些氨基酸可被其他類似的、等排的及/或等電性氨基酸取代，其中原始氨基酸或寡肽的生物活性在修飾時被保留。某些非天然及經修飾的氨基酸可被用于置換相應的天然氨基酸。因此，例如，酪氨酸可被3-碘酪氨酸、2-或3-甲基酪氨酸、或者3-氟酪氨酸置換。
上文或下文所述的有關與R1的氨基烷酰基或寡肽酰基的N-端氮原子相接的“封端基”是指能使通過存在于溫血動物血漿中的氨基肽酶的作用而降低或消除本發明化合物的酶降解的基或部分。適當的封端基包括C1-C10烷酰基、C6-C18-芳基-C1-C10烷酰基、C6-C18-芳基-C1-C10-烷磺酰基。這種封端基也包括親水性封阻基，其根據親水性官能度的存在而選擇。這種封端基增加本發明化合物的親水性并因而增加其在水性介質中的溶解度。這些增進親水性的封端基優選選自羥基化烷醇、多羥基化烷酰基、羥基化芳酰基、羥基化芳烷酰基、多羥基化芳酰基、多羥基化芳烷酰基、聚乙二醇、糖基化物、糖及冠醚。
“C3-C8-環烷基”一般代表具有3至8個碳原子的環形烴基，其可任選地被一至數個選自羥基、氨基、C1-C6-烷氨基、二C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、＝O、＝NH、-CHO、-COOH、-COOCH3-、-COOCH2CH3、-CONH2、-NHC(＝NH)NH2或鹵素的取代基取代，這些取代基可彼此相同或相異。
上文或下文所述的有關由Ra及Rb與在其間的N-C共同形成的基中的“雜環”通常代表3至7員(優選4-，5-或6-員非芳族雜環系統)，它含有1個氮原子和任選地含有1或2個選自氮、氧及硫中的另外雜原子，它可被一個或數個選自鹵原子、C1-C6-烷基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、氧基、亞氨基、甲酰基、C1-C6-烷氧羰基、氨羰基、C3-C8環烷基、芳基或雜芳基的取代基取代，這些取代基可彼此相同或不同；以及其可任選地與苯環或環己環稠合。這種雜環系環優選為氮雜環丁烷或由被完全或部分氫化的吡咯、吡啶、噻唑、異噁唑、吡唑、咪唑、吲哚、苯并咪唑、吲唑、噠嗪、嘧啶或吡嗪基中衍生的。最優選的為氮雜環丁烷、吡咯烷、3，4-去氫吡咯烷、哌啶、六氫-1H-氮雜、八氫吲哚、咪唑烷或噻唑烷。
若該雜環被取代，則取代基優選為甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(異丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、羥基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、-CHO、-COOH、-COOCH3-、-COOCH2CH3或-CONH2。
“芳基”通常代表具有6至10個碳原子(優選6個碳原子)的芳族環系統，其可任選地被一至數個選自羥基、氨基、C1-C6-烷氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、-CHO、-COOH、-COOCH3-、-COOCH2CH3、-CONH2或鹵素的取代基取代，這些取代基可彼此相同或相異；以及其可任選地與苯環稠合。芳基取代基可優選地由苯衍生，優選的實例為苯基、2-羥基-苯基、3-羥基-苯基、4-羥基-苯基、4-氨基-苯基、2-氨基-苯基、3-氨基苯基。
若芳基被取代，該取代基優選為甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(異丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、羥基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3或-CONH2。
“雜芳基”通常代表5至10-員的芳族雜環系統，其含有1至5個選自選自氮、氧或硫的雜原子，其可任選地被一個或數個選自羥基、氨基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3、-CONH2或鹵素的取代基取代，這些取代基可彼此相同或不同；以及其可任選地與苯環稠合。雜芳基取代基優選由呋喃、吡咯、噻吩、吡啶、噻唑、異噁唑、吡唑、咪唑、苯并呋喃、硫茚、吲哚、苯并咪唑、吲唑、喹啉、噠嗪、嘧啶、吡嗪、喹唑啉、吡喃、嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶。
若雜芳基被取代，該取代基優選為甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(異丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、羥基、氨基、二甲氨基、二乙氨基、硫醇基、甲硫醇基、甲氧基、乙氧基、-CHO、-COOH、-COOCH3、-COOCH2CH3或-CONH2。
“細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基”意指化合物H2N-Cyt′，其于式(I)中所示的酰胺鍵斷裂時被釋出，其本身或是細胞毒性或是細胞抑制性，或在下一步驟中可被轉化成細胞毒性或細胞抑制性化合物。
在后一情況中，-Cyt′可為式-L-Cyt″的殘基，其中L為衍生于二官能分子的連接子殘基，例如二胺H2N-L′-NH2，氨基醇H2N-L′-OH，例如對-氨基-芐醇(PABOH)，氨基碳酸酯例如 或非天然的氨基羧酸。若-Cyt′為式-L-Cyt″，則化合物H2N-L-Cyt″通過式(I)所示的酰胺鍵的酶裂解而產生。化合物H2N-L′-Cyt″本身可以是細胞毒性或細胞抑制性，或者在下一步驟中從Cyt″斷離連接子殘基而釋出細胞毒性或細胞抑制劑。例如，化合物H2N-L′-Cyt″可于生理條件下水解而形成化合物H2N-L′-OH及細胞毒性或細胞抑制性化合物H-Cyt″，它為活性的治療劑(在下文中，為了簡化，Cyt′被用于表示Cyt′及Cyt″二者，以及L被用于表示L及L′二者)。
本發明化合物的藥物上允許的鹽包括從無毒性無機酸或有機酸形成的習用無毒鹽。例如，這種習用無毒鹽包括從無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸及硝酸等形成的；以及從有機酸諸如乙酸、丙酸、琥珀酸、羥乙酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、芐酸、水楊酸、磺胺酸及草酰三氟乙酸等制備的鹽。
優選的式I化合物為具式IA的 其中R2、R3、R4、Cyt′如上文所限定，R1代表氨烷酰基或寡肽酰基，以及X-Y代表CHR2-CH2、CR2＝CH、NH-CH2、CH2-NH、-CR2-、CH2-CHR2-CH2；其條件為當X-Y代表CH2-CH2基時，R1代表氨烷酰基、二-或三-肽酰基，或者R1代表具有三個以上氨基酸部分但不含Gln-Ser氨基酸序列的寡肽酰基。
環形氨基酸殘基的α碳原子優選為外消旋性，即(R/S)構形；最優選為(S)構形；在特佳實施方案中，α碳原子為(S)構形以及R2為H。若R2為OH，其優選是在反式位置。
R2及R3優選代表氫原子或甲基、乙基、丙基、異丙基、苯基、甲氧基、乙氧基或羥基，以及最佳為氫原子。R4優選為氫原子或甲基、乙基、丙基、異丙基或苯基，最佳為氫原子。
特佳的式IA化合物選自式IA1、IA2、IA3、IA4及IA5 H2N-Cyt′優選為式II的蒽環素衍生物 其中Rc代表C1-C6烷基、C1-C6羥烷基或C1-C6烷酰氧基C1-C6烷基，尤其是甲基、羥甲基、二乙氧基乙酰氧甲基或丁酰氧甲基；Rd代表氫、羥基或C1-C6烷氧基，尤其是甲氧基；Re及Rf中的一代表氫原子；而另一代表氫原子或羥基或四氫吡喃-2-基氧(OTHP)。
下列式II的化合物特別優選RcRdReRfCytCH2OHOCH3H OH阿霉素(doxorubicin)CH3OCH3H OH柔紅毒素(daunorubicin)CH2OHOCH3OHH 表阿霉素(epirubicin)CH3HH OH去甲氧正定霉素(idarubicin)CH2OHOCH3H OTHP THPCH2OHOCH3H H 去羥阿霉素(esorubicin)CH2OCOCH(OC2H5)2OCH3H OH阿霉素雙乙氧乙酸酯(detorubicin)CH2OHHH OH卡米諾柔紅霉素(carminorubicin)CH2OCOC4H9OCH3H OH最優選的為阿霉素(Dox)。其他細胞毒性或細胞抑制性殘基Cyt′例如可衍生于甲氨喋呤、三甲曲沙(trimetrexate)、普利曲西(pyritrexim)、5，10-二去氮四氫葉酸酯嘧啶甲胺、甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、10-炔丙基-5，8-二去氮葉酸酯2，4-二氨基-5-(3′，4′-二氯苯基)-6-甲基嘧啶、氨基乙哌啶酮、高萊絲來林(goreserelin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、其他化學治療劑的類似物諸如9-氨基喜樹堿(例如見Burris HA，r.d.and S.M.Fields(1994)，“拓撲異構酶I抑制劑，喜樹堿類似物的綜述，[評論]”，Hematol.Oncol.Clin.North Am.8(2)333-355；Iyer，L.and M.J.Ratatin(1998)，“喜樹堿的臨床藥理[評論][137參考文獻]”，Cancer Chemother.Pharmacol.42SupplS31-S43)。
在式(I)中，Cyt′也可以是直接或間接破壞腫瘤細胞的生物效應子分子，例如TNFα。
A，B及D單元衍生的氨基羧酸的優選實例為甘氨酸(Gly)，或者D-或L-形式(較佳)的丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、反式-4-羥基-脯氨酸(Hyp)、5-羥基賴氨酸(Hyl)、正亮氨酸(Nle)、5-羥基正亮氨酸、6-羥基正亮氨酸(Hyn)、鳥氨酸(Orn)、環己基甘氨酸(Chg)、苯基甘氨酸(Phg)、谷氨酰胺(Gln)、環己丙氨酸(Cha)、蛋氨酸-S-氧化物(Met)、β-環丙基丙氨酸(Cpa)、叔-亮氨酸(Tle)或高絲氨酸(Hse)。
優選的化合物具有通式(I)，其中A單位衍生于丙氨酸、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、反式-4-羥基-脯氨酸(Hyp)、5-羥基賴氨酸(Hyl)、正亮氨酸(Nle)、5-羥基正亮氨酸、6-羥基正亮氨酸(Hyn)、鳥氨酸(Orn)或環己基甘氨酸(Chg)、苯基甘氨酸(Phg)、谷氨酰胺(Gln)、環己丙氨酸(Cha)、蛋氨酸-S-氧化物(Met(O))、β-環丙基丙氨酸(β-Cpa)、叔-亮氨酸(Tle)或高絲氨酸(Hse)。
特佳者為式(I)化合物中R1為選自式(1)至(34)的基H-Chg (1) H-Tle (18)H-Lys (2) H-Hyl (19)H-Nle (3) H-Hse (20)H-Ala (4) Cg-Gly (21)H-Hyn (5) Cg-Nle (22)H-Pro (6) Cg-Val (23)H-Phg (7) Cg-Met (24)H-Gln (8) H-Xxx-Lys (25)H-反式-Hyp (9) H-Xxx-Hyn (26)H-Val (10) H-Xxx-Pro (27)H-Cha (11) H-Xxx-His (28)H-Met (12) H-Xxx-Met (29)H-Nva (13) H-Xxx-Ala (30)H-Met(O)(14) Cg-Xxx-Hyn (31)H-β-Cpa(15) Cg-Xxx-Ala-Gly (32)H-Ile (16) Cg-(Xxx)m-Xxx-Ala-Gly (33)H-Ser (17) Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly (34)其中Cg代表氫原子或選自芐酰氧羰基、苯乙酰基、苯甲磺酰基及芐氨羰基的封端基；Xaa代表衍生于氨基羧酸的部分，優選選自天然氨基酸，尤其是選自Ala、Pro、Tyr、Phe、His、Ser、Thr、Hyp及Lys中的基；以及m為1至6的整數。
優選的封端基Cg為乙酰基(Ac)、琥珀酰亞氨基(Suc)、D-丙氨酰基、芐氧羰基(Cbz或Z)、或者巨分子諸如聚乙二醇。
優選的蒽環類藥物前體為式III的化合物 其中Ra，Rb，Rc，Rd，Re，Rf及R1如上文定義。
本發明的最佳化合物為式(IIIA)及(IIIF)的阿霉素衍生物
若式(I)的部分Cg-B-A或Cg-(D)m-B-A含有二個或多個硫原子，本發明的化合物可含有一或多個二硫鍵。
本發明可使用的細胞毒性或細胞抑制性化合物中有一類具有可用于形成式(I)所示的酰胺鍵的伯氨基官能，例如阿霉素。在該例中，連接子分子L不需要。若細胞抑制性或細胞毒性化合物沒有氨基官能，這種官能可通過化學修飾而在該化合物中創建，例如通過引進一官能基或轉化一官能基，或將一連接子分子連接到該化合物上。連接子分子也可被插在本發明化合物的寡聚物部分(即包含氨基羧酸殘基的部分)與細胞抑制性或細胞毒性部分之間，以確保寡聚物部分與細胞毒性或細胞抑制性部分間的酰氨鍵的裂解或達到最佳。若存在連接子分子，即在含有I-Cyt′結構的化合物中，L與Cyt′間的鍵優選為酰氨鍵或酯鍵。在優選的實施方案中，該連接子分子于生理條件下于酶裂解后被水解而放出細胞抑制性或細胞毒性化合物，因此產生游離的細胞抑制性或細胞毒性化合物。在任一情況，本發明的化合物必須具有于FAPα的催化作用下可被裂解的性質，而該裂解的直接或間接結果為于生理條件下釋放出細胞抑制性或細胞毒性化合物。
在另一方面，本發明關于能通過FAPα的催化作用轉化成藥物的藥物前體，該藥物前體具有能被FAPα識別的裂解部位，以及該藥物于生理條件下為細胞抑制性或細胞毒性化合物。該藥物前體優選包含具有2個或以上氨基羧酸殘基的寡聚物部分以及細胞抑制性或細胞毒性部分，其中寡聚物部分的C-端氨基羧酸殘基為3-至7-員天然或非天然環形氨基酸，優選為D-或L-脯氨酸、或D-或L-羥基脯氨酸，以及C-端羧基官能通過酰氨鍵與細胞抑制性或細胞毒性部分連接，該酰胺鍵可通過FAPα的催化作用而裂解。寡聚物部分優選為肽。寡聚物部分優選包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12個氨基羧酸殘基，更優選包含2，3或4個氨基酸殘基。N-端氨基官能優選通過封端基保護。
本發明的化合物可通過本技術已知的方法而合成(E.Wunsch，在“有機化學的合成”一書中的肽的合成，Houben-Weyl(Eds.E.Muller，O.Bayer)，Vol.XV，Part 1 and 2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。例如，本發明的化合物可以按嵌段合成方式通過寡聚物部分的終端羧基官能(其中X可為OH或活化離去基)與細胞毒性或細胞抑制性分子H2N-Cyt′的氨基縮合，而導致形成酰胺。 若在寡聚物部分與細胞毒性劑或細胞抑制劑之間需要連接子殘基(L)，可以按相同方式進行嵌段合成。 若細胞毒劑或細胞抑制劑攜帶供連接于寡聚物部分的羧基官能，連接子分子可以是亞胺或氨基醇以及該化合物的嵌段合成可以相似方式通過活化的XOC-Cyt′與羥基或氨基成分反應而進行。 若細胞毒性劑或細胞抑制劑具有適于與寡聚物部分偶合的羥基官能，則連接子殘基可以是氨基羧酸以及可以按相同方式進行嵌段合成。
若需要，在單位Cyt′，L，羥基脯氨酸，A，B及D中，于標的分子組合期間不反應的其他官能基可通過適當的保護基而保護。適當的保護基為本技術所熟知的(P.G.M.Wuts，“有機合成中的保護基”，John Wiley and SonsInc.，New York 1991)。這些保護基于合成終結時被除去。
僅作為實例，有用的氨基保護基例如可包括C1-C10烷酰基諸如甲酰基、乙酰基、二氯乙酰基、丙酰基、3，3-二乙基己酰基等，C1-C10烷氧羰基及C6-C17芳烷氧羰基諸如叔丁氧羰基、芐氧羰基(BOC)及芴甲氧羰基等。最佳者為芴甲氧羰基(FMOC)。
適當的羧基-保護基可包括例如C1-C10烷基諸如甲基、叔丁基、癸基；C6-C17芳烷基諸如芐基、4-甲氧芐基、二苯甲基、三苯甲基、芴基；三-(C1-C10烷基)硅烷基或(C1-C10烷基)-二芳基硅烷基諸如三甲基硅烷基、二甲基-叔丁基硅烷基、二苯基-叔丁基硅烷基及相關的基。
為形成該酯-或酰胺，可能需要活化羧酸的羰基，以親核性攻擊胺或醇，即X為適于被氨基取代的活化基或離去基。該活化可通過羧酸轉化成酰基氯或酰基氟，或者通過羧酸轉化成活化酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯或五氟苯酯而進行。活化的另一方法為轉化成對稱或不對稱酐。或者，酰胺-或酯鍵的形成可通過使用就地偶合試劑諸如苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)(E.Frerot等人，Tetrahedron，1991，47，259-70)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)(K.Akaji等人，THL，35，1994，3315-18)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基尿鎓四氟硼酸(TBTU)(R.Knorr等人，THL，30，1989，1927-30)、1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)(B.Blankenmeyer-Menge等人，THL，31，1990，1701-04)而達成。
嵌段合成的另一方法是為通式(I)中的分子，可從右手側開始，通過個別單體Cyt′，L，Ra、Rb與其間的N-C-基所形成的環形氨基酸基(尤其是脯氨酸或羥基脯氨酸)，A，B及D的逐步縮合反應而以逐步方式組合而成。就縮合反應而言，可以應用與上述相同的偶合方法。由于單位L，脯氨酸/羥基脯氨酸，A，B及D為至少含有氨基-及(至少單位A，B及D，以及Ra、Rb與其間的N-C基所形成的環形氨基酸基，尤其是脯氨酸/羥基脯氨酸)羧基的二官能分子，在將羧基官能活化前，氨基需要被保護基(PG)封阻。為了保護氨基，可應用BOC基，優選FMOC基。偶合反應之后，氨基保護基必須除去并與下一個經FMOC-或BOC-保護的單元進行偶合。若需要，在單位Cyt′，L，Ra、Rb與其間的N-C基所形成的環形氨基酸基(尤其是羥基脯氨酸)，A，B及D中，于標的分子的組合期間不應反應的其他官能基可被適當官能基保護。這些保護基于合成終結時被除去。
在式(I)的內容中所界定的封端基也可作為保護基，尤其是當加入最后的(N-端)氨基羧酸時。在后一情況下，由于保護基為標的分子的一部分，所以不需除去。另一選擇為封端基可于最后一氨基羧酸單元被偶合及去保護后面加入。
逐步合成列于以下流程圖中。第二流程例示連接子殘基以及Cyt′殘基可含有如該流程所示的其他官能基(見下文)。 所以，本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將通式(V)化合物與化合物HN(R4)-Cyt′(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基，以及R4如前文界定)反應 式(V)中R1，Ra及Rb如前文限定，X1代表OH或適于被氨基取代的離去基。
式(V)中的X1優選為離去基，例如-Cl、-F、N-羥基琥珀酰亞胺基、五氟苯基或羧酸根。或者X1可為OH，以及通過使用就地偶合試劑例如苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷鏻-六氟磷酸鹽(PyBOP)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽(TBTU)或1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)進行縮合而進行。
本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將式(VI)化合物與化合物H2N-Cyt′或化合物HO-Cyt′(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基)反應 式(VI)中R1，Ra及Rb如權利要求1所定義，Y1代表L-COX2，其中L為連接子殘基，以及X2代表OH或適于被氨基或羥基取代的離去基.
式(VI)中的X2優選為離去基，例如-Cl、-F、N-羥基琥珀酰亞胺基、五氟苯基或羧酸根。或者，X2可為OH，以及縮合通過用就地偶合試劑例如苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-六氟磷酸鹽(PyBOP)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基春陽離子四氟硼酸鹽(TBTU)或1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)進行縮合而進行。
本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將式(VII)化合物與化合物X3OC-Cyt′(其中X3為OH或適于被氨基或羥基取代的離去基，以及Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基)反應。 其中R1，Ra及Rb如上文界定，Y2為式L-OH或L-NH2(其中L為連接子殘基)。
化合物X3OC-Cyt′的X3優選為離去基，例如-Cl、-F、N-羥基琥珀酰亞胺基、五氟苯基或羧酸根。或者，X可為OH，以及通過使用就地偶合試劑例如苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷鏻-六氟磷酸鹽(PyBOP)、1，1′-羰基二咪唑(CDI)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽(TBTU)或1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)進行縮合而進行。
本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將化合物H2N-Cyt′與組成式(I)化合物的單位逐步進行縮合。在每一偶合步驟之前，需要除去保護基PG(若存在)。
本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將式(VIII)化合物與化合物HN(R4)-Cyt′(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基)反應 式(VIII)中PG1為保護基，以及其他取代基具有如上文所述的意義。
然后將保護基PG1除去以及繼而將生成的式(VIIIA)化合物 與化合物PG2-A-X4(其中PG2為保護基以及X4代表OH或適于被氨基取代的離去基)反應；以及若需要可再進行偶合步驟，直至得到完全的化合物為止。
PG1及PG2例如可為BOC，或優選為FMOC。
所以，本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將式PG3-N(R4)-L-COX3化合物(其中PG3為保護基以及其他取代基具有上文所述的意義)與式Y4-Cyt′化合物(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基；以及Y4代表H2N或HO)反應；然后除去保護基PG3；以及將生成的式HN(R4)-L-Y4-Cyt′化合物與式(VIII)化合物反應 然后除去保護基PG1；以及將生成的下式化合物 與化合物PG4-A-X4(其中PG4為保護基，以及X4為OH或適于被氨基取代的離去基)反應；以及若需要可再進行偶合步驟，直至得到完全的分子為止。
本發明的再一方面為提供一種式(I)化合物的制法，其特征為將式PG5-N(R4)-L-Y5化合物(其中PG5代表保護基，Y5代表OH或NH2以及具有上文所述意義的取代基)與式X5OC-Cyt′的化合物(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基以及X5為OH或適當離去基)反應；然后除去保護基PG5；以及將生成的式HN(R4)-L-Y5-CO-Cyt′化合物與下述式(VIII)化合物反應 然后除去保護基；以及將生成的下式化合物 與式PG2-A-X4的化合物(其中PG2為保護基，以及X4為OH或適于被氨基取代的離去基)反應；以及若需要可再進行偶合步驟，直至得到完全的分子為止。
本發明的再一方面為提供一種式VIIIA的新穎中間物 [其中Ra，Rb，R4及Cyt′如上文所定義]。
本發明化合物是供醫療使用。特別是，這些化合物可用于治療與表達FAPα的基質成纖維細胞相關且用現有細胞毒劑及/或細胞抑制劑一般無法合適治療的腫瘤。具有該性質的腫瘤例如為上皮癌諸如肺癌、乳腺癌及結腸癌。腫瘤諸如表達FAPα的骨及軟組織肉瘤也可用這些化合物治療。
所以本發明的另一方面為提供一種藥物組合物，其包含本發明的化合物以及可任選地包含一種或以上醫藥允許的賦形劑，如在Remingtonthescience and practice of pharmacy.19th ed.EastonMack Publ.，1995中所示的。藥物組合物可被調配成固體溶液。固體制劑可在注射前調配成溶液。本發明藥物組合物優選的為溶液或注射液。其可被全身性投給(例如通過靜脈注射)或局部投與(例如通過直接注射入腫瘤部位)。劑量根據體重、病人的健康狀態、所患疾病的性質、被投與的化合物的治療口(window)及溶解度等因素而調整。其在專家適當調整劑量的知識范圍內。就阿霉素而言，該劑量優選在10mg/m2至1350mg/m2的范圍內，但更高或更低的劑量也適當。
所以，本發明的再一方面為本發明化合物在制備治療癌癥的藥物組合物中的用途。再者，本發明提供一種治療癌癥的方法，其包含將有效量的本發明藥物組合物投給病人。適應癥包括治療癌癥，尤其是1)上皮癌，包括乳房、肺、結腸直腸、頭部及頸部、胰臟、卵巢、膀胱、胃、皮膚、子宮內膜、卵巢、睪丸、食道、前列腺及腎的源)的治療；2)骨及軟組織肉瘤骨肉瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤(MFH)、平滑肌肉瘤；3)造血系統惡性腫瘤何杰金氏及非何杰金氏淋巴瘤；4)神經外胚層腫瘤周圍神經腫瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤；5)間皮瘤。
也包括慢性發炎病癥諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、肝硬化、肺纖維化、動脈粥樣硬化以及異常的傷口愈合的治療。
本發明的再一方面為提供一種癌癥的治療方法，其中將藥物前體投給病人，該藥物前體能被酶活性轉化成細胞毒性或細胞抑制性藥物，該酶活性為與腫瘤組織相關的細胞的表達產物。該酶活性優選為FAPα的蛋白分解活性。
化合物以靜脈輸注投與的方法。其他可能的投與途徑包括腹膜腔內(濃縮藥團或輸注)、肌內或腫瘤內注射。若適當，直接應用也可能(例如肺纖維化)。


圖1阿霉素-肽共軛物通過FAPα而裂解。ZGP-Dox(Z-Gly-(L)-Pro-阿霉素)與純化的FAPmCD8融合蛋白質(A)或與緩沖液(B)一起培育后的色層圖。見實施例5。
圖2藉阿霉素與FAPα可裂解肽的結合而減少阿霉素的細胞毒性。見圖3通過在FAPα-表達HT1080克隆33細胞中和在親代HT1080細胞中，比較從FAPα可裂解的阿霉素-肽共軛物釋出的阿霉素的細胞毒性。見實施例8。
圖4N-Cbz-Gly-(L)-Pro-阿霉素及N-Cbz-(L)-Pro-(L)-Ala-Gly-(L)-Pro-阿霉素在小鼠及人類血漿中的血漿穩定性。見實施例9。
圖5在人類腫瘤組織樣品中，FAPα酶活性的證明及其表觀分子量的確認。見實施例12。
熟習本技術的應當了解雖然在下列實施例中列出特定試劑及反應條件，但可在本發明范圍內進行修改。所以，下列實施例是為了說明本發明而并非限制本發明。
實施例實施例1阿霉素共軛物的合成方法N-Cbz-Gly-Pro-阿霉素將N-Cbz-Gly-Pro(116.1毫克，0.37毫摩爾)及N-羥基琥珀酰亞胺(44毫克，0.37毫摩爾)稱重及于氮氣下放置在2頸-圓底燒瓶中。加入無水N，N-二甲基甲酰胺(20毫升)并將燒瓶在冰浴中冷卻至0℃。加入二環己基碳化二酰亞胺(78毫克，0.37毫摩爾)溶于N，N-二甲基甲酰胺中的溶液1毫升。將該溶液于0℃攪拌40分鐘。
稱量阿霉素(100毫克，毫摩爾)并置入設有小攪棒的小瓶中及置于氮氣下。將N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)及N，N-二異丙基乙胺(33.1微升，0.19毫摩爾)于攪拌下加到小瓶中。將阿霉素溶液通過注射器加到肽溶液中并將小瓶用另外2毫升的N，N-二甲基甲酰胺清洗。將冰浴移去及將反應混合物于室溫攪拌約48小時。
將反應溶液用乙酸乙酯(500毫升)萃取。將乙酸乙酯用10％檸檬酸水溶液(250毫升)、飽和碳酸氫鈉水溶液(250毫升)及食鹽水(250毫升)依次清洗。將有機萃取液用無水硫酸鎂干燥并將溶劑用旋轉蒸發器除去。將富于DMF污染物的產物在C-18反相急驟色層柱中用8∶2甲醇∶水作為洗脫劑而進行層析。分離出一橙色點(rf～0.3)，其于長波UV光下會發出螢光。用旋轉蒸發器除去甲醇以及用高真空泵過夜以除去最后微量的溶劑。N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro將N-Cbz-Pro-Ala(5克，15毫摩爾)及羰基二咪唑(2.43克，15毫摩爾)于氬氣氛下置于250毫升3頸圓底燒瓶中。加入無水四氫呋喃(50毫升)并于室溫下攪拌該溶液約45分鐘。觀察到有氣體(CO2)劇烈冒出。
稱量Gly-Pro-OCH3·HCl(2.9克，15毫摩爾)并置入另一燒瓶中。加入四氫呋喃(5毫升)及N，N-二異丙基乙胺(5.23毫升，30毫摩爾)并將該溶液攪拌數分鐘。將溶解的物質通過注射器加到活化的肽中，將剩余的物質溶于最少量的CH2Cl2中并再次通過注射器加到活化的肽中。
將反應溶液于室溫下攪拌過夜(15小時)，于早晨時有大量白色沉淀。將反應混合物用10％檸檬酸水溶液(300毫升)沖洗及用乙酸乙酯(500毫升)萃取。將乙酸乙酯萃取液用飽和碳酸氫鈉水溶液(300毫升)沖洗以及用鹽水(300毫升)及無水硫酸鎂干燥。將乙酸乙酯用旋轉蒸發器除去，得到5克無色油，其表示令人滿意的特征數據。
將N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-OCH3(5克，12毫摩爾)的粗制油溶于在圓底燒瓶內的甲醇(20毫升)中。將該燒瓶置于室溫水浴中。小心加入1N氫氧化鈉溶液(12毫升)。將該溶液攪拌3.5小時，之后加入1N HCl溶液(12毫升)。將該溶液在旋轉蒸發器上濃縮以及加入數滴1N HCl，直至用pH紙測量時，pH為約1.5。將水用真空泵除去得到油，將其從乙醇中緩慢結晶。N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-阿霉素將N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro(180毫克，0.38毫摩爾)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(15毫升)。將1-羥基苯并三唑(51.3毫克，38毫摩爾)及二環己基碳化二亞胺(78毫克，38毫摩爾)各溶于1毫升N，N-二甲基甲酰胺中并以溶液形式加到肽中。將該溶液混合物于室溫攪拌45分鐘。
稱量阿霉素·HCl(116毫克，20毫摩爾)并置入另一小瓶中并溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)中。將N，N-二異丙基乙胺(34.8微升，20毫摩爾)通過注射器加到含阿霉素的小瓶中并將內容物攪拌數分鐘以確保完全溶解。將阿霉素溶液通過注射器加到活化肽中。將該溶液于室溫攪拌48小時。
將產物用乙酸乙酯(2升)萃取及用10％檸檬酸水溶液(500毫升)沖洗。將乙酸乙酯層分離出，用硫酸鎂干燥及在旋轉蒸發器上濃縮成油。將該油在C-18反相硅膠上層析，于rf＝0.25得到橙色、長波UV螢光點。終產物表示令人滿意的特征數據。實施例2FAPα-表達細胞系的制備制備表達重組體FAPα的哺乳動物細胞系。將HT1080纖維瘤細胞{廣為人知及由DSMZ(德國布朗史威格的微生物及細胞培養物的德國收集所)供應，寄存編號為DSMZ ACC315}保持在含10％牛胎血清的DMEM/F12 50∶50混合物中并置于95％空氣及5％CO2組成的氣氛中。將HT1080細胞，按照制造商的說明(Gibco/BRL)，使用脂轉染試劑(Lipofectin)方法，以FAP.38載體(WO 97/34927，Scanlan等人，同上)轉染。根據選擇轉染子以抵抗抗生素(200微克/毫升遺傳霉素(Geneticin))，以及隨后將其保持在含有遺傳霉素的培養基中。選取抗性細胞的個別菌落，使其在10cm的組織培養皿中生長并匯合，以及如Garin-Chesa等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(18)，7235-7239所述，在免疫螢光測定中用FAPα-特異性單克隆抗體F19測試FAPα表達。親代HT1080細胞系顯示在該免疫螢光測定中沒有可檢測出的FAPα表達，而在下文中被稱為HT1080克隆33的克隆中顯示FAPα陽性。
同樣地，將人類胚胎腎293細胞(廣為人知且由美國組織類型收集所(馬利蘭州洛克斐勒市)供應)保持在含10％牛胎血清的DMEM中并在95％空氣及5％CO2組成的氣氛下。將細胞按照現有技術[Park，J.E.，Chen，H.H.，Winer，J.，Houck，K.A.& Ferrara，N.(1994)，胚胎生長因子，在試管中及在活體內血管內皮生長因子生物活性的強化以及與Flt-1以高親和性結合，但不與Flk-1/KDR結合，J.Biol.Chem.269(41)，25646-25654]所述的磷酸鈣轉染法，用FAPα表達載體pFAP.38轉染。如上述在FAPα表達一節所述，選擇及分析轉染子。親代293細胞表示沒有可被檢測的FAPα表達。在下文中被稱為293-I/2)的克隆表示FAPα陽性。實施例3在被轉染細胞系中檢測FAPα的表達在HT1080及HT1080克隆33細胞中檢測FAPα的表達。代謝性標記，免疫沉淀及螢光顯影術主要按照Park et al.(1991)Somatic Cell Mol.Genet.17(2)，137-150所述進行。HT1080及HT1080克隆33細胞用35S-甲硫氨酸進行代謝性標記。這些細胞的洗滌劑萃取液用單克隆抗體F19免疫沉淀或用小鼠igG1抗體作為陰性對照組。將沉淀物在樣品緩沖液中煮沸并通過十二烷基硫酸鈉凝膠電泳而分離(如Laemmli(1970)Nature 227(259)，680-685所述)。生成凝膠的螢光顯影術分析確證HT1080克隆33細胞產生FAPα蛋白質。在親代HT1080細胞的萃取液中及在與小鼠IgG1的免疫沉淀物中都未檢測到FAPα蛋白質。實施例4可溶性重組體FAPαFAPα蛋白質的可溶性重組體形式如下述制備。將編碼小鼠CD8α的細胞外區域(ECD)(由CD8α的N-端189個氨基酸組成)的cDNA(GenbankM12825)與編碼FAPα的細胞外區域(胺基酸27至760)的cDNA相接，產生融合蛋白質構建FAPmCD8，其在結構上與上述的CD8α-CD40配體融合蛋白質(Lane等人(1993)J.Exp.Med.177(4)，1209-1213)相似。cDNA通過定序及插入pVL1393載體而確證。Sf9細胞的轉染及所生成的重組體桿狀病毒的擴增如O′Reilly(1994)在桿狀病毒表達載體實驗室手冊(紐約牛津大學出版社出版)中所述進行。將用重組體FAPmCD8桿狀病毒感染4天的High Five細胞的培養上清液進行收集并通過超離心澄清。將FAPmCD8融合蛋白質用固定在活化瓊脂糖珠粒(美國印第安那州印第安那波里市皮爾斯化學公司)上的抗-FAPα單克隆抗體，從該上清液中純化。將培養基上清液通過抗體親和柱及用0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH3)通過pH移位進行洗脫。將該試樣用飽和Tris溶液(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)立即中和并匯集含蛋白質的部分。實施例5阿霉素-肽共軛物的裂解的測量樣品通過反相高效液相色譜(HPLC)分離，以測量阿霉素-肽共軛物的裂解。HPLC系統由Waters 717自動取樣器組成，該自動取樣器上設有100微升環(loop)及二個Water 510型泵以輸送溶劑。分離是在Nucleosil C-18柱上(100mm長×4mm I.D.，粒徑5微米)(Dr.Ing.H.Knauer GmbH，Berlin)，于等度洗脫(isocratic)條件下以0.7毫升/分鐘的流速下進行分離。移動相由甲醇含0.2M乙酸銨(被調節成pH3.2)的水(70∶30，v/v)組成。游離阿霉素及阿霉素-肽共軛物通過使用Waters 474螢光檢測器，以螢光(激發，475nm；放出，585nm)檢測。注射，溶劑輸送，數據獲得及數據分析都用Millennium2010層析軟件設備(Waters Corp.Milford，MA，USA)進行。首先將待測試的物質溶于二甲基亞砜并使其濃度為5mM，繼而在被施加至HPLC柱中之前以水溶液稀釋。
檢測可溶性重組體FAPα酶使阿霉素-肽共軛物釋出游離阿霉素的能力。將阿霉素-肽共軛物貯存溶液(5mM)用Hepes-緩沖食鹽水(pH7.4)稀釋至最終濃度為50至100μM。將20微升所得的溶液與50微升上述的純化FAPmCD8融合蛋白質(約20微微克)及30微升Hepes-緩沖的食鹽水(pH7.4)混合。讓該混合物于37℃培育1天并以上述HPLC測定法測量游離阿霉素的釋出。用上述軟件裝置定量各峰下的面積并以初值設定為100％。游離阿霉素的釋出速率，在這些HPLC條件下通過具有與游離阿霉素相同的滯留時間的峰的出現而測量。各峰下的面積被用于計算游離阿霉素對于阿霉素-肽共軛物的相對量。用上述Millennium 2010層析軟件裝置積分峰面積，以測定裂解的百分率。如在圖1所示的ZGP-Dox(N-Cbz-Gly-Pro-阿霉素)的層析圖中所見，阿霉素-肽共軛物在與純化FAPmCD8融合蛋白質一起培育后，轉化成游離阿霉素，但該共軛物的滯留時間不會因與緩沖液一起培育而改變。實施例6阿霉素的細胞毒性通過其與FAPα-可裂解性肽共軛而減少在FAPα-陰性、阿霉素-敏感性細胞上，測定FAPα-可裂解性肽封阻阿霉素的細胞毒性作用的能力。將K562細胞[由American Type Tissue CultureCollection，Rockville，MD，USA供應(ATCC編號CCL-243)]接種在96孔平皿(Greiner科學公司)中，密度為1000細胞/孔。將含有各種濃度的游離阿霉素或等摩爾濃度的阿霉素-肽共軛物但未含血清的細胞培養基加到細胞中。4天后，用自動CASYTM細胞計數器(Scharfe System GmbH，Reutlingen，Germany)測定細胞數目。結果示于圖2中。實施例7通過細胞結合的FAPα釋出游離阿霉素檢測與細胞結合的FAPα酶使阿霉素-肽共軛物釋出游離阿霉素的能力。將各共軛物溶于不含血清的細胞培養基中，并使其終濃度為1μM。將10毫升該溶液加到在10cm組織培養皿內匯合成單層的HT1080細胞或HT1080克隆33細胞中，并于37℃培育19小時。將培養基除去并如實施例5所述測量阿霉素的釋出。FAP-表達性細胞系HT1080克隆33，分別將81％的ZGP-Dox(N-Cbz-Gly-Pro-阿霉素)共軛物及43％的ZPAGP-Dox(N-Cbz-Pro-Ala-Gly-Pro-阿霉素)共軛物轉化成游離阿霉素。親代HT1080細胞系于相同條件下僅9％ZGP-Dox轉化成游離阿霉素。在這些條件下極少觀察到或未觀察到通過親代HT1080細胞系將ZPAGP-Dox轉化成游離的阿霉素。實施例8通過FAPα-釋放的阿霉素殺死敏感性細胞測定FAPα產生能殺死阿霉素-敏感性細胞的游離阿霉素的能力。將K562細胞[American Type Tissue Cultare Collecion，Rockville，MD.USA(ATCC編號CCL-243)]接種在96孔平皿(Greiner科學公司)中，密度為1000細胞/孔。將含有1μM阿霉素-肽共軛物但未含血清的細胞培養基加到含HT1080細胞或HT1080克隆33細胞的皿中，并于37℃培育19小時。將培養基移出并如實例5所述確證阿霉素的釋出。然后在每孔的K562細胞內，加入66微升該培養基。4天后，用自動CASYTM細胞計數器測定細胞數目。結果示于圖3中。實施例9阿霉素-肽共軛物的血漿穩定性用實施例5所述的方法測量阿霉素-肽共軛物的血漿穩定性。含有阿霉素-肽共軛物的試樣(濃度為1μM)在存在有10％(v/v)小鼠或人類血漿下，于37℃培育所指出的時間。ZGP-Dox和ZPAGP-Dox在小鼠及人類血漿中的穩定性結果示于圖4中。實施例10選擇性的4-甲氧基-β-萘酰胺-肽共軛物在FAPα催化下的裂解為了鑒定優選的FAPα肽基質，用本技術已知的方法[E.Wunsch，Synthese von Petiden，in Methoden der organischen Chemie，Houben-Weyl(Eds.E.Muller，O.Bayer)，Vol.XV，Part 1 and 2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974]合成由天然及/或非天然氨基酸組成的寡聚物，并與脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺(Pro-MNA)偶合。
Pro-Pro-4-甲氧基-β-萘胺的合成將Boc-Pro(32毫克，0.15毫摩爾)，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽(53毫克，0.15毫摩爾)及Pro-4-甲氧基-β-萘酰胺鹽酸鹽(46毫克，0.15毫摩爾)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺/四氫呋喃1∶1(4毫升)中。加入溶于N-甲基吡咯烷酮(1.7摩爾)的N-乙基二異丙胺(0.26毫升，0.44毫摩爾)并將該混合物于室溫攪拌過夜。
溶劑用旋轉蒸發器除去并將殘余物溶于乙酸乙酯(10毫升)及用水萃取3次。將有機層用無水硫酸鈉干燥并將溶劑用旋轉蒸發器除去。將殘余物溶于三氟乙酸/二氯甲烷(1∶4，25毫升)并使其反應1小時。將溶劑用旋轉蒸發器除去并將生成的油用氮氣流干燥。粗制產物通過制備用反相HPLC(使用乙腈/水梯度洗脫)純化。該產物表示令人滿意的分析數據(NMR及質譜)。
從肽釋出游離MNA然后在Cytofluor螢光測定計(Per-Septive生物系統公司)中用355nm激發/405nm射出濾器裝置測量。酶動力參數(Michaelis-MentenKm及kcat值)，是采用從實例2的293-I/2被轉染細胞的膜萃取物衍生的FAPα酶，按照本技術已知的方法(例如參見Yun，S.L.& Suelter，C.H.(1977)，一種由酶反應進行曲線計算Km及V的簡便方法，Biochim.Biophys.Acta 480(1)，1-13)進行計算。表1選擇的4-甲氧基-β-萘酰胺(MNA)-肽共軛物的FAPα催化性裂解的Km及kcat值

Chg＝環己基甘氨酸，Hyn＝6-羥基正亮胺酸，反式-Hyp＝反式-4-羥基脯氨酸，Met(O)＝蛋氨酸-S-氧化物。實施例11MNA-偶合肽對FAPα的特異性并與DPP-IV加以比較在已知的脯氨酰基-特異性絲氨酸寡肽酶族成員中，與FAPα最密切相關的酶為DPP-IV。由于活性DPP-IV是在血漿中及在許多不同細胞類型中發現，與DPP-IV相比藥物前體肽對于FAPα選擇性必須達到最佳，以使藥物前體在腫瘤以外的部位(例如血漿)的不期望轉變減少。為鑒別對FAPα具特異性的肽，將FAPα裂解MNA-肽共軛物的能力與DPP-IV裂解相同肽共軛物的能力進行比較。如實施例9所述測量游離MNA的釋出。結果示于表2中。表2比較MNA-肽共軛物被FAPα裂解及被DPP-IV裂解的選擇性

+表示酶能裂解基質-表示缺乏裂解能力實施例12在腫瘤樣品中的FAPα活性測量在人腫瘤樣品中的FAPα的酶活性。將96-孔ELISA(酶-連接免疫吸著劑測定)平皿(紐約Costar，Corning公司)于4℃下，用在磷酸鹽-緩沖食鹽水(PBS)(pH7.4)中的F19抗體或對照抗體1微克/毫升涂布過夜。然后將孔用沖洗緩沖液(PBS，0.1％Tween 20，pH7.4)清洗以及過多的結合部位用封阻緩沖液(溶于PBS的5％牛血清白蛋白，pH7.4)在室溫下封阻1小時。測量在腫瘤組織(實心符號)或配對的正常對照組織(對應空心符號)中的FAPα活性，樣品來自其富含伴刀豆球蛋白的膜萃取物(圖5a)。腫瘤樣品包括乳腺癌(，■)，結腸癌(●)，被轉移至肝的結腸癌(◆)以及肺癌(▲，+)。將萃取物加到被F19涂布的平皿中并于室溫培育1小時。將未結合的物質除去，將孔用沖洗緩沖液沖洗三次以及FAPα酶活性通過使用WO 97/34927所述的Ala-Pro-AFC 100微升于37℃培育1小時而測定。測量各萃取物的最初二個伴刀豆球蛋白A部分以及各值被各別作圖。從各值減去背景螢光(用對照抗體涂布的平皿進行測量)。
在腫瘤萃取物中，FAPα酶活性的單獨生化確認及其表觀分子量是通過上述組織萃取物用14C-標記的氟磷酸二異丙酯(DEP；NEN-DuPont，Cologne，Germany)進行標記而得到。已知DFP與許多絲氨酸蛋白酶的活性部位絲氨酸會不可逆地共價結合，因而防止進一步的催化[Hayashi，R.，Bai，Y.& Hata，T.(1975)羧基肽酶Y被進一步確認為一種具有反應性絲氨酸殘基的不含金屬的酶，J.Biochem.77(6)，1313-1318；Wahlby，S & Engstrom，L.(1968)對灰鏈霉菌蛋白酶II(streptomyces griseus protease)的研究，在具有酯酶活性的DFP-敏感性成分的反應性絲氨酸殘基周圍的氨基酸序列，Biochim.Biophys.Acta151(2)，402-408]。從相應于圖5a的結腸癌樣品●的腫瘤(T)中免疫純化所得的14C-DFP標記的FAPα示于圖5b中。這些樣品的十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳[Laemmli，U.K.(1970)在噬菌體T4的頭部組合期間結構蛋白質的裂解，Nature 227(259)，680-685]及接下來的放射自顯影術[Park，J.E.，Draper，R.K.& Brown，W.J.(1991)在核內體酸化的條件性缺陷的End3互補基團的細胞中的溶酶體酶的生物合成，Somatic Cell Mol.Genet.17(2)，137-150]顯示在結腸癌樣品中存在標記的95kD蛋白質。在正常相應對照免疫沉淀物(N)中或使用對照抗體時皆未觀察到放射線標記的帶。如圖5b所示，被免疫純化的14C-標記蛋白質的表觀分子量與先前對FAPα所報告的相符[Retting，W.J.，Su，S.L.，Fortunato，S.R.，Scanlan，M.J.，Mohan Raj，B.K.，Garin-Chesa，P.，Healey，J.H.& Old，L.J.(1994)成纖維細胞活化蛋白質純化，抗原表位的定位及通過生長因子誘生，Int.J.Cancer 58(3)，385-392；WO97/34927]。實施例13經保護寡肽的制備經保護寡肽或按照本技術的方法(例如M.Bodanszky and A.Bodanszky，“肽合成的實施”，2ndedition，Springer，New York，1994)在溶液中制備，或是在應用生物系統430A型自動肽合成器上通過固相合成法制備。寡肽的去保護及從樹脂支持物的除去通過用三氟乙酸與經常使用的清除添加劑的混合物處理而達成。純化是在反相C18硅膠柱上通過制備用高壓液相層析而進行，其中使用0.1％三氟乙酸/乙腈水溶液梯度洗脫。肽的同一性及均勻性通過高壓液相層析及質譜分析而確證。通過該法制備的寡肽示于表3中。表3寡肽

Z為芐基氧羰基Fmoc為9-芴基甲氧羰基Chg為L-環己基甘氨酰基Nle為正亮氨酰基Hyn為L-6-羥基正亮氨酰基實施例14Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox的制備將Fmoc-Pro-Ala-Gly-Pro-OH(44毫克，0.078毫摩爾)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)中以及pH值通過加入N，N-二異丙基乙胺調整至7.5。加入N-羥基琥珀酰亞胺(1M，溶于DMF，78微升，0.078毫摩爾)以及將該混合物在冰浴中冷卻。于攪拌下，加入二環己基碳化二亞胺(1M，溶于DMF，87微升，0.087毫摩爾)并將該溶液于0℃攪拌1小時。將阿霉素*HCl(25毫克，0.043毫摩爾)溶于20毫升無水DMF及加入N，N-二異丙基乙胺(8.2微升，0.048毫摩爾)。將該混合物用注射器加到活化肽中。讓反應物溫熱至室溫并攪拌48小時。
然后除去溶劑以及產物在C18柱上通過制備用RP-HPLC純化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脫。
分析用HPLC＞90％；ES-MS1110.5(M+Na+)；674.4實施例1 5H-Pro-Ala-Gly-Pro-Dox的制備將Fmoc-PAGP-Dox(在實施例14中制備，44毫克，0.040毫摩爾)于0℃溶于THF/二乙胺(2∶1，20毫升)并攪拌2小時。將溶劑除去并將產物在C18柱上通過制備用RP-HPLC純化，使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脫。
分析用HPLC＞90％；ES-MS866.6[M+H]+，452.4實施例16H-Chg-Pro-Dox的制備將Fmoc-Chg-Pro-OH(46毫克，0.096毫摩爾)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)以及pH值通過加入N，N-二異丙基乙胺調整至7.5。加入N-羥基琥珀酰亞胺(1M，溶于DMF，96微升，0.096毫摩爾)以及將該混合物在冰浴中冷卻。于攪拌下，加入二環己基碳化二亞胺(1M，溶于DMF，107微升，0.107毫摩爾)并將該溶液于0℃攪拌1小時。將阿霉素*HCl(31毫克，0.053毫摩爾)溶于20毫升無水DMF并加入N，N-二異丙基乙胺(10微升，0.059毫摩爾)。將該混合物用注射器加到活化肽中。讓反應物溫熱至室溫并攪拌48小時。
然后除去溶劑以及產物在C18柱上通過制備用RP-HPLC純化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脫。
將凍干的產物于0℃下溶于THF/二乙胺(2∶1，20毫升)并攪拌2小時。除去溶劑以及產物在C18柱上通過制備用RP-HPLC純化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脫。
分析用HPLC＞90％；ES-MS 780.2(M+H+)；366.4
下表列出以類似方法制備的肽-阿霉素共軛物以及包括被FAP裂解的數據(20小時后)。
表4


Z為芐基氧羰基Fmoc為9-芴基甲氧羰基Chg為L-環己基甘氨酰基Nle為正亮氨酰基Hyn為L-6-羥基正亮氨酰基實施例17N-Cbz-Gly-Pro-苯丙氨酸氮芥的制備

將N-Cbz-Gly-Pro-OH(22毫克，0.072毫摩爾)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(8毫升)以及pH值通過加入N，N-二異丙基乙胺調整至7.5。加入N-羥基琥珀酰亞胺(1M，溶于DMF，72微升，0.072毫摩爾)以及將該混合物在冰浴中冷卻。在攪拌下，加入二環己基碳化二亞胺(1M，溶于DMF，67微升，0.67毫摩爾)并將該溶液于0℃攪拌2小時。將苯丙氨酸氮芥(14.7毫克，0.048毫摩爾)溶于30毫升無水DMF及加入N，N-二異丙基乙胺(12.3微升，0.072毫摩爾)。將該混合物用注射器加到活化肽中。讓反應物溫熱至室溫并攪拌24小時。
然后除去溶劑以及產物在C18柱上通過制備用RP-HPLC純化，其中使用含0.1％三氟乙酸的水/乙腈梯度洗脫。
分析用HPLC＞90％；ES-MS 593.0([M+H]+)。
權利要求
1.一種式(I)化合物或其藥物上允許的鹽 式中R1代表氨烷酰基或寡肽酰基，其N-端氨基官能可與封端基相接；Ra及Rb與在其間的N-C基共同形成3-至7-員飽和或不飽和雜環，其可任選地被取代或者可任選地與苯環或環己烷稠合，雜環中一或二個CH2也可被NH、O或S取代；R4代表H、C1-C6-烷基、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基；以及Cyt′代表細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基；其條件為排除N2-乙酰基-L-高精氨酰基-L-酪氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-絲氨酰基-N-[2，3，6-三去氧-1-O-[(1S，3S)-1，2，3，4，6，11-六氫-3，5，12-三羥基-3-(羥基乙酰基)-10-甲氧基-6，11-二氧基-1-并四苯基]-α-L-來蘇-己吡喃糖-3-基)-L-脯氨酰胺；以及N2-乙酰基-L-高精氨酰基-L-酪氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-絲氨酰基-L-絲氨酰基-N-[2，3，6-三去氧基-1-O-[(1S，3S)-1，2，3，4，6，11-六氫-3，5，12-三羥基-3-(羥乙酰基)-10-甲氧基-6，11-二氧基-并四苯基]-α-L-來蘇-己吡喃糖-3-基]-L-脯氨酰胺。
2.根據權利要求1所述的式(I)化合物，其中R1代表式Cg-A、Cg-B-A或Cg-(D)m-B-A的殘基，其中Cg代表氫原子或選自R5-CO、R5-O-CO-、R5-NH-CO-、R5-SO2-或R5-中的封端基，其中R5可任選地被C1-C6-烷基、C3-C8-環烷基、芳基、芳烷基或雜芳基取代；A，B及D各獨立代表衍生于式-[NR6-(X)p-CO]-的氨基羧酸的部分，其中X代表CR7R8以及R6，R7及R8各獨立代表氫原子、可任選地被取代的C1-C6-烷基、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基，以及p為1，2，3，4或5；或者A，B及D各獨立代表衍生于如下式的環形氨基羧酸的部分 其中R9代表C1-C6-烷基、OH或NH2，m為整數1至10；q為0，1或2；以及r為0，1或2。
3.根據權利要求1或2的式I化合物，其中由Ra及Rb與在其間的N-C共同形成的雜環可被R2及R3取代，其中R2及R3各獨立代表氫或鹵素原子，或者C1-C6-烷基、C1-C6-烷基氨基、二-C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷氧基、硫醇基、C1-C6-烷硫基、氧基、亞氨基、甲酰基、C1-C6-烷氧羰基、氨羰基、C3-C8-環烷基、芳基或雜芳基。
4.一種式IA的化合物 其中R2、R3、R4、Cyt′如前述權利要求中任一項所界定，R1代表氨烷酰基或寡肽酰基，以及X-Y代表CHR2-CH2、CR2＝CH、NH-CH2、CH2-NH、-CR2-、CH2-CHR2-CH2；其條件是，當X-Y代表CH2-CH2基時，R1代表氨烷酰基、二-或三-肽酰基，或者R1代表具有三個以上氨基酸部分但不含Gln-Ser氨基酸序列的寡肽酰基。
5.一種式IA1化合物 其中R1代表氨烷酰基、二-或三-肽酰基，以及Cyt′如前述權利要求中的任一項所界定。
6.一種選自式IA2、IA3、IA4及IA5的化合物 其中R1及Cyt′如前述權利要求中的任一項所界定。
7.根據前述權利要求中的任一項的化合物，其中R1代表氨烷酰基或寡肽酰基，該寡肽酰基衍生于甘氨酸(Gly)，或者D-或L-形式的丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰氨(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、4-羥基-脯氨酸(Hyp)、5-羥基賴氨酸(Hyl)、正亮氨酸(Nle)、5-羥基正亮氨酸(Hyn)、6-羥基正亮氨酸(Hyn)、鳥氨酸或環己基甘氨酸(Chg)、其條件為，寡肽酰基具有3個以上氨基酸單元，其中排除Gln基直接鍵結到Ser基。
8.根據前述權利要求中的任一項的式I化合物，其中單元A衍生于L-脯氨酸、甘氨酸、L-正亮氨酸、L-環己甘氨酸、L-5-羥基正亮氨酸、L-6-羥基正亮氨酸、L-5-羥基賴氨酸、L-精氨酸或L-賴氨酸。
9.根據前述權利要求中的任一項的化合物，其中R1為選自式(1)至(34)的基H-Chg (1) H-Tle (18)H-Lys (2) H-Hyl (19)H-Nle (3) H-Hse (20)H-Ala (4) Cg-Gly (21)H-Hyn (5) Cg-Nle (22)H-Pro (6) Cg-Val (23)H-Phg (7) Cg-Met (24)H-Gln (8) H-Xxx-Lys (25)H-反式-Hyp(9) H-Xxx-Hyn (26)H-Val (10) H-Xxx-Pro (27)H-Cha (11) H-Xxx-His (28)H-Met (12) H-Xxx-Met (29)H-Nva (13) H-Xxx-Ala (30)H-Met (14) Cg-Xxx-Hyn (31)H-β-Cpa (15) Cg-Xxx-Ala-Gly (32)H-Ile (16) Cg-(Xxx)m-Xxx-Ala-Gly (33)H-Ser (17) Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly (34)其中Cg代表氫原子或選自芐酰氧羰基、苯乙酰基、苯甲磺酰基及芐氨羰基的封端基；Xaa代表衍生于氨基羧酸的部分；以及m為整數1至6。
10.根據權利要求9的化合物，其中氨基烷酸部分存在(L)-構形中。
11.根據權利要求1至10中任一項的化合物，其中H2N-Cyt′為蒽環類衍生物。
12.根據權利要求11的化合物，它選自式(IIIA)至(IIIF)
13.一種能通過FAPα的催化作用轉化為藥物的藥物前體，該藥物前體具有被FAPα識別的裂解部位，以及該藥物在生理條件下具有細胞毒性或細胞抑制性。
14.根據權利要求13的藥物前體，其包含具有至多13個氨基羧酸殘基的寡聚物部分以及細胞毒性或細胞抑制性部分，其中寡聚物部分的C-端氨基羧酸殘基為可任選地被取代且可任選地與苯環或環己烷稠合的3-至7-員環形氨基酸，以及C-端羧基官能通過酰氨鍵與細胞毒性或細胞抑制性部分連接。
15.根據權利要求14的藥物前體，其中C-端氨基羧酸殘基選自D-脯氨酸、L-脯氨酸、D-羥基脯氨酸及L-羥基脯氨酸。
16.根據權利要求15的藥物前體，其中寡聚物部分包含2，3或4個氨基羧酸殘基。
17.根據權利要求14，15或16的藥物前體，其中N-端氨基官能通過封端基保護。
18.根據前述權利要求中的任一項的化合物，其用于醫療。
19.一種藥物組合物，其包含權利要求1至18中任一項的化合物，以及可任選地包含一種或以上醫藥上可接受的賦形劑。
20.一種權利要求1至18中任一項的化合物的用途，其用于制備治療癌癥用的藥物組合物。
21.一種權利要求1至18中任一項的化合物的制法，其特征為將式(V)化合物 與化合物HN(R4)-Cyt′反應式(V)中R1，Ra及Rb如權利要求1所定義，X1代表OH或適于被氨基取代的離去基，HN(R)4-Cyt中的Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基，以及R4如權利要求1定義。
22.一種權利要求1至18中任一項的化合物的制法，其特征為將式(VI)化合物與化合物H2N-Cyt′或化合物HO-Cyt′(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基)反應 式(VI)中R1，Ra及Rb如權利要求1所定義，Y1代表L-COX2，其中L為連接子殘基，以及X2代表OH或適于被氨基或羥基取代的離去基，
23.一種權利要求1至18中任一項的化合物的制備方法，其特征為將式(VII)化合物與化合物X3OC-Cyt′(其中X3為OH或適于被氨基或羥基取代的離去基，以及Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基)反應 式(VII)中R1，Ra及Rb如權利要求1所定義，y2為式L-OH或L-NH2，其中L為連接子殘基。
24.一種權利要求1至18中任一項的化合物的制造方法，其特征為將式(VIII)化合物與化合物NH(R4)-Cyt′(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基)反應 式(VIII)中PG1為保護基，以及其他取代基具有如前文所述的意義然后將保護基PG1除去并將生成的式(VIIIA)化合物 與化合物PG2-A-X4(其中PG2為保護基以及X4代表OH或適于被氨基取代的離去基)反應；以及若需要可再進行一偶合步驟，直至得到完全的化合物為止。
25.一種權利要求1至18中任一項的化合物的制備方法，其特征為將式PG3-N(R4)-L-COX3化合物(其中PG3為保護基以及具有上文所述意義的其他取代基)與式Y4-Cyt′化合物(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基；以及Y4代表H2N或HO)反應；然后除去保護基PG3；以及將生成的式HN(R4)-L-Y4-Cyt′化合物與式(VIII)化合物反應 然后除去保護基PG1；并將生成的下式化合物 與化合物PG4-A-X4(其中PG4為保護基，以及X4為OH或適于被氨基取代的離去基)反應；以及若需要可再進行一偶合步驟，直至得到完全的分子為止。
26.一種式(I)化合物的制法，其特征為式PG5-N(R4)-L-Y5化合物(其中PG5代表保護基，Y5代表OH或NH2以及具有上文所述意義的取代基)與式X5OC-Cyt′的化合物(其中Cyt′為細胞毒性或細胞抑制性化合物的殘基以及X5為OH或適當離去基)反應；然后除去保護基PG5；以及將生成的式HN(R4)-L-Y5-CO-Cyt′化合物與下式(VIII)化合物反應 然后除去保護基；以及將生成的下式化合物 與式PG2-A-X4的化合物(其中PG2為保護基，以及X4為OH或適于被氨基取代的離去基)反應；以及若需要可再進行一偶合步驟，直至得到完全的分子為止。
27.一種式VIIIA化合物 其中Ra，Rb，R4及Cyt′如權利要求1所定義。
29.治療癌癥的方法，其包含將權利要求19所述的藥物組合物投與病人。
29.治療癌癥的方法，其包含將藥物前體投給病人，該藥物前體可通過酶活性轉化成細胞毒性或細胞抑制性藥物，以及該酶活性為FAPα的活性。
30.一種通過酶活性可轉化成細胞毒性或細胞抑制性藥物的藥物前體的用途，其中該酶活性為FAPα的活性，以使該藥物前體可用于制造治療癌癥的藥物。
全文摘要
本發明是關于一種能通過人類成纖維細胞活化蛋白質(FAPα)的催化作用而轉化成藥物的藥物前體,該藥物前體具有能被FAPα識別的裂解部位,以及該藥物于生理條件下具有細胞毒性或細胞抑制性。
文檔編號C07K5/06GK1374969SQ00807538
公開日2002年10月16日 申請日期2000年5月11日 優先權日1999年5月14日
發明者約翰·E·帕克, 沃爾夫岡·J·雷蒂格, 馬丁·倫特, 斯蒂芬·彼得斯, 于爾根·麥克, 迪特馬·利珀特, 皮拉·加林－切薩, 雷蒙德·A·費爾斯通, 利拉·A·特蘭 申請人:貝林格爾英格海姆法瑪公司