本發(fa)明屬于藥(yao)(yao)物(wu)合成(cheng)(cheng)領域，具體是涉及一(yi)種抗(kang)血管生(sheng)成(cheng)(cheng)藥(yao)(yao)物(wu)和抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)細胞增(zeng)殖藥(yao)(yao)物(wu)聯合用(yong)藥(yao)(yao)抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)藥(yao)(yao)物(wu)、制備方法及應(ying)用(yong)。

背景技術：

7-乙(yi)基-10-羥基喜樹堿(SN38)是臨床抗腫瘤(liu)(liu)藥物(wu)(wu)伊立替康(CPT-11)的(de)(de)(de)(de)活性產物(wu)(wu)。SN38以拓(tuo)撲異構酶為靶向部位(wei)，抑制拓(tuo)撲異構酶I-DNA復合物(wu)(wu)結合，從(cong)而(er)(er)(er)阻(zu)止斷裂(lie)單鏈的(de)(de)(de)(de)再連接(jie)，使(shi)DNA雙鏈結構解(jie)旋而(er)(er)(er)發揮抗腫瘤(liu)(liu)作用(yong)。SN38在體(ti)外顯示較高的(de)(de)(de)(de)活性，是CPT-11活性的(de)(de)(de)(de)100～1000倍(bei)。因(yin)此(ci)(ci)，直接(jie)利用(yong)SN38分子，避開對CPT-11進行酶解(jie)從(cong)而(er)(er)(er)釋(shi)放SN38的(de)(de)(de)(de)途徑，可望有效(xiao)提高藥物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)抗腫瘤(liu)(liu)效(xiao)果。但(dan)是SN38的(de)(de)(de)(de)水溶性很(hen)差，且不溶于(yu)藥劑(ji)(ji)學上可以接(jie)受的(de)(de)(de)(de)溶劑(ji)(ji)(如吐溫或者聚氧乙(yi)烯蓖麻油)，因(yin)此(ci)(ci)無法(fa)直接(jie)用(yong)于(yu)臨床注射。

此外，腫(zhong)瘤(liu)(liu)治療臨床研究表明，長時間使(shi)用單一的(de)抑制腫(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)胞生長的(de)化療藥(yao)(yao)物會產生耐藥(yao)(yao)性。隨著抗血(xue)管治療腫(zhong)瘤(liu)(liu)相關研究方(fang)案的(de)不斷(duan)深(shen)入，抗血(xue)管生成藥(yao)(yao)物聯合應用抗腫(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)胞增殖藥(yao)(yao)物的(de)抗癌(ai)策略，為腫(zhong)瘤(liu)(liu)的(de)治療提供了新的(de)思路和方(fang)向。

惡性腫(zhong)瘤(liu)的生(sheng)長(chang)(chang)和轉移依賴(lai)于腫(zhong)瘤(liu)血(xue)管(guan)，隨著(zhu)腫(zhong)瘤(liu)血(xue)管(guan)新(xin)(xin)生(sheng)機(ji)制研究的深入以及以腫(zhong)瘤(liu)血(xue)管(guan)為靶點的藥(yao)物(wu)在臨床治(zhi)療腫(zhong)瘤(liu)時取(qu)得較(jiao)好(hao)的療效，證實了通過(guo)抑制腫(zhong)瘤(liu)血(xue)管(guan)新(xin)(xin)生(sheng)來抑制腫(zhong)瘤(liu)生(sheng)長(chang)(chang)的理(li)念。

康普瑞汀(ting)A4(Combretastatin，CA4)是從非洲灌木Combretum Caffrum 的樹皮(pi)分離(li)的一種順式(shi)二苯乙烯類天然產物(wu)，屬于秋(qiu)水仙(xian)堿(jian)樣的微(wei)管組裝(zhuang)抑制劑，能(neng)夠特(te)異性地靶向腫瘤血管內(nei)皮(pi)細胞，破壞內(nei)皮(pi)細胞骨(gu)架引(yin)起細胞結構(gou)發(fa)生變(bian)化，從而導致腫瘤血管的減少，引(yin)起腫瘤中(zhong)央(yang)區域發(fa)生壞死(si)。CA4結構(gou)式(shi)如下(xia)式(shi)所示：

但是我(wo)們前期的(de)實驗顯示，SN38由于(yu)其(qi)獨特的(de)化(hua)學結構，難以(yi)直接與兩親性高分(fen)子(zi)材(cai)料(liao)共(gong)組裝形成(cheng)納米粒。而CA4則在高分(fen)子(zi)材(cai)料(liao)納米粒中存在快速(su)釋放(fang)的(de)問(wen)題。

技術實現要素：

本發明的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)在于提供(gong)一(yi)種抗(kang)血(xue)管(guan)生成藥物(wu)和抗(kang)腫(zhong)瘤細胞(bao)增殖(zhi)(zhi)藥物(wu)聯(lian)合用(yong)藥的(de)(de)(de)抗(kang)腫(zhong)瘤藥物(wu)，實現抗(kang)血(xue)管(guan)生成藥物(wu)和抗(kang)腫(zhong)瘤細胞(bao)增殖(zhi)(zhi)藥物(wu)聯(lian)合用(yong)藥的(de)(de)(de)抗(kang)癌策(ce)略，提高聯(lian)合用(yong)藥的(de)(de)(de)療效。

本發明還提供(gong)了一種抗(kang)血管生成藥物和抗(kang)腫瘤細胞增殖藥物聯合用藥的抗(kang)腫瘤藥物制劑。

本發明同時(shi)公(gong)開了(le)一(yi)種抗(kang)血管生成(cheng)藥物(wu)和抗(kang)腫瘤細(xi)胞增殖藥物(wu)聯合用藥的抗(kang)腫瘤藥物(wu)制(zhi)(zhi)劑的制(zhi)(zhi)備(bei)方法。

本發明中將(jiang)采用先進的(de)納米(mi)制備技術，將(jiang)難溶于水的(de)抗腫瘤(liu)藥物(wu)和抗血管生成(cheng)藥物(wu)包載于兩親(qin)性(xing)高分子(zi)材料中，形成(cheng)載藥納米(mi)體系，同時克服了，SN38難以(yi)直(zhi)接與兩親(qin)性(xing)高分子(zi)材料共組裝形成(cheng)納米(mi)粒的(de)問題。

針對現(xian)有納米技(ji)術制備抗(kang)(kang)血(xue)管生成(cheng)藥(yao)物(wu)聯(lian)(lian)合(he)(he)應用(yong)(yong)抗(kang)(kang)腫瘤(liu)(liu)細(xi)胞增殖藥(yao)物(wu)存在(zai)的(de)問(wen)題(ti)，本發(fa)明將提出一種康普瑞汀前體聯(lian)(lian)合(he)(he)應用(yong)(yong)喜(xi)樹堿抗(kang)(kang)腫瘤(liu)(liu)藥(yao)物(wu)前體的(de)抗(kang)(kang)癌方法，并將該聯(lian)(lian)合(he)(he)用(yong)(yong)藥(yao)方法與先進納米技(ji)術結合(he)(he)，制備抗(kang)(kang)腫瘤(liu)(liu)治療的(de)聯(lian)(lian)合(he)(he)用(yong)(yong)藥(yao)的(de)納米釋放體系，實現(xian)抗(kang)(kang)血(xue)管生成(cheng)藥(yao)物(wu)和(he)抗(kang)(kang)腫瘤(liu)(liu)細(xi)胞增殖藥(yao)物(wu)聯(lian)(lian)合(he)(he)應用(yong)(yong)的(de)價值，改善臨(lin)床抗(kang)(kang)腫瘤(liu)(liu)治療的(de)療效。

一種(zhong)聯合(he)用(yong)藥(yao)抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)藥(yao)物(wu)(wu)，包括抗血(xue)管(guan)生(sheng)成藥(yao)物(wu)(wu)、抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)細胞(bao)增殖(zhi)藥(yao)物(wu)(wu)和兩(liang)親性高分子材料；所(suo)述抗血(xue)管(guan)生(sheng)成藥(yao)物(wu)(wu)為康普瑞汀A4的藥(yao)物(wu)(wu)前體，所(suo)述抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)細胞(bao)增殖(zhi)藥(yao)物(wu)(wu)為喜樹堿(jian)類(lei)抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)藥(yao)物(wu)(wu)。

作為(wei)優(you)選，所述(shu)康普瑞汀A4的(de)藥物前體(ti)結構如下：

所述R為C1～C10的烷(wan)酰基。

作為(wei)(wei)進(jin)一步(bu)優(you)選，所述康(kang)普瑞(rui)汀(ting)A4的藥物前體為(wei)(wei)康(kang)普瑞(rui)汀(ting)A4(CA4)與(yu)丁酸(suan)或(huo)(huo)庚酸(suan)或(huo)(huo)其對(dui)應的酰氯、酸(suan)酐酯化得(de)到的藥物前體。

作為優選，所述康普(pu)瑞汀A4的藥(yao)物前體結構如下：

上述康普(pu)瑞(rui)汀A4的藥物前體可由康普(pu)瑞(rui)汀A4(CA4)與丁酸或庚酸酯化得到。

作為(wei)(wei)優選，所述的(de)抗腫瘤細胞增(zeng)殖藥(yao)物為(wei)(wei)7-乙基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-10-羥基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)喜樹堿與不飽和脂肪酸(suan)連接形成的(de)藥(yao)物前體。反應過程中(zhong)，可(ke)(ke)根據需(xu)要(yao)添加催(cui)化(hua)劑(ji)，縮(suo)合(he)劑(ji)等，比(bi)如可(ke)(ke)采用(yong)1-(3-二(er)甲(jia)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)丙(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))-3-乙基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)碳(tan)二(er)亞(ya)胺的(de)鹽(yan)酸(suan)鹽(yan)作為(wei)(wei)縮(suo)合(he)劑(ji)，4-二(er)甲(jia)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)吡啶作為(wei)(wei)催(cui)化(hua)劑(ji)，同時可(ke)(ke)利用(yong)N,N-二(er)異丙(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)乙胺中(zhong)和1-(3-二(er)甲(jia)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)丙(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))-3-乙基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)碳(tan)二(er)亞(ya)胺的(de)鹽(yan)酸(suan)鹽(yan)中(zhong)的(de)鹽(yan)酸(suan)。作為(wei)(wei)進一步優選，所述康普瑞(rui)汀(ting)A4與羧(suo)酸(suan)、催(cui)化(hua)劑(ji)、縮(suo)合(he)劑(ji)的(de)摩(mo)爾比(bi)為(wei)(wei)1:(1～1.5):(0.5～1.5):(1～1.5)。

作(zuo)為優選(xuan)(xuan)，所述不飽和脂肪酸(suan)(suan)(suan)(suan)選(xuan)(xuan)自二十二碳六(liu)烯酸(suan)(suan)(suan)(suan)、全(quan)反式維甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)、亞麻酸(suan)(suan)(suan)(suan)、油(you)(you)酸(suan)(suan)(suan)(suan)或亞油(you)(you)酸(suan)(suan)(suan)(suan)。

作為優選，所述兩親性高分子材料選自聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸(PEG-PLGA)、甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-PLA)或甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸(mPEG-PLGA)中的任意一種。其中，PEG或mPEG的分子量為2k～8k，PLA的分子量為2k～16k，PLGA的分子量為2k～16k。優選為mPEG_5k-PLA_16k。

本發明還提(ti)供了一(yi)種(zhong)聯合用藥(yao)(yao)(yao)抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)藥(yao)(yao)(yao)物制(zhi)劑(ji)，所(suo)述(shu)抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)藥(yao)(yao)(yao)物為上述(shu)任(ren)一(yi)項(xiang)所(suo)述(shu)的(de)抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)藥(yao)(yao)(yao)物。所(suo)述(shu)制(zhi)劑(ji)可為常(chang)見的(de)劑(ji)型，比(bi)如可為粉(fen)劑(ji)或(huo)片(pian)劑(ji)、注射(she)劑(ji)、丸(wan)劑(ji)等等。

本發明(ming)還提供(gong)了(le)一種上述(shu)聯合用(yong)藥(yao)(yao)抗(kang)(kang)(kang)腫瘤(liu)藥(yao)(yao)物(wu)制(zhi)劑的制(zhi)備方法，包括(kuo)：將抗(kang)(kang)(kang)血管生成(cheng)藥(yao)(yao)物(wu)、抗(kang)(kang)(kang)腫瘤(liu)細(xi)胞增殖藥(yao)(yao)物(wu)和兩(liang)親(qin)性高分子材(cai)料溶(rong)于(yu)有機溶(rong)劑中(zhong)，然后(hou)加入到(dao)(dao)水(shui)中(zhong)，得(de)到(dao)(dao)所述(shu)抗(kang)(kang)(kang)腫瘤(liu)藥(yao)(yao)物(wu)制(zhi)劑。

具體講，包括：

第一步：對(dui)(dui)喜樹堿衍生物(wu)7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)進行分(fen)子(zi)改性(xing)，偶(ou)聯(lian)不飽和脂肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，選自(zi)二十二碳六(liu)烯酸(suan)(suan)(suan)(suan)(DHA)、全(quan)反式維(wei)甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)(RA)、亞麻酸(suan)(suan)(suan)(suan)(LNA)、油酸(suan)(suan)(suan)(suan)或亞油酸(suan)(suan)(suan)(suan)(LA)，賦予藥(yao)物(wu)分(fen)子(zi)親(qin)脂性(xing)。而親(qin)脂性(xing)SN38衍生物(wu)能夠在(zai)體(ti)內釋(shi)放(fang)(fang)具有(you)抗癌(ai)活(huo)性(xing)的SN38分(fen)子(zi)；對(dui)(dui)康普瑞(rui)汀A4(CA4)進行分(fen)子(zi)改性(xing)，偶(ou)聯(lian)飽和脂肪(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(丁(ding)酸(suan)(suan)(suan)(suan)或庚酸(suan)(suan)(suan)(suan))，減緩藥(yao)物(wu)從納米粒中的釋(shi)放(fang)(fang)速度；

第(di)二步(bu)：構建同時負載第(di)一步(bu)SN38前(qian)(qian)藥和CA4前(qian)(qian)藥的納(na)米(mi)粒(li)，該納(na)米(mi)粒(li)由(you)CA4前(qian)(qian)藥、SN38前(qian)(qian)藥和兩(liang)親性高(gao)分子組成。

本發(fa)明提供了一種上述任一方案所(suo)述聯(lian)合用藥抗腫瘤(liu)藥物在抗腫瘤(liu)中的應用。

本發明的(de)載(zai)抗(kang)血(xue)(xue)管生成藥物和(he)(he)抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)殖(zhi)藥物聯(lian)合(he)(he)(he)用(yong)藥納米(mi)粒，在體外能夠抑制腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)血(xue)(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)增(zeng)殖(zhi)、抑制血(xue)(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)遷移(yi)和(he)(he)侵襲、抑制血(xue)(xue)管管腔的(de)形成。本發明的(de)聯(lian)合(he)(he)(he)用(yong)藥納米(mi)粒在體內(nei)也顯示了較(jiao)好的(de)抑制腫(zhong)瘤(liu)增(zeng)長的(de)能力，進一(yi)步證實本發明中(zhong)抗(kang)血(xue)(xue)管生成藥物和(he)(he)抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)殖(zhi)藥物聯(lian)合(he)(he)(he)用(yong)藥納米(mi)粒在抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)治療中(zhong)具有廣闊的(de)應(ying)(ying)用(yong)價值(zhi)和(he)(he)應(ying)(ying)用(yong)范圍。

而且，細胞(bao)毒性實驗表明本(ben)發(fa)明中的(de)納米粒可(ke)以顯(xian)著抑制(zhi)腫(zhong)瘤(liu)細胞(bao)(HT-29)和人臍靜(jing)脈血管內皮細胞(bao)(HUVEC)的(de)增殖，且有劑量依賴關系；劃痕損傷(shang)和管腔形成實驗也(ye)證(zheng)實本(ben)發(fa)明中制(zhi)備的(de)納米粒能抑制(zhi)HUVEC的(de)遷移和血管形成。對比單獨用(yong)(yong)藥(yao)體系，本(ben)發(fa)明中提(ti)供的(de)聯(lian)合用(yong)(yong)藥(yao)納米粒在體內顯(xian)示了較好的(de)抑瘤(liu)效果，具有良好的(de)臨床應用(yong)(yong)價值(zhi)和應用(yong)(yong)前(qian)景(jing)。

附圖說明

圖1為(wei)實施例9中納米粒電鏡(jing)和(he)粒徑圖；

圖2為實(shi)施例10中納米粒(li)電鏡和粒(li)徑圖；

圖(tu)3為(wei)實施例11中納米粒(li)電鏡和粒(li)徑(jing)圖(tu)；

圖4為實(shi)施例8、9、10、11中(zhong)不同濃度(du)納米粒對(dui)腫瘤細胞HT-29生(sheng)存率的影響曲線；

圖5為實施例8、9、10、11中(zhong)不(bu)同濃度納米粒對人臍(qi)帶血管內皮(pi)細胞(bao)HUVEC生存率的(de)影響曲線；

圖(tu)6為實施例(li)9、10、11中納米(mi)粒對人(ren)臍帶(dai)血(xue)管內皮細胞HUVEC遷移(yi)率的影響；

圖7為實施(shi)例(li)9、10、11中(zhong)納米(mi)粒對人臍(qi)帶血管內皮(pi)細胞HUVEC侵襲能(neng)力的(de)影響；

圖中，SN38表(biao)(biao)示(shi)(shi)7-乙基(ji)-10-羥基(ji)喜樹堿，CA4或(huo)(huo)1表(biao)(biao)示(shi)(shi)康普瑞汀(ting)A4，丁酸(suan)-CA4或(huo)(huo)2表(biao)(biao)示(shi)(shi)丁酸(suan)與CA4的偶聯物(wu)，庚(geng)酸(suan)-CA4或(huo)(huo)3表(biao)(biao)示(shi)(shi)庚(geng)酸(suan)與CA4的偶聯物(wu)，1/4-NP、2/4-NP、3/4-NP分別(bie)表(biao)(biao)示(shi)(shi)CA4、丁酸(suan)-CA4、庚(geng)酸(suan)-CA4與LNA-SN38與兩親(qin)性高(gao)分子共組裝形成的納(na)米粒。

具體實施方式

下面結合附(fu)圖和(he)具體實施方式(shi)對本發明(ming)作進一步詳細(xi)說(shuo)明(ming)，但本發明(ming)并不(bu)受其(qi)限制。

實施例1

取丁酸(51.7μL，0.57mmol)，CA4(180mg，0.57mmol)，EDC·HCl(163mg，0.855mmol)，DMAP(76.6mg，0.627mmol)，DIEA(188.9μL,1.14mmol)溶于4ml DCM中，室溫下攪拌過夜，加入乙酸乙酯，依次利用5％檸檬酸、飽和NaHCO₃、飽和(he)食(shi)鹽水(shui)洗滌有(you)機相(xiang)(xiang)，有(you)機相(xiang)(xiang)用(yong)無(wu)水(shui)硫酸鈉干燥，過濾，收集(ji)濾液后減壓(ya)除(chu)去溶劑；固體用(yong)柱(zhu)層析色譜分離純化(乙酸乙酯:正己烷＝1:3)，得到目標產物丁酸-CA4偶聯物化合物2(280mg，收率93％)。

產物丁酸-CA4的¹H NMR核磁(ci)數(shu)(shu)據以及質譜(pu)數(shu)(shu)據如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.00-1.04(t,3H),1.73-1.78(m,2H),2.49-2.53(t,2H),3.71(s,6H),3.80(s,3H),3.83(s,3H),6.45-6.45(d,2H,J＝1.2),6.51(s,2H),6.83-6.85(d,1H,J＝8.4),7.00-7.01(d,1H,J＝1.6),7.10-7.12(q,1H).

HR-ESI Qq-LTMS：計算值：[C₂₂H₂₆O₆]⁺[M+H]⁺＝387.1802；檢測值：387.1811。

實施例2

取庚酸(80.8μL，0.57mmol)，CA4(180mg，0.57mmol)，EDC·HCl(163mg，0.855mmol)，DMAP(76.6mg，0.627mmol)，DIEA(188.9μL，1.14mmol)溶于4mL DCM中，室溫下攪拌過夜，加入乙酸乙酯，依次利用5％檸檬酸、飽和NaHCO₃、飽和食鹽(yan)水(shui)(shui)洗滌(di)有機(ji)相(xiang)，有機(ji)相(xiang)用無(wu)水(shui)(shui)硫(liu)酸(suan)鈉干燥，過濾，收(shou)集濾液后減(jian)壓除(chu)去溶劑；固體(ti)用柱(zhu)層析色(se)譜分離(li)純化(乙酸(suan)乙酯:正己烷＝1:3)，得到目標產物(wu)庚酸(suan)-CA4偶聯物(wu)化合物(wu)3(260mg，收(shou)率85％)。

產物庚酸-CA4的¹H NMR核磁(ci)數(shu)據以及質(zhi)譜數(shu)據如(ru)下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ0.88-0.91(t,3H),1.26-1.41(m,6H),1.70-1.74(t,2H),2.51-2.54(t,2H),3.71(s,6H),3.80(s,3H),3.84(s,3H),6.45-6.45(d,2H,J＝1.6),6.51(s,2H),6.83-6.85(d,1H,J＝8.4),7.00-7.00(d,1H,J＝1.6),7.10-7.12(q,1H).

HR-ESI Qq-LTMS：計算值[C₂₅H₃₂O₆]⁺[M+H]⁺＝429.2212；檢測值：429.2282。

實施例3

LNA-SN38偶聯(lian)物(wu)化合物(wu)4合成(cheng)方法(fa)參考(kao)專(zhuan)(zhuan)利文獻“7-乙基-10-羥基喜樹堿藥(yao)物(wu)前體(ti)及其制(zhi)備方法(fa)和應(ying)用(yong)”中SN38前體(ti)藥(yao)物(wu)7的合成(cheng)，專(zhuan)(zhuan)利申請號為201410295432.X。

實施例4

LA-SN38合成方(fang)法參考專利文獻“7-乙(yi)基(ji)-10-羥基(ji)喜樹堿藥(yao)物前體(ti)及其制備方(fang)法和應用”中(zhong)SN38前體(ti)藥(yao)物6的合成，專利申(shen)請號為201410295432.X。

實施例5

OA-SN38合(he)成方法(fa)參考專利文獻“7-乙基(ji)-10-羥基(ji)喜(xi)樹堿藥(yao)物前體及其制備(bei)方法(fa)和應(ying)用(yong)”中SN38前體藥(yao)物5的合(he)成，專利申(shen)請號為201410295432.X。

實施例6

RA-SN38合成方法參考專利文(wen)獻“一(yi)種(zhong)全反式(shi)維甲酸-喜樹堿類抗癌(ai)藥物(wu)偶聯(lian)物(wu)及其(qi)制備(bei)方法和(he)應用”中ATRA-SN38偶聯(lian)物(wu)(C10羥基(ji))的制備(bei)，專利申(shen)請號或專利號為201410692682.7。

實施例7

DHA-SN38合成方法(fa)，具體方法(fa)如下：

SN38(119.3mg，0.304mmol)、DMAP(40.8mg，0.334mmol)、DHA(100mg，0.304mmol)、EDC·HCl(64mg，3.334mmol)溶于(yu)(yu)4mL DMF，加入DIEA(43.1mg，0.334mmol)，反應過(guo)夜，除去反應溶劑(ji)后，固(gu)體溶于(yu)(yu)二(er)氯甲烷，水(shui)(shui)洗7次，依(yi)次用飽和(he)碳酸(suan)(suan)氫鈉(na)水(shui)(shui)溶液、5％檸檬酸(suan)(suan)及飽和(he)食(shi)鹽水(shui)(shui)各洗1次，無水(shui)(shui)硫(liu)酸(suan)(suan)鈉(na)干燥(zao)，過(guo)濾(lv)，收(shou)集濾(lv)液后減(jian)壓除去溶劑(ji)；固(gu)體用柱層(ceng)析色譜(pu)分(fen)離(li)純化(乙酸(suan)(suan)乙酯：正己(ji)烷＝1:1)，得到產物(wu)DHA-SN38偶聯物(wu)，產率57.5％。

DHA-SN38偶聯物核磁(ci)和質譜數據如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ0.88-0.91(t,3H),0.91-0.99(t,3H),1.31-1.35(t,3H),1.77-1.88(m,2H),1.96-2.02(m,2H),2.50-2.55(m,2H),2.65-2.85(m,12H),3.06-3.12(m,2H),3.75(br,1H),5.20-5.35(m,13H),5.43-5.46(m,2H),5.66-5.70(d,1H,J＝16.4),7.47-7.50(m,1H),7.61(s,1H),7.75-7.76(d,1H,J＝2),8.17-8.20(d,1H,J＝8.8).

HR-ESI Qq-LTMS：計算值[C₄₄H₅₀N₂O₆]⁺[M+H]⁺＝703.3742；檢測值：703.3741.

實施例8

將實施例1制備的丁酸-CA4偶聯物化合物2(CA4含量0.5mg)、實施例3制備的LNA-SN38(SN38含量0.5mg)分別和mPEG_5k-PLA_16k(藥物(wu)質量的20倍)溶解(jie)于1mL丙(bing)酮(tong)中，溶解(jie)均勻后滴加到(dao)10mL水中，滴加完畢后，減(jian)壓去除丙(bing)酮(tong)，即可得到(dao)丁酸-CA4和LNA-SN38納米藥物(wu)(分別(bie)標記(ji)為2-NP、4-NP)。

實施例9

將CA4化合物1(0.5mg)、實施例3中制備的LNA-SN38化合物4(1.67mg)和mPEG_5k-PLA_16k(43.4mg)溶解(jie)于(yu)3mL丙酮中，溶解(jie)均勻(yun)后滴(di)加到10mL水中，滴(di)加完畢后，減(jian)壓(ya)去除丙酮，即可得到負(fu)載抗血管生成(cheng)藥物(wu)和抗腫(zhong)瘤細胞(bao)增殖藥物(wu)的納米藥物(wu)(記為1/4-NP)。電鏡下納米粒形貌(mao)如圖1所示，DLS測得粒徑(jing)大小31±4nm。

實施例10

將實施例1中純化得到的丁酸-CA4化合物2(0.6mg)、實施例3中制備的LNA-SN38化合物4(1.67mg)和mPEG_5k-PLA₁₆(45.4mg)溶(rong)解于3mL丙酮(tong)中，溶(rong)解均勻后滴加到(dao)10mL水(shui)中，滴加完畢后，減壓去(qu)除丙酮(tong)，即可(ke)得(de)(de)到(dao)負載抗血管生成藥物(wu)和抗腫瘤(liu)細胞(bao)增殖藥物(wu)的(de)納米(mi)藥物(wu)(記(ji)為2/4-NP)。電鏡下(xia)納米(mi)粒形貌如圖2所示，DLS測(ce)得(de)(de)粒徑大小38±17nm。

實施例11

將實施例2中純化得到的庚酸-CA4化合物3(0.63mg)、實施例3中制備的LNA-SN38化合物4(1.67mg)和mPEG_5k-PLA_8k(46mg)溶解于3mL丙酮中，溶解均勻后(hou)滴(di)加(jia)(jia)到(dao)10mL水中，滴(di)加(jia)(jia)完畢后(hou)，減壓去(qu)除丙酮，即可得到(dao)負載抗(kang)血管生(sheng)成藥(yao)物和抗(kang)腫瘤細(xi)胞增殖藥(yao)物的(de)納(na)米藥(yao)物(記為3/4-NP)。電鏡(jing)下(xia)納(na)米粒形貌如圖3所示(shi)，DLS測得粒徑大小38±14nm。

以下通過(guo)測試例進(jin)一步闡明本發(fa)明所述納米粒對腫瘤的治療效果：

測試例1體外(wai)細胞毒性實(shi)驗

取對數生長期細胞(HT-29、HUVEC)，胰酶消化后，種板(96孔板，5×10³個細胞/孔)，37℃孵育24h使細胞貼壁，以SN38為對照組，加入不同濃度的實施例8、9、10、11中制備的納米粒(100μL/孔)，培養48h后，每孔加入30μL噻唑藍(MTT，5mg/mL)，繼續培養4h后去除上清，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩，使結晶產物充分溶解，492nm處于酶標儀上檢測各孔吸光度，繪制出細胞存活曲線，并計算各組納米粒對細胞的半抑制濃度(IC₅₀)值。抗腫(zhong)瘤藥(yao)物(wu)脂質體對各種腫(zhong)瘤細胞的體外毒性結果見圖(tu)4和(he)圖(tu)5和(he)表1。

表1：實施例8、9、10、11中納米粒對腫瘤細胞的IC₅₀(μM)

從圖4和(he)圖5和(he)表1可看(kan)出，由(you)SN38前藥組成(cheng)的(de)(de)納(na)米(mi)粒4-NP與(yu)自由(you)的(de)(de)SN38具有相似的(de)(de)細胞毒性(xing)(xing)，但與(yu)CA4前藥1、2、3構成(cheng)的(de)(de)聯用納(na)米(mi)粒1/4-NP、2/4-NP、3/4-NP細胞毒性(xing)(xing)明顯增強，證(zheng)明了兩藥聯用的(de)(de)有效性(xing)(xing)。

測試例2：遷移實驗

靜止(zhi)的(de)HUVEC細胞(bao)培(pei)(pei)養于(yu)6孔板中(zhong)，用(yong)槍頭(tou)在孔中(zhong)間位(wei)置對(dui)細胞(bao)做一個筆直的(de)劃痕，去掉培(pei)(pei)養基，加入(ru)自由CA4藥物組(zu)(zu)以(yi)(yi)及(ji)實施(shi)例(li)9、10、11中(zhong)分(fen)別制備的(de)1/4-NP、2/4-NP、3/4-NP(以(yi)(yi)CA4計，其濃度為5nM)，以(yi)(yi)空(kong)白(bai)未加藥組(zu)(zu)做對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)。各組(zu)(zu)細胞(bao)置于(yu)培(pei)(pei)養箱中(zhong)培(pei)(pei)養24h后(hou)，拍照(zhao)，并對(dui)劃痕的(de)寬度量化(hua)處理。結果顯(xian)示(圖6)，與(yu)空(kong)白(bai)對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)相比，自由CA4藥物組(zu)(zu)以(yi)(yi)及(ji)實施(shi)例(li)9、10、11中(zhong)制備的(de)納米粒均(jun)能(neng)(neng)顯(xian)著性抑制HUVEC細胞(bao)的(de)遷移能(neng)(neng)力(li)。

測試例3：侵襲實驗

取對數生長期HUVEC細胞，按4×10⁴個細胞/孔的密度接種至鋪有30μL Matrigel的Transwell小室的上室，下室加入700μL培養基，均勻搖晃使細胞分布均勻，將細胞置于37℃、5％CO₂培(pei)(pei)(pei)養(yang)箱中培(pei)(pei)(pei)養(yang)，24h，細(xi)胞(bao)(bao)貼壁后(hou)進行下一步操(cao)作(zuo)。取(qu)出上(shang)(shang)室培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)，加(jia)入(ru)200μL含(han)有藥物(自由CA4藥物組以及實施(shi)例(li)9、10、11中制備的納米粒，藥物濃度(du)以CA4濃度(du)5nM計(ji)算)的培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)，下室加(jia)入(ru)700μL含(han)20％胎牛血清的培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)，培(pei)(pei)(pei)養(yang)24h后(hou)，棄上(shang)(shang)室培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)，PBS清洗兩(liang)次(ci)，甲醇固定，結晶紫染色(se)，用棉簽擦去上(shang)(shang)室膠和細(xi)胞(bao)(bao)，顯微鏡下觀(guan)察穿透(tou)上(shang)(shang)室的細(xi)胞(bao)(bao)，拍照，計(ji)數。

結(jie)果如(ru)圖(tu)7所示，各加藥組HUVEC細胞(bao)的侵(qin)襲得到明顯抑制，空白(bai)組侵(qin)細胞(bao)數目(mu)(mu)為(wei)834，而(er)自由CA4藥物組以(yi)及實施例9、10、11中制備的納米(mi)粒組中HUVEC細胞(bao)侵(qin)襲數目(mu)(mu)分別為(wei)252、330、325、308個，各組均與(yu)空白(bai)對(dui)照組有(you)非常顯著性(xing)差異(p<0.01)。

測試例4：血管(guan)管(guan)腔形成能力實驗

Matrigel加入96孔板中，30μL/孔，37℃凝固1h，加入100μL含2×10⁴個HUVEC的(de)培養基，加(jia)入自由CA4藥(yao)物組以及實施(shi)例9、10、11中分(fen)別制備的(de)1/4-NP、2/4-NP、3/4-NP(以CA4計，其濃度為(wei)5nM)，以DMSO為(wei)空白對照組。培養4h后，顯微鏡下觀察細(xi)胞形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)管(guan)(guan)腔(qiang)(qiang)(qiang)形(xing)(xing)(xing)貌，分(fen)析藥(yao)物對管(guan)(guan)腔(qiang)(qiang)(qiang)形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)的(de)影響(xiang)。空白組細(xi)胞形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)明顯的(de)管(guan)(guan)腔(qiang)(qiang)(qiang)圓形(xing)(xing)(xing)，而加(jia)藥(yao)組CA4及1/4-NP、2/4-NP、3/4-NP細(xi)胞散亂，較少形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)管(guan)(guan)腔(qiang)(qiang)(qiang)形(xing)(xing)(xing)貌。證實本發明中制備的(de)納米粒能夠抑(yi)制HUVEC形(xing)(xing)(xing)成(cheng)(cheng)血管(guan)(guan)管(guan)(guan)腔(qiang)(qiang)(qiang)的(de)能力(li)。

測試例5：體內(nei)抗腫瘤效果評價(jia)

5周齡Balb/c裸鼠皮下注射含5×10⁶HT-29細胞懸液200μL，待瘤體長至70mm³大小后，分(fen)成4組(每(mei)組7只)：生(sheng)(sheng)(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui)、實施例8中制(zhi)備的(de)2-NP(CA4等同劑量為15mg/kg)和(he)(he)(he)4-NP(SN38等同劑量為15mg/kg)、實施例10制(zhi)備的(de)2/4-NP(CA4和(he)(he)(he)SN38等同劑量均為15mg/kg)。每(mei)隔三天(tian)一(yi)次尾靜(jing)脈給藥(yao)(yao)(yao)(yao)，總共(gong)3次。以第一(yi)次給藥(yao)(yao)(yao)(yao)為0天(tian)，間隔一(yi)定時間測量瘤(liu)(liu)體體積(ji)，并(bing)對(dui)(dui)結果進行統計分(fen)析。結果顯示，4-NP、2/4-NP相對(dui)(dui)于生(sheng)(sheng)(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui)組對(dui)(dui)抑制(zhi)腫(zhong)瘤(liu)(liu)生(sheng)(sheng)(sheng)長具非常顯著的(de)效果，且抗(kang)(kang)血管生(sheng)(sheng)(sheng)成藥(yao)(yao)(yao)(yao)物和(he)(he)(he)抗(kang)(kang)腫(zhong)瘤(liu)(liu)細胞增(zeng)殖藥(yao)(yao)(yao)(yao)物聯合組(2/4-NP)優于由單(dan)獨用(yong)藥(yao)(yao)(yao)(yao)的(de)2-NP和(he)(he)(he)4-NP組。體內試驗進一(yi)步證實，本發明中制(zhi)備的(de)抗(kang)(kang)血管生(sheng)(sheng)(sheng)成藥(yao)(yao)(yao)(yao)物和(he)(he)(he)抗(kang)(kang)腫(zhong)瘤(liu)(liu)細胞增(zeng)殖藥(yao)(yao)(yao)(yao)物聯合用(yong)藥(yao)(yao)(yao)(yao)納米粒具有較強的(de)抑制(zhi)腫(zhong)瘤(liu)(liu)增(zeng)長的(de)能力。