本(ben)發(fa)明(ming)涉及有機合(he)(he)成和藥(yao)物化學領域，具體涉及組合(he)(he)物、制備方(fang)法及其用途。
背景技術：
單(dan)純(chun)皰(pao)(pao)(pao)疹(zhen)病毒(du)1型(Herpes simplex virus，HSV-1)和單(dan)純(chun)皰(pao)(pao)(pao)疹(zhen)病毒(du)2型(Herpes simplex virus，HSV-2)屬于皰(pao)(pao)(pao)疹(zhen)科病毒(du)，HSV-1和HSV-2不僅引(yin)起口唇或生(sheng)殖粘膜皰(pao)(pao)(pao)疹(zhen)，同時(shi)也是引(yin)起腦炎、肝炎、全身嚴重感染(ran)(ran)甚至宮內感染(ran)(ran)的重要病原。
呼吸(xi)(xi)道(dao)(dao)合胞病(bing)毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要(yao)引(yin)起(qi)呼吸(xi)(xi)系(xi)統感染，在嬰幼兒、老(lao)年以及(ji)免(mian)疫缺陷人(ren)群引(yin)起(qi)嚴重肺(fei)炎，是人(ren)類上呼吸(xi)(xi)道(dao)(dao)感染的重要(yao)病(bing)原之一。
甲型流感(gan)病(bing)毒(Influenza A virus，Flu-A)屬于正粘科病(bing)毒，在(zai)人類和其他生(sheng)物每年都(dou)有小范圍的流行，引(yin)起上(shang)呼吸系統感(gan)染(ran)。大流行時，可引(yin)起嚴重呼吸系統感(gan)染(ran)，甚者(zhe)引(yin)起肺炎、腦炎甚至(zhi)死亡。
上述三種病毒(du)的(de)治(zhi)療目前(qian)已有的(de)藥(yao)物(wu)存在毒(du)性大、安全(quan)性低的(de)問題，從(cong)天然產(chan)物(wu)中尋(xun)找化(hua)合物(wu)或先導(dao)化(hua)合物(wu)并進行結構(gou)修飾(shi)獲得其(qi)衍生物(wu)，從(cong)而(er)得到高效低毒(du)的(de)潛在藥(yao)物(wu)最有重要(yao)價(jia)值。
本發(fa)明涉及的化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)I是一(yi)個2011年發(fa)表(biao)(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)，我們對(dui)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)I進行(xing)了(le)(le)結構修飾，獲得了(le)(le)兩個新的衍生物(wu)(wu)即化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)III和化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)IV，并用(yong)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)III和化(hua)(hua)合(he)物(wu)(wu)IV制備了(le)(le)組合(he)物(wu)(wu)，并對(dui)該組合(he)物(wu)(wu)抗(kang)(kang)病(bing)毒活性進行(xing)了(le)(le)評價，其(qi)具(ju)有抗(kang)(kang)病(bing)毒活性。
技術實現要素：
本發明公開(kai)了一個(ge)新(xin)的組合(he)物(wu)(wu)(wu)，該組合(he)物(wu)(wu)(wu)由(you)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)III和化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)IV組成，該組合(he)物(wu)(wu)(wu)中化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)III和化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)IV的質量百分(fen)數分(fen)別為45％和55％。
本發明公開的組合物可(ke)以(yi)制(zhi)成藥學上可(ke)接受的鹽或(huo)藥學上可(ke)接受的載體。
藥(yao)效學(xue)實(shi)驗表(biao)明(ming)，本發明(ming)的(de)組合物具有(you)較好的(de)抗病毒作用(yong)。本發明(ming)的(de)藥(yao)學(xue)上可接(jie)受(shou)的(de)鹽具有(you)同樣的(de)藥(yao)效。
組合(he)物(wu)(wu)的(de)體外實驗(yan)表明(ming)(ming)，組合(he)物(wu)(wu)具(ju)有很強的(de)抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的(de)活性，因此本發明(ming)(ming)的(de)組合(he)物(wu)(wu)有望被用于制備新(xin)型抗病毒(du)藥(yao)物(wu)(wu)。
以下(xia)通過(guo)實施例對本發(fa)(fa)明作進一(yi)步詳細的說明，但本發(fa)(fa)明的保護范圍不(bu)受具 體實施例的任何限(xian)制(zhi)，而(er)是由(you)權利要求加以限(xian)定。
具體實施方式
實施例(li)1化(hua)合(he)物(wu)Schiglautone A的制(zhi)備(bei)
化(hua)合物Schiglautone A(I)的制備方法參照Fan-Yu Meng等人(ren)發表的文獻(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的方法。
實施例(li)2Schiglautone A的O-溴(xiu)乙(yi)基(ji)衍生(sheng)物(II)的合成
將化(hua)(hua)合(he)物(wu)I(502mg，1.00mmol)溶(rong)(rong)(rong)于15mL苯，向溶(rong)(rong)(rong)液(ye)中加入四丁基溴化(hua)(hua)銨(an)(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和6mL的50％氫氧(yang)化(hua)(hua)鈉溶(rong)(rong)(rong)液(ye)。混合(he)物(wu)在35攝氏度攪拌8h。8h之后(hou)(hou)將反應液(ye)倒入冰水(shui)中，立即用二氯甲烷萃(cui)取兩次(ci)(ci)，合(he)并有機(ji)相(xiang)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)。然后(hou)(hou)對有機(ji)相(xiang)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)依次(ci)(ci)用水(shui)和飽和食鹽水(shui)洗(xi)滌(di)3次(ci)(ci)，再用無水(shui)硫(liu)酸鈉干(gan)燥，最后(hou)(hou)減壓濃縮去除溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)得到產物(wu)粗品(pin)。產物(wu)粗品(pin)用硅膠柱層析(xi)純化(hua)(hua)(流動相(xiang)為：石油醚/丙(bing)酮(tong)＝100:1.0，v/v)，收(shou)集棕(zong)色集中洗(xi)脫帶并揮(hui)去溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)即得到化(hua)(hua)合(he)物(wu)II的棕(zong)色粉(fen)末(508mg，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.40(s,1H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.53(s,1H),3.85(d,J＝11.2Hz,4H),3.52(d,J＝10.8Hz,4H),2.96(s,1H),2.20(s,1H),2.16(s,2H),2.00(s,1H),1.84(d,J＝13.9Hz,4H),1.69(s,1H),1.58(dd,J＝22.2,8.5Hz,4H),1.51(s,1H),1.47(s,1H),1.26(dd,J＝9.1,4.4Hz,4H),1.21(s,1H),1.08–0.98(m,4H),0.96-0.94(m,9H),0.94-0.85(m,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.46(s),209.14(s),170.06(s),161.12(s),143.51(s),132.01(s),127.77(s),85.96(s),82.40(s),70.19(s),69.10(s),57.14(s),52.73(s),51.90(s),45.77(s),40.67(s),38.57(s),38.32(s),35.04(s),33.55(s), 33.27(s),29.85(s),28.98(s),26.71(s),25.50(s),24.05(s),22.31(s),21.06(s),20.56(s),20.00(s),18.69(s),18.11(s),15.07(s).
HRMS(ESI)m/z[M-H]-calcd for C34H51Br2O6:715.2032；found 715.2027.
實施(shi)例3Schiglautone A的(de)O-(三唑(zuo)基(ji))乙基(ji)衍生物(III)的(de)合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于10mL乙腈當中(zhong)，向其中(zhong)加入無(wu)水碳酸鉀(jia)(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(jia)(84mg，0.5mmol)和1,2,3-三氮唑(2760mg，40mmol)，混合物加熱回流(liu)3h。反應結束后將反應液倒入冰水中(zhong)，用等量二氯甲烷(wan)萃取(qu)2次，合并有(you)機相(xiang)。依(yi)次用水和飽和食鹽(yan)水洗(xi)滌(di)合并之(zhi)后的有(you)機相(xiang)，再用無(wu)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗(cu)品(pin)。產物粗(cu)品(pin)用硅膠(jiao)柱(zhu)層析純(chun)化(流(liu)動相(xiang)為：石油醚/丙酮(tong)＝100:1.0，v/v)，收(shou)集淡黃色(se)集中(zhong)洗(xi)脫(tuo)帶即得到化合物III的黃色(se)膠(jiao)狀(zhuang)固體(245.7mg,71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ18.00(s,1H),7.96(d,J＝15.5Hz,2H),7.67(d,J＝20.5Hz,2H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.33(s,1H),4.29(d,J＝19.8Hz,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,2H),3.83(d,J＝4.8Hz,4H),3.47(s,1H),2.39(d,J＝2.9Hz,3H),2.16(s,1H),1.84(d,J＝0.5Hz,4H),1.68–1.61(m,3H),1.61–1.50(m,3H),1.46(s,1H),1.39(d,J＝11.0Hz,2H),1.30–1.21(m,2H),1.21(s,1H),1.05–0.70(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.62(s),209.42(s),170.24(s),161.39(s),143.68(s),137.15(s),132.19(s),128.04(s),120.80(s),86.24(s),82.58(s),66.14(s),65.60(s),57.43(s),52.89(s),52.18(s),46.47(s),46.06(s),40.83(s),38.85(s),38.50(s),35.31(s),33.72(s),30.12(s),29.15(s),27.00(s),25.66(s),24.33(s),22.49(s),21.33(s),20.73(s),20.29(s),18.85(s),18.39(s),15.25(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C38H57N6O6:693.4340；found:693.4338。
實施例4Schiglautone A的O-(二(er)(2-甲(jia)硫基乙基)胺基)乙基衍生物的合成
1、Schiglautone A的O-(二羥乙胺(an)基)乙基衍生物的合成(cheng)
將(jiang)化合(he)物(wu)II(358mg，0.5mmol)溶(rong)于15mL乙腈，加入無(wu)水碳酸鉀(0.345g，2.5mmol)，碘(dian)化鉀(0.084g，0.5mmol)和二乙醇胺(an)(1.0514g，10mmol)，混合(he)物(wu)加熱回流9h。反應結(jie)束(shu)后將(jiang)反應液倒入冷水中，用二氯甲烷萃取三次(ci)，合(he)并有機相，依次(ci)用水和飽和食(shi)鹽水洗滌，無(wu)水硫酸鈉干燥，減(jian)壓濃縮去除溶(rong)劑(ji)。產物(wu)用硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到(dao)Schiglautone A的(de)O-(二羥(qian)乙胺(an)基)乙基衍生物(wu)的(de)淡黃(huang)色固體(ti)(0.199g,52％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ17.77(s,1H),6.00(s,1H),5.40(s,1H),5.20(s,1H),3.37(d,J＝17.8Hz,4H),3.28(s,8H),2.87(s,1H),2.51(d,J＝6.5Hz,4H),2.43(s,8H),2.24(s,2H),2.06(d,J＝12.7Hz,2H),1.76–1.68(m,5H),1.57(s,1H),1.53–1.39(m,8H),1.36(s,1H),1.24(s,1H),1.20–1.14(m,3H),1.11(s,1H),0.94–0.82(m,10H),0.80(s,3H),0.76(s,3H),0.72(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.39(s),208.98(s),169.80(s),160.73(s),143.02(s),131.42(s),127.05(s),85.91(s),82.25(s),66.70(s),65.63(s),58.62(s),56.55(s),56.61(s),53.30(s),52.45(s),51.52(s),45.29(s),40.06(s),38.52(s),38.17(s),34.73(s),33.17(s),29.35(s),28.38(s),26.34(s),25.00(s),23.45(s),22.05(s),20.67(s),20.07(s),19.31(s),18.41(s),17.73(s),14.59(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H73N2O10:765.5265；found:765.5261。
Schiglautone A的O-(二羥乙胺(an)基)乙基衍(yan)生物
2、Schiglautone A的O-(二氯乙(yi)胺基)乙(yi)基衍生物(wu)的合成(cheng)
按照上述步(bu)驟(zou)制備(bei)1g的(de)Schiglautone A的(de)O-(二羥(qian)乙(yi)(yi)胺基(ji))乙(yi)(yi)基(ji)衍(yan)生物(wu)，取(qu)Schiglautone A的(de)O-(二羥(qian)乙(yi)(yi)胺基(ji))乙(yi)(yi)基(ji)衍(yan)生物(wu)(382mg，0.5mmol)溶(rong)于(yu)8mL氯(lv)仿，逐滴(di)加(jia)入氯(lv)化(hua)亞砜(0.238g，2mmol)，反應(ying)物(wu)加(jia)熱回(hui)流2h。將反應(ying)物(wu)冷卻至室溫(wen)，滴(di)加(jia)甲醇分解過(guo)量的(de)氯(lv)化(hua)亞砜，減壓濃(nong)縮(suo)除去(qu)溶(rong)劑。產物(wu)經硅膠柱層析純化(hua)(石油醚/丙酮(tong)100:1，v/v)，得到Schiglautone A的(de)O-(二氯(lv)乙(yi)(yi)胺基(ji))乙(yi)(yi)基(ji)衍(yan)生物(wu)的(de)淡黃色膠狀固體(0.297g，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.87(s,1H),6.01(s,1H),5.50(d,J＝8.4Hz,2H),3.61(s,4H),3.55(s,4H),3.45(s,2H),3.40(s,2H),2.98(s,1H),2.73(d,J＝17.4Hz,4H),2.67–2.57(m,6H),2.54(s,2H),2.40(s,1H),2.10(s,1H),1.99(s,2H),1.78(s,1H),1.73(d,J＝16.9Hz,4H),1.58(d,J＝3.0Hz,2H),1.46(d,J＝3.0Hz,2H),1.43(s,1H),1.37(s,1H),1.22(s,1H),1.17(dd,J＝18.9,11.1Hz,4H),0.95–0.83(m,10H),0.80(d,J＝20.0Hz,3H),0.78(d,J＝20.0Hz,3H),0.73(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.19(s),208.87(s),169.79(s),160.85(s),143.24(s),131.74(s),127.50(s),85.69(s),82.13(s),66.71(s),65.84(s),56.87(s),55.80(s),53.19(s),52.44(s),51.64(s),45.51(s),40.38(s),39.22(s),38.30(s),38.05(s),34.77(s),33.28(s),29.56(s),28.72(s),26.45(s),25.21(s),23.79(s),22.05(s),20.77(s),20.30(s),19.76(s),18.41(s),17.85(s),14.81(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H69Cl4N2O6:839.3880；found:839.3881。
Schiglautone A的O-(二氯乙(yi)(yi)胺基)乙(yi)(yi)基衍生(sheng)物
3、Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基(ji)乙基(ji))胺基(ji))乙基(ji)衍生物(IV)的合(he)成
按(an)照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二氯乙胺基(ji))乙基(ji)衍(yan)生(sheng)物，將(jiang)Schiglautone A的O-(二氯乙胺基(ji))乙基(ji)衍(yan)生(sheng)物(0.419g，0.5mmol)溶(rong)(rong)于15mL乙醇(chun)，室(shi)溫下加(jia)入甲硫醇(chun)鈉(0.21g，3mmol)，反應物加(jia)熱回流(liu)3h。減壓濃縮除去溶(rong)(rong)劑(ji)，所得(de)產物用硅膠柱(zhu)層析(xi)進行(xing)純(chun)化(石(shi)油醚/丙酮100:0.2，v/v)，得(de)到黃色固體物，即化合物IV(0.296g，67％)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d1)δ13.21(s,1H),6.02(s,1H),5.48(s,1H),5.44(s,1H),3.45(s,2H),3.38(s,2H),3.00(s,1H),2.57–2.48(m,20H),2.16–2.09(m,4H),1.96(s,12H),1.73(d,J＝15.4Hz,4H),1.55(s,1H),1.44(dd,J＝7.8,2.8Hz,4H),1.35(s,1H),1.29–1.14(m,6H),0.97–0.49(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.72(s),209.42(s),170.36(s),161.38(s),143.79(s),132.31(s),128.03(s),86.24(s),82.70(s),67.24(s),66.39(s),57.44(s),53.73(s),53.00(s),52.69(s),52.17(s),46.06(s),40.95(s),38.84(s),38.61(s),35.32(s),33.82(s),32.41(s),30.13(s),29.25(s),27.00(s),25.77(s),24.34(s),22.59(s),21.33(s),20.85(s),20.28(s),18.96(s),18.40(s),15.35(s),15.03(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H81N2O6S4+:885.4977；found:885.4979。
實施(shi)例(li)5組(zu)合(he)物抗病毒活性
(一)實驗(yan)例：組合物對(dui)皰(pao)疹病(bing)毒的(de)作用研究：
(1)細胞株與病毒株：
人胚腎細(xi)胞(bao)(HEK293，為(wei)HSV-1、HSV-2病毒敏(min)感細(xi)胞(bao))購(gou)自(zi)美國Clontech公司；單(dan)純皰疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、單(dan)純皰癥病毒2型(HSV-2)333株引(yin)自(zi)中國CDC病毒病研究(jiu)所。
(2)細胞毒性測定：
組(zu)合(he)(he)物的(de)(de)制備：將研磨之后過200目(mu)網的(de)(de)45mg化合(he)(he)物III的(de)(de)粉末(mo)和研磨之后過200目(mu)網的(de)(de)55mg化合(he)(he)物IV的(de)(de)粉末(mo)裝入帶蓋(gai)的(de)(de)小管中(zhong)并用(yong)渦輪攪(jiao)拌儀混合(he)(he)即得到(dao)100mg組(zu)合(he)(he)物，使用(yong)時用(yong)水溶解這100mg的(de)(de)組(zu)合(he)(he)物即得到(dao)組(zu)合(he)(he)物的(de)(de)溶液。
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋(20～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設微孔板D的1～6孔為細胞對照，7～12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組OD值 相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數細胞中毒濃度(TD50)。
(4)抑毒試驗：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序(2-3～-14)橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1～12作為細胞對照。37℃、5％CO2培養，每日觀察CPE，連續觀察4d。病毒對照出現90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒(du)指數(TI)。
(5)結果：
①樣品TD50的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態良好。組合物、化合物III和化合物IV的TD50在HEK293分別為2-2.79、2-2.13、2-2.68。
②抑毒(du)實(shi)驗：對照組(zu)細胞(bao)貼壁致密(mi)、形(xing)態良(liang)好。鏡下觀察發現，HSV-1、HSV-2病毒(du)對照組(zu)分別在第3d、3d出現90％以上的(de)CPE，HSV 1和(he)HSV 2在HEK293CPE則以腫脹(zhang)、多細胞(bao)融(rong)合(he)(HSV 1致多個(ge)細胞(bao)融(rong)和(he)成大泡，而(er)HSV 2致融(rong)合(he)為(wei)小泡)、變圓、脫(tuo)落為(wei)主要特征。
而組(zu)合物(wu)抑毒(du)試驗各組(zu)細(xi)胞，按照組(zu)合物(wu)樣品稀(xi)釋(shi)梯(ti)(ti)度(du)，梯(ti)(ti)度(du)規律出(chu)現CPE：HSV 1-HEK293在第10稀(xi)釋(shi)度(du)之(zhi)前、HSV 2-HEK293組(zu)在第9稀(xi)釋(shi)度(du)之(zhi)前細(xi)胞完全被保護，之(zhi)后(hou)出(chu)現CPE，CPE隨樣品濃度(du)減(jian)少逐漸(jian)加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-4～-6濃(nong)度范(fan)圍內才(cai)觀察到抑(yi)制病毒(du)的效(xiao)應(ying)。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得組合物的TI：抑制HSV-1、HSV-2在HEK293細胞發生CPE，IC50分別為2-12.14、2-12.23，TI分別為652.6、694.6。化合物III的TI：對應的IC50分別為2-4.91、2-4.85，TI分別為6.9、6.6。化合物IV的TI：對應的IC50分別為2-5.12、 2-4.36，TI分別為5.4、3.2。
結論(lun)：組(zu)合(he)(he)物具(ju)有(you)(you)(you)顯(xian)(xian)著(zhu)的(de)(de)抗皰(pao)疹(zhen)科病(bing)(bing)毒(包括(kuo)HSV-1、HEV-2)的(de)(de)作用(yong)，而且安全性(xing)高(gao)，因此組(zu)合(he)(he)物在治療皰(pao)疹(zhen)病(bing)(bing)毒感染疾病(bing)(bing)中具(ju)有(you)(you)(you)廣泛(fan)的(de)(de)應(ying)用(yong)背(bei)景。化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)物III和化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)物IV不(bu)具(ju)有(you)(you)(you)顯(xian)(xian)著(zhu)的(de)(de)抗皰(pao)疹(zhen)科病(bing)(bing)毒(包括(kuo)HSV-1、HEV-2)的(de)(de)作用(yong)，而且安全性(xing)極(ji)低，因此化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)物III和化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)物IV在治療皰(pao)疹(zhen)病(bing)(bing)毒感染疾病(bing)(bing)中沒有(you)(you)(you)應(ying)用(yong)背(bei)景。
(二)實驗例(li)：組合物對呼吸(xi)道合胞病毒(RSV)的作用研究
(1)組合(he)物、化合(he)物III和化合(he)物IV的配置：將藥物溶(rong)于細胞維持液(含2％新(xin)生牛血清的MEM，GIBICO公(gong)司產(chan)品)中備用。
(2)細胞株與病毒株：
人胚腎細(xi)胞(HEK293，RSV病(bing)(bing)(bing)毒(du)敏感細(xi)胞)購自(zi)美國(guo)Clontech公司；呼(hu)吸道合胞病(bing)(bing)(bing)毒(du)(RSV)Long株引自(zi)中(zhong)國(guo)CDC病(bing)(bing)(bing)毒(du)病(bing)(bing)(bing)研究所。
(3)細胞毒性(xing)測定：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品以2倍比做系列稀釋(20～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設微孔板D的1～6孔為細胞對照，7～12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數細胞中毒濃度(TD50)。
(4)抑毒試驗：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序(2-2～-13)橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL 作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1～12作為細胞對照。37℃、5％CO2培養，每日觀察CPE，連續觀察4d。病毒對照出現90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(TI)。
(5)結果：
①樣品TD50的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態良好。組合物、化合物III和化合物IV對HEK293的TD50分別為2-2.33、2-2.17、2-2.82。
②抑毒(du)實驗：對照(zhao)組細胞貼壁致密、形態良(liang)好。鏡下觀察發現，RSV病毒(du)對照(zhao)組在第(di)2d出現90％以上的CPE，RSV在HEK293CPE以折光性增強、變圓、脫落(luo)、破(po)碎(sui)為主要特征(zheng)。
而組合物(wu)抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯(ti)度(du)，梯(ti)度(du)規律出現CPE：
RSV-HEK293試驗組(zu)細胞(bao)(bao)在第9稀(xi)釋度之前，細胞(bao)(bao)完全被保護，之后出現CPE，CPE隨樣品濃度減(jian)少(shao)逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-4～-6濃度范圍內才觀(guan)察到抑制(zhi)病毒的效應(ying)。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得TI：組合物抑制RSV在HEK293細胞發生CPE，IC50為2-12.61，TI為1243.3；化合物III的IC50為2-4.54，TI為5.2；化合物IV的IC50為2-4.28，TI為2.8。
結論：組合(he)(he)(he)物具有顯著的(de)抗(kang)副(fu)(fu)粘(zhan)科(ke)(ke)(ke)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)呼(hu)吸(xi)(xi)道(dao)合(he)(he)(he)胞病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)RSV的(de)作用(yong)(yong)，可以用(yong)(yong)來(lai)(lai)制備抗(kang)副(fu)(fu)粘(zhan)科(ke)(ke)(ke)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)呼(hu)吸(xi)(xi)道(dao)合(he)(he)(he)胞病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)RSV藥物。化合(he)(he)(he)物III和化合(he)(he)(he)物IV無(wu)顯著的(de)抗(kang)副(fu)(fu)粘(zhan)科(ke)(ke)(ke)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)呼(hu)吸(xi)(xi)道(dao)合(he)(he)(he)胞病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)RSV的(de)作用(yong)(yong)，不可以用(yong)(yong)來(lai)(lai)制備抗(kang)副(fu)(fu)粘(zhan)科(ke)(ke)(ke)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)呼(hu)吸(xi)(xi)道(dao)合(he)(he)(he)胞病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)RSV藥物。
(三(san))實驗例：組合物對(dui)甲型流感病毒(du)的(de)作用研究：
(1)細(xi)胞(bao)株(zhu)與病(bing)(bing)毒(du)(du)株(zhu)：狗腎細(xi)胞(bao)(MDCK，流(liu)感病(bing)(bing)毒(du)(du)敏感細(xi)胞(bao))引自中國CDC病(bing)(bing)毒(du)(du)病(bing)(bing)研(yan)究所；流(liu)感病(bing)(bing)毒(du)(du)甲型(Flu A)1995.AII：32094地方株(zhu)引自中國CDC病(bing)(bing)毒(du)(du)病(bing)(bing)研(yan)究所。
(2)細胞毒性測定：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋(2-1～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設微孔板D的1～6孔為細胞對照，7～12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數細胞中毒濃度(TD50)。
(3)抑毒試驗：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1～12作為細胞對照。37℃、5％CO2培養，每日觀察CPE，連續觀察4d。病毒對照出現90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shu)(TI)。
(4)結果：
①樣品TD50的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態良好。組合物、化合物III和化合物IV對的TD50在MDCK分別為2-1.16、2-2.25、2-2.78。
②抑(yi)毒(du)實(shi)驗：對照組細胞(bao)貼壁致(zhi)密、形態良好。鏡(jing)下(xia)觀察(cha)發現，Flu A在MDCK CPE以(yi)折光性增強、壞(huai)死、破碎(sui)為主(zhu)要特(te)征。
而組合(he)物(wu)抑毒(du)試(shi)驗各組細胞，按照樣品(pin)稀釋梯度(du)，梯度(du)規律出(chu)現CPE：FluA-MDCK組細胞在第8稀釋度(du)之前(qian)細胞完全(quan)被保(bao)護，之后出(chu)現CPE，CPE隨樣品(pin)濃度(du)減(jian)少(shao)逐漸加(jia)重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-4～-6濃度范圍內才觀察到抑(yi)制(zhi)病(bing)毒的效應。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得TI：組合物抑制Flu A在MDCK細胞發生CPE，IC50為2-12.46，TI為2521.4；化合物III的IC50為2-5.37，TI為8.7；化合物IV的IC50為2-5.18，TI為5.3。
結論：組(zu)合(he)物(wu)對甲(jia)型(xing)流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)具有(you)很(hen)強的抑(yi)制作用(yong)，而且安(an)全，因(yin)此組(zu)合(he)物(wu)在(zai)治療甲(jia)型(xing)流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)感(gan)染疾(ji)(ji)病(bing)(bing)(bing)中具有(you)廣泛的應用(yong)背(bei)(bei)景。化(hua)(hua)合(he)物(wu)III和(he)化(hua)(hua)合(he)物(wu)IV對甲(jia)型(xing)流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)沒有(you)顯(xian)著(zhu)的抑(yi)制作用(yong)，而且安(an)全性極低，因(yin)此化(hua)(hua)合(he)物(wu)III和(he)化(hua)(hua)合(he)物(wu)IV在(zai)治療甲(jia)型(xing)流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)感(gan)染疾(ji)(ji)病(bing)(bing)(bing)中沒有(you)應用(yong)背(bei)(bei)景。
實施(shi)例6本(ben)發明所涉及組合(he)物(wu)片劑的制備(bei)
取2克(ke)組合物，加入(ru)制備片劑的常規(gui)輔料18克(ke)，混勻，常規(gui)壓片機制成100片。
實施例7本發(fa)明所涉及(ji)組合物膠囊的(de)制備
取2克組合(he)物，加入制備膠囊(nang)(nang)劑的常規輔料如淀粉18克，混勻(yun)，裝(zhuang)膠囊(nang)(nang)制成(cheng)100粒。