專利名稱：一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬獸醫生物新醫藥技術領域，具體地講涉及一種豬繁殖與呼吸綜合 征滅活疫苗的制備方法。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的繁 殖障礙性和呼吸道的傳染病，在世界范圍內廣泛分布，造成了巨大的經濟損失， 嚴重制約了養豬業的健康發展，已經成為豬病研究的熱點。現在由于對豬繁殖 與呼吸綜合征尚無有效治療方法，注射疫苗是防制該病的重要手段。目前國內 外已研制出許多疫苗來預防和控制豬繁殖與呼吸綜合征，但由于使用豬繁殖與 呼吸綜合征弱毒疫苗預防豬繁殖與呼吸綜合征有潛在的生物安全危險，因而獸 醫科技工作者和生產人員多主張采用滅活苗預防。

發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的目的是公開一種豬繁殖與呼吸綜合征 滅活疫苗的制備方法，該滅活疫苗可以有效地防止豬繁殖與呼吸綜合征，并且 具有生產方便，使用安全，易于保存的優點。
為了實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案
所述一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
① 、生產用毒種的制備將已長成單層的Marc-145細胞倒去生長液，以含 0. 01TCIDs。/個細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM維持液，在37'C含5XC02培養箱中培養觀察 48小時，凍融1次收獲感染細胞毒液，裝于滅菌容器內。
② 、制苗用病毒液的制備將生長良好的單層Marc-145細胞，倒去生長液，按照0. 01TCIDs。/細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產用毒種，37'C吸附 1小時后，加入含2%新生牛血清的DMEM維持液，置37。C旋轉培養至48小時收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量^107』TCID5。/ml病毒液在4。C滅活48小時 后，取滅活病毒液94 98份(體積份)，加入2 6份(體積份)的吐溫-80混合制 成水相；取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨 攪拌至透明為止，加熱到121'C、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相 與油相混合，混合之比為1:1.5 1:2.5—起乳化，分裝，入庫。
所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株是本公司自行在國內分離的豬繁殖與呼 吸綜合征病毒流行株CQ株，為國內流行的美洲型基因型毒株，與國內同期其它 分離株的同源性都在95%以上，該毒株繁殖特性好。在Marcl45細胞上的毒價 可達108()/ml以上。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株的取得通過對從河南省豬繁殖與呼吸綜 合征流行豬場送檢的高熱病流產死胎肺臟分離的病毒株進行細胞培養特性 觀察、病毒理化特性測定、病毒核酸類型測定、病毒中和試驗、RT-PCR鑒 定和動物回歸等試驗，證實分離的病毒株均為為豬繁殖與呼吸綜合征病毒。 試驗分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株能被美洲型抗血清所中和。另外， 本研究應用美洲型PRRSV特異的引物進行的RT-PCR反應，能對本分離株擴 增出特異性DNA片段，對歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒則不能，進一步 證實分離毒為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。將其命名為豬繁殖與呼吸 綜合征病毒CQ株。
所述制苗用病毒液創新采用低溫滅活，2 8'C經48小時,可徹底滅活病毒， 并不影響其免疫原性。該豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗采用的油相的配方與常規不同，白油94份, 司本-80 6份，無硬鋁。實驗證明沒有硬脂酸鋁的油苗粘度更小，穩定性也好， 對動物機體的刺激性也小。
由于采用了如上所述的技術方案，本發明具有如下積極效果
① 、采用的毒株為在國內分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株，免疫原 性良好，用其制備的疫苗免疫國內豬群能更好的抵抗野毒的攻擊，為豬繁殖與 呼吸綜合征疫情的防控提供了技術保障。
② 、采用了轉瓶生產的方法，而且采用先進科學的接毒工藝，不僅提高了 產量，而且所收獲的病毒液毒價也高。豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株在 Marc-145細胞上增殖過程中，接種劑量為0.01 0.1TCID5(/個細胞，最佳收毒時 間為48 60h,最佳基礎培養基為DMEM，凍融次數以一次為宜，這大大的降低 了生產成本，簡化了生產工藝。
③ 、本發明采用低溫滅活，4'C經48小時，可徹底滅活病毒，并不影響其免 疫原性。
、使用的佐劑屬于免疫增強劑中的一類，單獨使用時一般沒有免疫原性， 與抗原物質合并使用時，能增強抗原物質的免疫原性，增強機體的免疫應答， 或者改變機體免疫應答類型。本發明采用的佐劑是白油、吐溫-80、司盤，沒有 加入硬脂酸鋁穩定劑，實驗證明沒有硬脂酸鋁的油苗粘度更小，穩定性也好， 對動物機體的刺激性也小。本發明成品檢驗效力檢驗部分采用血清學的方法評 價，比常規的攻毒檢測方法更為準確、直觀、快速、結果更可靠，而且更符合生 物安全的原則。
具體實施例方式
實施例1: 一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下① 、生產用毒種的制備將已長成單層的Marc-145細胞倒去生長液，以含 0. 01TCID5。/個細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM維持液，在37"C含5XC02培養箱中培養觀察 48小時，凍融1次收獲感染細胞毒液，裝于滅菌容器內。
② 、制苗用病毒液的制備將生長良好的單層Marc-145細胞，倒去生長液， 按照0. 01TCID5。/細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產用毒種，37'C吸附 l小時后，加入含2M新生牛血清的DMEM維持液，置37。C旋轉培養至48小時收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量》l()7。TCID5。/ml病毒液在4。C滅活48小時 后，取滅活病毒液94份(體積份)，加入6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相； 取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨攪拌至透 明為止，加熱到12rC、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油混合， 混合之比為1:1.5—起乳化，分裝，入庫。
實施例2: —種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
① 、生產用毒種的制備將已長成單層的Marc-145細胞倒去生長液，以含 0. 01TCID5。/個細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM維持液，在37。C含5XC02培養箱中培養觀察 48小時，凍融1次收獲感染細胞毒液，裝于滅菌容器內。
② 、制苗用病毒液的制備將生長良好的單層Marc-145細胞，倒去生長液， 按照0. 01TCIDs。/細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產用毒種，37。C吸附 1小時后，加入含2%新生牛血清的DMEM維持液，置37。C旋轉培養至48小時收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量》l(TTCID5。/ml病毒液在4'C滅活48小時后，取滅活病毒液96份(體積份)，加入4份(體積份)的吐溫-80混合制成水相； 取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨攪拌至透 明為止，加熱到12rC、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混 合，混合之比為1:2.0—起乳化，分裝，入庫。
實施例3: —種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
① 、生產用毒種的制備將已長成單層的Marc-145細胞倒去生長液，以含 0. 01TCIDs。/個細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時 后，加入含2呢新生牛血清的DMEM維持液，在37t:含5^C02培養箱中培養觀察 48小時，凍融1次收獲感染細胞毒液，裝于滅菌容器內。
② 、制苗用病毒液的制備將生長良好的單層Marc-145細胞，倒去生長液， 按照0. 01TCIDs。/細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產用毒種，37'C吸附 1小時后，加入含2%新生牛血清的DMEM維持液，置37-C旋轉培養至48小時收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量》l(TTCID5。/ml病毒液在4'C滅活48小時 后，取滅活病毒液98份(體積份)，加入2份(體積份)的吐溫-80混合制成水相； 取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨攪拌至透 明為止，加熱到12rC、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混 合，混合之比為1:2.5—起乳化，分裝，入庫。
權利要求
1、一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其特征是其制備步驟如下①、生產用毒種的制備將已長成單層的Marc-145細胞倒去生長液，以含0.01TCID50/個細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小時后，加入含2％新生牛血清的DMEM維持液，在37℃含5％CO2培養箱中培養觀察48小時，凍融1次收獲感染細胞毒液，裝于滅菌容器內；②、制苗用病毒液的制備將生長良好的單層Marc-145細胞，倒去生長液，按照0.01TCID50/細胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產用毒種，37℃吸附1小時后，加入含2％新生牛血清的DMEM維持液，置37℃旋轉培養至48小時收獲病毒液；③、滅活疫苗制備將病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃滅活48小時后，取滅活病毒液94～98份(體積份)，加入2～6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相；取注射用白油94份(體積份)，司本-806(體積份)份混合后，加熱到121℃、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混合，混合之比為1∶1.5～1∶2.5，一起乳化，分裝，入庫。
全文摘要
一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下①生產用毒種的制備；②制苗用病毒液的制備；③滅活疫苗制備將病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml病毒液在4℃滅活48小時后，取滅活病毒液94～98份(體積份)，加入2～6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相；取注射用白油94份(體積份)，司本-806(體積份)份混合后制成油相；將水相與油相混合之比為1∶1.5～1∶2.5一起乳化即制成，分裝，入庫。該方法具有生產工藝簡單，制出的豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗效果好等優點。
文檔編號A61P31/14GK101607082SQ20081005004
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月18日 優先權日2008年6月18日
發明者喬榮岑, 習向鋒, 孫進忠, 孟照國, 晉春霞, 楊海岳, 榮駿弓, 閔亞杰 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司