專利名稱：豬圓環病毒2型elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒。
背景技術：
豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引發斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，該病主要以患畜生長緩慢、進行性消瘦和多系統病例損傷為特征。除了引發PMWS外，PCV2還與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征(PDNS)、母豬繁殖障礙等疾病相關。自1996 年在加拿大首次發現PMWS以來，PCV2感染引起的相關疾病已經在全世界廣泛存在。隨著我國養豬業受到PCV2感染的危害日益嚴峻，研制PCV2血清抗體檢測試劑盒的臨床需求迫切。 PCV基因組由一條共價閉合環狀單股DNA構成，包含兩個大的開放閱讀框架ORFl和0RF2， 分別編碼病毒蛋白復制酶(Itep)和病毒衣殼蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要結構蛋白， 含有4個抗原表位，具有較好的免疫原性和抗原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原。由于該病毒在體外培養不產生細胞病變，病毒繁殖能力低，難于獲得高產量的病毒抗原用于診斷目的。而昆蟲桿狀病毒表達系統以其表達外源蛋白產量高、免疫活性好、產物易純化、反應背景低等優點，在多種動物疫病診斷中得到應用。檢測PCV2的衣殼蛋白抗體可以反映PCV2的抗體水平，對豬群PCV2抗體水平進行監測，可確切了解豬體免疫水平或感染狀況，制定最適免疫程序或淘汰選育，有效預防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因此而引起的重大經濟損失。目前，國內外采用的PCV2檢測技術主要有病毒分離培養，間接免疫熒光，免疫酶單層實驗(IMPA)，原位雜交(ISH)，聚合酶鏈式反應(PCR)等等。上述技術和方法雖然可以檢測PCV2或抗體水平，在實踐中也取得一定的效果。但均存在試驗操作復雜，耗時長，需要特定的專業技能和儀器設備等，成品昂貴等缺點，不易在基層單位普及。中國專利公開號為 CN1584597A的專利申請公開了一種豬圓環病毒2型抗原或抗體ELISA檢測試劑盒。上述專利抗體檢測試劑盒所用檢測板包被的抗原為原核表達的蛋白，且二抗為羊抗豬多克隆抗體。本發明采用雙單抗結合技術檢測抗體，特異性更強，靈敏度更高。

發明內容
本發明的目的是提供一種豬圓環病毒2型(PCV2) ELISA抗體檢測試劑盒，本發明采用單克隆抗體包被法間接包被基因工程抗原制備反應板，進而組成用間接酶聯免疫吸附實驗檢測豬圓環病毒2型抗體的試劑盒，本試劑盒除了具有普通ELISA試劑盒的優點外，還彌補了由于抗原問題而導致的靈敏度低的缺點，從而提高檢測的靈敏度和特異性。本發明的技術方案為一種豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含有預包被豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體和豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2_Cap)的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶結合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，酶標板預先包被PCV2-cap蛋白單克隆抗體，包被緩沖液0. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量為每孔0. I-Iug ；封閉液為質量濃度是1-10%的BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被PCV2-cap蛋白，包被量為每孔0. I-Iug ；樣品稀釋液為含有質量濃度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有質量濃度0. 01-0. 05% NaN3 的O.Olmol/L及pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBQ ；酶結合物為辣根過氧化物酶-小鼠抗豬IgG酶結合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0. 05%吐溫-20的0. 01mol/L及pH7. 2-7. 4的 PBS ；酶底物A溶液為3，3’-5，5’-四甲基聯苯胺溶液，酶底物B溶液為雙氧水溶液；終止液為lmol/L H2SO4溶液，陽性對照、陰性對照放置在盒內。辣根過氧化物酶標記的是小鼠抗豬IgG單克隆抗體。上述各種溶液的配制①樣品稀釋液0. 1-10 % BSA, 0. 01-0. 05 % NaN3的 0. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；②洗滌液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐溫-20 (Tween-20)；③酶底物3，3，-5，5，-四甲基聯苯胺(TMB)溶液:i)底物A 液稱取TMBlOOmg加入IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物濃縮液；ii)底物B液稱取乙酸鈉IOg溶于IL純化水，用乙酸調PH值為5. 0，加入濃度為30% H202400ul即得；④終止液取54. 3ml濃度為95-98%濃硫酸加蒸餾水至1000ml即可。所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法為利用基因工程技術Bac-to-Bac系統構建表達PCV2-0RF2基因(Cap蛋白)的重組桿狀病毒，根據PCV2的基因序列設計Cap特異性引物上游引物 1 :5，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTTTA AGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 :5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2:5，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，以 PCR 從 PCV2 基因組中擴增出 0RF2 基因全序列，將其亞克隆至桿狀病毒穿梭載體PFastBac-Dual中，構建0RF2基因雙拷貝的重組質粒pFastBac-Dual-0RF2 (2X),將該重組質粒轉化大腸桿菌DHlOBac，獲得重組bacmid，將重組l^acmid轉染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒rBac-0RF2 (2X)0將該重組桿狀病毒感染 Sf9細胞，即可表達Cap蛋白，并且該蛋白可自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通過超速離心和CsCl密度梯度離心，即可獲得純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。本發明還提供了豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法，其中所述抗原酶標板制備方法是先包被豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體，再結合純化的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)。


圖1為本發明工藝流程圖。圖2為本發明檢測原理示意圖。圖3為表達的PCV2_cap蛋白SDS-PAGE分析圖。其中M是Marker，1是純化的 PCV2-cap 蛋白。
具體實施例方式實施例一.豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法
1.獲得PCV2-cap蛋白單克隆抗體PCV2-cap蛋白單克隆抗體抗體可商購，也可通過本領域常規方法制備，制備已知抗原的抗體的方法是本領域公知的；本發明中使用的 PCV2-cap 蛋白單克隆抗體購自 RuralTechnologies, Incorporated ；2.獲得辣根過氧化物酶(HRP)-小鼠抗豬IgG酶結合物小鼠抗豬IgG單克隆抗體可商購，也可通過本領域常規方法制備；本發明中使用的小鼠抗豬IgG單克隆抗體購自洛陽賽爾維實驗器材公司；然后用改良的過碘酸鈉氧化法進行標記；最后酶標記物加入
牛血清白蛋白、酪蛋白和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20°C保存備用；3.所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法為利用基因工程技術Bac-to-Bac系統構建表達PCV2-0RF2基因(Cap蛋白)的重組桿狀病毒，根據PCV2的基因序列設計Cap特異性引物上游引物 1 :5，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTT TAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2 :5，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，以 PCR 從 PCV2 基因組中擴增出 0RF2 基因全序列，將其亞克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac-Dual中，構建0RF2基因雙拷貝的重組質粒pFastBac-Dual-0RF2 (2X),將該重組質粒轉化大腸桿菌DHlOBac，獲得重組bacmid， 將重組bacmid轉染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒rBac-0RF2 (2X)0將該重組桿狀病毒感染 Sf9細胞，即可表達Cap蛋白，并且該蛋白可自我組裝形成病毒樣顆粒，收集Cap蛋白，通過超速離心和CsCl密度梯度離心，即可獲得純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白作為包被用抗原。4.將PCV2_cap單克隆抗體均勻的包被在酶標板孔上，包被緩沖液為0. 05M pH9. 6 的碳酸鹽緩沖液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03，包被量為每孔0. I-Iug ；封閉液為BSA或脫脂牛奶，濃度是1-10% ；封閉完再包被的是PCV2-cap蛋白，包被量為每孔 0.I-Iug ；5.試劑盒其他溶液配制①樣品稀釋液1% BSA，0.05% Ne^3的O.Olmol/L， pH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)；②洗滌液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐溫-20 (Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)溶液i)底物A液稱取 TMBlOOmg加入IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物濃縮液；ii)底物B液稱取乙酸鈉IOg溶于IL純化水，用乙酸調PH值為5. 0，加入濃度為30% H202400ul即得；④終止液取54. 3ml濃度為95%濃硫酸加蒸餾水至1000ml即可。實施例二 .豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟1.將待檢樣本用樣本稀釋液100倍稀釋，每孔加lOOul，同時加入陽性和陰性對照液，設空白對照。置37°C孵育1小時，洗滌液洗板5次，甩干，每孔加酶標抗體100ul，37°C 孵育1小時；洗滌液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，避光顯色5-10分鐘，加入終止液，每孔50 μ 1。利用酶標儀在450nm測定光吸收值A45tlnm.2.結果判定Cut Off(C0值)=陰性對照光吸收值A45tlnmX 2. 1倍，樣品值=樣品光吸收值A45cinmAX)值，樣品值大于1判為陽性；樣品值小于1和等于1判為陰性。實施例三實驗結果及分析1.特異性檢測用本發明制造的試劑盒分別檢測豬PCV2滅活疫苗免疫血清，豬 PCV2感染血清、豬PCVl感染血清、豬藍耳病毒抗體陽性血清、豬瘟病毒抗體陽性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、豬PCV2陰性血清，操作和判定按照具體實施方式
中豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟進行，結果顯示，豬PCV2免疫血清和感染血清檢測為陽性，其他樣品檢測為陰性，特異性為100%。2.靈敏度檢測用本發明制造的試劑盒檢測不同稀釋度的陽性參考血清，操作和判定按照具體實施方式
中豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟進行，檢測結果為最高檢測到陽性參考樣品的稀釋度為1 800。3.與現有試劑盒的實驗結果的比較實驗用本發明制造的試劑盒與同類試劑盒同時檢測豬PCV2免疫血清5份、豬PCV2抗體陰性血清和不同稀釋度的PCV2抗體陽性參考血清。操作和判定按照具體實施方式
中豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟進行，檢測結果顯示本發明中的試劑盒檢測靈敏度顯著高于其他同類產品。(見下表)
檢測樣品試劑盒1試劑盒2試劑盒3本發明試劑合 JIO-檢測板所包被抗原PCV2合成肽抗原原核表達的 PCV2-Cap 蛋白PCV2全病毒PCV2-Cap VLP顆粒檢測樣品稀釋倍數1: 51: 101: 51: 100豬 PCV2 免疫血清10. 5990. 8900. 4211. 20120. 6020. 5990. 5011. 32130. 5780. 5670. 4871. 10340. 5590. 5440. 4911. 22150. 5010. 4890. 4231. 099PCV2抗體陽性參考血清1: 100. 6021. 2010. 4981. 8971: 1000. 3240. 5690. 1991. 2561: 5000. 1210. 3760. 0991. 2011: 10000. 0870. 1210. 0650. 998豬 PCV2 抗體陰性血清1: 1000. 0760. 0870. 1210. 099序列表<110>武漢中博生物股份有限公司<120>豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒<160>4<210>1<211>29<212>DNA
<213>人工序列<400>1tctggatcca tgacgtatcc aaggaggcg 29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>2gcgaagcttt aagggttaag tggggggtc 29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3tctctcgaga tgacgtatcc aaggaggcg 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4gcgggtacct aagggttaag tggggggtc 29
權利要求
1.一種豬圓環病毒2型(PCM)ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒包含有預包被豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體和豬圓環病毒2型核衣殼蛋白的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、酶結合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，其中所述的核衣殼蛋白是純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。
2.權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述PCV2-Cap蛋白已自我組裝形成病毒樣顆粒，并通過CsCl密度梯度離心純化獲得。
3.權利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的PCV2-Cap蛋白通過如下方法制備提取豬圓環病毒2型基因組，通過特異性引物擴增PCV2-Cap基因片段，利用 Bac-to-Bac系統構建能表達PCV2_Cap基因的重組桿狀病毒，將所述重組桿狀病毒感染Sf9 細胞，收獲表達的Cap蛋白，通過CsCl密度梯度離心純化后作為包被用PCV2-Cap蛋白抗原。
4.權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的特異性引物是上游引物1:5’ -TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 :5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2 :5，-GCGGGTACCTAAGG GTTAAGTGGGGGGTC-3’。
5.權利要求1-4任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于酶標板預先包被PCV2-cap蛋白單克隆抗體，包被緩沖液是0. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量為每孔0. I-Iug ；封閉液為質量濃度是的牛血清白蛋白BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被純化的PCV2-Cap蛋白，包被量為每孔0. I-Iug ；樣品稀釋液為含有質量濃度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有質量濃度0.01-0. 05% NaN3的O.Olmol/L及 PH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBQ ；酶結合物為辣根過氧化物酶(HRP)-小鼠抗豬IgG單抗酶結合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0. 05%吐溫-20的0. Olmol/L及pH7. 2-7. 4的PBS ；酶底物A溶液為3，3’ -5，5’ -四甲基聯苯胺溶液(TMB)，酶底物B溶液為雙氧水溶液；終止液為 lmol/L H2SO4 溶液。
6.權利要求1-4任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含陽性對照和陰性對照。
7.制備如權利要求1-4任一項所述的試劑盒的方法，其特征在于所述抗原酶標板制備方法是先包被豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體，再結合純化的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)。
全文摘要
本發明涉及豬圓環病毒2型(PCV2)ELISA抗體檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含有預包被豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體和豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、酶結合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，其中所述的核衣殼蛋白是純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。本發明試劑盒的特異性達100％；靈敏度為1∶800。本試劑盒用于對豬群PCV2抗體水平進行監測，確切了解豬體免疫水平或感染狀況。
文檔編號G01N33/577GK102183650SQ20111003828
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月15日 優先權日2011年2月15日
發明者劉漢平, 廖園園, 朱薇, 熊媛媛, 靖志強 申請人:武漢中博生物股份有限公司