專利名稱：一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬于預防家禽傳染病的疫苗，具體地講涉及一種雞傳染性法氏囊三 聯滅活疫苗的制備方法。
背景技術：
雞新城疫俗稱"雞瘟"，是由雞新城疫病毒引起的一種高度接觸性傳染病。主
要經呼吸道和消化道感染，各種年齡的雞均可感染，以雛雞最為嚴重發病率和
死亡率可達80%以上。雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起雞的一
種急性、高度接觸性呼吸道疾病，傳播途徑主要是經呼吸道感染；發病多集中
在冬、春季；6周齡死亡率高，可達20%左右。傳染性法氏囊病(IBD)是一種
急性高度接觸性傳染病，是由雙鏈核糖核酸病毒(IBDV)引起的，能引起雛雞
免疫抑制，破壞法氏囊中B淋巴細胞的形成，臨床上以法氏囊腫大、腎損害為
主要特征。雛雞或中雛易感性最強，感染率可達100%,死亡率比較高，嚴重影
響養雞業的發展。為此開發了雞新城疫、傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊三
聯滅活疫苗，該疫苗具有使用簡便，接種程序簡單，減少疫苗的免疫次數，避
免家禽產生不必要的應激。

發明內容
為了克服現有技術不足，本發明公開了 一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗 的制備方法，主要預防雞新城疫、傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊病的發生， 工藝方法簡單，免疫效果優良，使用安全，易于保存的優點。
為了實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案-
所述一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下 ①、生產用毒種的制備將NDVLaSota株毒種用滅菌生理鹽水作10—4稀釋，將IBVM"株毒種用滅菌生理鹽水作10—3稀釋，分別接種SPF雞胚，孵育，收獲; 選取雞傳染性法氏囊CL01株毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋后接種在已長成良好 單層的雞胚成纖維細胞，孵育，收獲；
② 、制苗用病毒液的制備:將NDV La Sota株生產毒種用滅菌生理鹽水作10—4 稀釋，將IBV Mw株生產毒種用滅菌生理鹽水作10—3稀釋，同時接種同一枚易感 雞胚，孵育，收獲；雞傳染性法氏囊CL01株生產毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋， 接種在已長成良好單層的雞胚成纖維細胞，孵育，凍融1次后收獲；將收獲后 的NDV La Sota株和IBV N^病毒液分別濃縮3倍，將收獲后的IBDV CL01病毒 液濃縮6倍，滅活；
③ 、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(體積份)，IBV M41 株病毒液1份(體積份)、IBDV CLOl株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取 混合病毒液97 99份(體積份)，吐溫-80 1~3份(體積份)，混合制成水相備用；
④、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體 積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa磅壓力滅菌后制成油相；將水 相與油相混合，混合之比為1:1.5~2.5 —起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯 滅活疫苗；后分裝，貼簽，裝箱，入庫。
所述對病毒液濃縮是指將三種制苗用病毒胚液從冰箱取出，融化后分別在 無菌條件下用滅菌的裝有四層紗布和一層100目銅網的無菌漏斗濾過，除去雞 胚液和大的細胞殘渣及其他粗顆粒雜質；然后將粗濾的三種病毒液分別倒入濃 縮裝置的儲缸內，反復過濾至濃縮后的病毒液達到設計的濃縮終點為止。
所述滅活是指NDV La Sota病毒液采用0. 05 0. 15%甲醛溶液，35 38'C滅 活12 17小時，IBVM"病毒液采用2-8'C低溫滅活120-145小時，可使病毒徹底 滅活，而且不影響其免疫原性。本發明所用的NDV LaSota株毒種、IBV Mu株毒種、雞傳染性法氏囊CLOl 株毒種均購自中國獸醫藥品監察所。
所述對成品檢驗采用血清學的方法判定效力，比常規的攻毒檢測方法更為 準確結果更可靠，使三種抗原間的免疫干擾問題得到了很好的解決，采用血清 學的方法判定步驟方法，具體方法為取一月齡易感雞15只，其中10只各頸 部皮下注射疫苗0.3ml，另5只不接種，作為對照，21日后采血，分離血清，用 傳染性支氣管炎抗原測定HI抗體。
由于采用了上述的技術方案，本發明具有如下優越性-
本發明在生產工藝中獨創的將兩種毒珠液同時接種同一雞胚的方法比起兩 種毒珠液分別接種雞胚,節省了雞胚的使用數量，減少了疫苗生產的操作步驟， 避免了毒種污染機會，而且省去了疫苗制作中的濃縮環節，節省時間，提高效率。
本發明經過大量試驗最終找到了二種病毒液最佳的接種比例，并解決了兩 種病毒之間的互相干擾問題.使一次接種代替以往的二次接種，收獲和滅活也改 兩次完成為一次完成，節省了生產成本，縮短了生產周期。
本發明的三聯滅活疫苗可以簡化接種程序，使用劑量與單苗相當，但其效 力與單苗相同，從而減少接種動物應激反應的次數，此外對于產蛋雞，尤其是 種雞應盡可能避免或減少在產蛋期間做免疫接種，達到事半功倍的效果。
本發明采用了纖維膜超濾濃縮法，可提高免疫抗原在疫苗終產品的濃度達3 倍以上。纖維膜超濾濃縮裝置，設有二級孔徑不同的纖維濾柱。 一級濾柱的纖 維可濾除部分細菌和雜質。二級超濾株的中空纖維可截留病毒粒子。
具體實施例方式
實施例1:
一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下①、生產用毒種的制備將NDVLaSota株毒種用滅菌生理鹽水作10—4稀釋， 將IBVM"株毒種用滅菌生理鹽水作10—3稀釋，分別接種SPF雞胚，孵育，收獲; 選取雞傳染性法氏囊CLOl株毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋后接種在已長成良好 單層的雞胚成纖維細胞，孵育，收獲；②、制苗用病毒液的制備:將NDVLaSota 株生產毒種用滅菌生理鹽水作10—4稀釋，將IBV M"株生產毒種用滅菌生理鹽水 作10—3稀釋，同時接種同一枚9~10日齡易感雞胚，孵育，收獲；雞傳染性法氏囊 CL01株生產毒種用滅菌的PBS作10—2稀釋，接種在已長成良好單層的雞胚成纖 維細胞，孵育，凍融1次后將病毒胚液從冰箱取出，融化后分別在無菌條件下 用滅菌的裝有四層紗布和一層100目銅網的無菌漏斗濾過，除去雞胚液和大的 細胞殘渣及其他粗顆粒雜質；然后將粗濾的三種病毒液分別倒入濃縮裝置的儲 缸內，反復過濾至濃縮，使NDVLa Sota株和IBV M"病毒液分別濃縮3倍，將 IBDV CL01病毒液濃縮6倍；然后對NDV La Sota病毒液采用0. 1%甲醛溶液， 37""C滅活16小時；對IBV Mw病毒液采用4""C低溫滅活144小時，可使病毒徹底 滅活，而且不影響其免疫原性；③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病 毒液1份(體積份)，IBV M^株病毒液1份(體積份)、IBDV CL01株病毒液1 份(體積份)，混合均勻，取混合病毒液97份(體積份)，吐溫-80 3份(體積 份)，混合制成水相備用；④、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、 硬脂酸鋁2份(體積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa壓力滅菌后 制成油相；將水相與油相混合，混合之比為1:1.5 —起乳化，即制得雞傳染性 法氏囊三聯滅活疫苗；后分裝，貼簽，裝箱，入庫。
實施例2:
一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下 其制備步驟①、步驟②同實施例1制備步驟①、步驟②；步驟③、④改為③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液l份(體積份)，IBV M41 株病毒液1份(體積份)、IBDV CLOl株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取 混合病毒液98份(體積份)，吐溫-80 2份(體積份)，混合制成水相備用；
、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體 積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa壓力滅菌后制成油相；將水相 與油相混合，混合之比為1:2.0 —起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯滅活疫 苗；后分裝，貼簽,裝箱，入庫。
實施例3:
一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
其制備步驟①、步驟②同實施例1制備步驟①、步驟②；步驟③、④改為
③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(體積份)，IBV M41 株病毒液1份(體積份)、IBDV CL01株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取 混合病毒液99份(體積份)，吐溫-80 l份(體積份)，混合制成水相備用；
、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體 積份)混合均勻，混合后加溫至12rC 、 103kPa壓力滅菌后制成油相；將水相 與油相混合，混合之比為1:2.5 —起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯滅活疫 苗；后分裝，貼簽,裝箱，入庫。
權利要求
1、一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法，其特征是其制備步驟如下①、生產用毒種的制備將NDV La Sota株毒種用滅菌生理鹽水作10-4稀釋，將IBV M41株毒種用滅菌生理鹽水作10-3稀釋，分別接種SPF雞胚，孵育，收獲；選取雞傳染性法氏囊CL01株毒種用滅菌的PBS作10-2稀釋后接種在已長成良好單層的雞胚成纖維細胞，孵育，收獲；②、制苗用病毒液的制備將NDV La Sota株生產毒種用滅菌生理鹽水作10-4稀釋，將IBV M41株生產毒種用滅菌生理鹽水作10-3稀釋，同時接種同一枚易感雞胚，孵育，收獲；雞傳染性法氏囊CL01株生產毒種用滅菌的PBS作10-2稀釋，接種在已長成良好單層的雞胚成纖維細胞，孵育，凍融1次后收獲；將收獲后的NDV La Sota株和IBV M41病毒液分別濃縮3倍，將收獲后的IBDV CL01病毒液濃縮6倍，滅活；③、取滅活濃縮后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(體積份)，IBV M41株病毒液1份(體積份)、IBDV CL01株病毒液1份(體積份)，混合均勻，取混合病毒液97～99份(體積份)，吐溫-801～3份(體積份)，混合制成水相備用；④、用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體積份)混合均勻，混合后加溫至121℃、103kPa壓力滅菌后制成油相；將水相與油相混合，混合之比為1∶1.5～2.5一起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗；后分裝，貼簽，裝箱，入庫。
2、 根據權利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法， 其特征是所述對病毒液濃縮是指將三種制苗用病毒胚液從冰箱取出，融化后 分別在無菌條件下用滅菌的裝有四層紗布和一層100目銅網的無菌漏斗濾過， 除去雞胚液和大的細胞殘渣及其他粗顆粒雜質；然后將粗濾的三種病毒液分別 倒入濃縮裝置的儲缸內，反復過濾濃縮。
全文摘要
一種雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下①生產用毒種的制備②制苗用病毒液的制備③取滅活濃縮后的制苗用NDV LaSota株病毒液1份，IBV M₄₁株病毒液1份、IBDV CL01株病毒液1份，混合均勻，取混合病毒液97～99份(體積份)，吐溫-80 1～3份(體積份)，混合制成水相備用；④用白油96份(體積份)、司本-80 4份(體積份)、硬脂酸鋁2份(體積份)混合均勻，將水相與油相混合，混合之比為1∶1.5～2.5一起乳化，即制得雞傳染性法氏囊三聯滅活疫苗；該疫苗具一次接種代替以往的二次接種，節省了生產成本，縮短了生產周期等優點。
文檔編號A61P31/00GK101607085SQ20081005004
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月18日 優先權日2008年6月18日
發明者喬榮岑, 習向鋒, 孫進忠, 榮駿弓 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司