用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養的細胞株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒（PRRSV）培養的細胞株及其應用。該細胞株對PRRSV高度敏感且穩定，并能持續穩定增殖高滴度PRRSV。該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。將該細胞株用于PRRSV的增殖培養，其較之Marc145母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖。因此，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。對PRRSV高敏感的猴腎細胞系Marc145-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究與疫病防治過程中具有廣闊的開發和應用前景。
【專利說明】用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養的細胞株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于畜牧類生物制藥【技術領域】，涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養的細胞株，以及該細胞株在豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養中的應用。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸系統綜合征是由豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒(Porcinreproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種豬的高度傳染性疾病，又稱豬藍耳病。本病以妊娠母豬的繁殖障礙(流產、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道癥狀為特征。該病自1987年在美國被發現以來，曾經迅速傳遍世界各個養豬國家，在豬群密集、流動頻繁的地區更易流行，造成了嚴重的經濟損失。近幾年，該病在我國呈現明顯的高發趨勢，能引起不同品種、不同日齡、不同飼養管理模式的保育豬、仔豬和懷孕豬高發病率、高死亡率，給我國的養豬業造成了不可估量的損失。
[0003]PRRSV病毒的穩定性受PH和溫度的影響較大，在PH小于5或大于7的條件下，其感染力降低95%以上；在PH7.5的培養液中可于_20°C和_80°C長期保存，在4°C則緩慢失去感染力；對有機溶劑敏感，對常用的化學消毒劑抵抗力不強。
[0004]PRRSV病毒能在多種細胞上生長，但Marcl45是目前各實驗室培養PRRSV最常用的細胞。用Marcl45細胞接種豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒，細胞病變以聚集為特征，由于細胞病變死亡，病毒無法繼續繁殖，經過反復凍融收獲病毒液，病毒液只能收獲一次，收獲量小，病毒滴度低，強毒病毒含量在106_°~107_°TCID5(l/ml,弱毒毒株病毒含量在108_°~108 5TCID5Q/ml。可見，現有的Marcl45細胞雖然適合PRRSV的增殖，但是病毒滴度比較低，病毒含量不能滿足疫苗和診斷抗原的制備。
[0005]因此，目前存在的問題是為了獲得關于疫苗、診斷試劑盒等治療手段的更全面信息，進行更加直接有效的研究，需要克隆出一株對PRRSV高度敏感且穩定，并能持續穩定增殖高滴度PRRSV的Marc 145細胞株。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種用于PRRSV培養的細胞株，該細胞株對PRRSV高度敏感且穩定，并能持續穩定增殖高滴度PRRSV。該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。
[0007]本發明還進一步提供了一種上述細胞株在豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養中的應用。該細胞株較之Marcl45母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。
[0008]為此，本發明提供了一種用于PRRSV培養的細胞株，其中，所述細胞株為猴腎細胞系 Marc 145-1 株(Monke y kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏編號為:CCTCCN0:C2012185，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年12月10日。上述培養為增殖培養。
[0009]本發明中，所用術語“猴腎細胞系Marcl45_l株”是指從猴腎細胞系Marcl45母細胞克隆獲得的新細胞株，也稱為Marcl45-1細胞，簡稱Marcl45_l。
[0010]本發明中，所述猴腎細胞系Marcl45-1株具有以下特征:
[0011](1)從形態上觀察，猴腎細胞系Marc 145-1株比Marc 145母細胞形態規則，細胞之間界限明顯，整齊，細胞折光性強，胞質飽滿，核質清晰。細胞易于傳代和瓶壁分離。細胞變小，密度增大。
[0012](2)對PRRSV具有高敏感性；
[0013](3)病毒增殖過程中細胞的病變特征表現為細胞崩解，收獲的病毒液為Marcl45母細胞的4倍，病毒滴度提高f 2個滴度，并且這種敏感性可以穩定遺傳；
[0014](4)細胞生長速度變快，倍增時間提前了 Id (天)。
[0015]在本發明的一個【具體實施方式】中，所述猴腎細胞系Marcl45-1株通過以下方法構建完成，其包括:
[0016]步驟一，Marc 145細胞有限稀釋法克隆培養
[0017]將實驗室保存的無支原體、細菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45細胞(哈爾濱獸醫研究所)經胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，細胞計數后進行連續梯度稀釋，然后分別接種于96孔細胞培養板，37°C 5%C02培養箱培養l(Tl4d，挑選有單個細胞生長的細胞孔中的細胞轉入24孔板培養，并依次將細胞擴大培養到12孔板、6孔板、T25細胞培養瓶，獲得亞克隆細胞株；
[0018]步驟二，對豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒敏感的Marcl45細胞株的篩選。
[0019]挑選細胞狀態比較好的幾株克隆細胞分別接種于96孔細胞培養板內，待細胞長滿單層接種豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒，于37°C 5%C02培養箱培養48h，觀察細胞病變，并以未接毒的細胞作為陰性對照，挑選病變最明顯的Marcl45細胞株進行傳代，獲得Marcl45-1株，即，猴腎細胞系Marcl45_l株，并用液氮保存。
[0020]本發明還提供了一種根據本發明所述的細胞株在豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養中的應用，其包括:
[0021]步驟B，將豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒接種于猴腎細胞系Marcl45-1株進行培養;
[0022]步驟C，收獲病毒液。
[0023]根據本發明，在步驟B中，所述的培養為增殖培養。
[0024]在本發明的一個優選實施例中，在步驟B之前還包括步驟A，培養猴腎細胞系Marcl45-1株。在步驟A中，所述的培養為增殖培養。
[0025]在本發明的另一個優選實施例中，在步驟C之后還包括步驟D，對步驟C中收獲的病毒液進行毒價測定。
[0026]根據本發明，所述豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株CH-1R株以及豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株HBR株。
[0027]優選地，所述豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株及豬繁殖以及呼吸系統綜合征病毒CH-1R株。
[0028]在本發明的一個具體實施例中，采用猴腎細胞系Marcl45_l株對豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒NVDC-JXAl株的增殖培養。將猴腎細胞系Marcl45-1株接種于細胞培養瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM細胞生長液，于37°C 5%C02條件下48h可以長成單層，0.001M0I接種豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒NVDC-JXAl株，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37°C培養36~48h有80%的細胞出現細胞病變，以細胞崩解為主要特征，分別收獲上清液和細胞中的病毒，豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒NVDC-JXAl株的滴度均可以達到IO8 tlTCID5ci/ml ο
[0029]在本發明的一個具體實施例中，采用猴腎細胞系Marcl45_l株對豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒NVDC-JXAl-R株的增殖培養，收獲的豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒NVDC-JXA1-R株病毒液的滴度均可以達到109_ 5TCID5ciAil。
[0030]在本發明的一個具體實施例中，采用猴腎細胞系Marcl45_l株對豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒CH-1R株的增殖培養，收獲的豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒CH-1R株病毒液的滴度均可以達到109_ 5TCID5tZml。
[0031]根據本發明的猴腎細胞系Marcl45-1株形態均一，生長性能好，生長曲線呈“S”型，細胞形態和生長速度穩定，可連續傳代，在連續傳代過程中，每隔5代對其進行純凈性、病毒敏感性檢測，每隔10代對其進行“致畸、致瘤、致病變”試驗，結果表明，該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。 [0032]該猴腎細胞系Marcl45_l株在接種PRRSV后，病變特征發生了一些變化，表現為細胞崩解，且收獲的病毒液為Marcl45母細胞的4倍,病毒滴度測定表明，猴腎細胞系Marcl45-1株較之Marcl45母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖，PRRSV病毒含量提高了1-2個滴度，并且這種敏感性可以穩定遺傳，在傳代至50代內沒有丟失，仍能保持這種對病毒的高敏感性。經檢測，猴腎細胞系Marcl45-1株沒有細菌、真菌、支原體以及常見的幾種交叉感染病毒等外源污染。因此，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。對PRRSV高敏感的猴腎細胞系Marcl45-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究與疫病防治過程中具有廣闊的開發和應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為實施例2中Marcl45母細胞和Marcl45_l細胞生長曲線比對結果。
[0034]圖1中的坐標軸含義如下:縱坐標活細胞總數(個/孔)；橫坐標為時間(d)。
[0035]mmm
[0036]猴腎細胞系Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marc 145-1),由普萊柯生物工程股份有限公司篩選獲得，已在中國典型培養物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年12月10日，保藏編號:CCTCC N0:C2012185o
【具體實施方式】[0037]為使本發明更加容易理解，下面將結合實施例來詳細說明本發明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0038]實施例
[0039]實施例1:Marcl45細胞系的克隆和篩選
[0040]1.Marc 145細胞有限稀釋法克隆培養
[0041]將實驗室保存的無支原體、細菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45細胞(哈爾濱獸醫研究所)經胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，細胞計數后進行連續梯度稀釋，然后分別接種于96孔細胞培養板，370C 5%的CO2培養箱培養l(Tl4d，挑選有單個細胞生長的細胞孔中的細胞轉入24孔板培養，并依次將細胞擴大培養到12孔板、6孔板、T25細胞培養瓶，獲得亞克隆細胞株；
[0042]2.對豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒敏感的Marcl45細胞株的篩選
[0043]挑選細胞狀態比較好的幾株克隆細胞分別接種于96孔細胞培養板內，待細胞長滿單層接種NVDC-JXAl病毒(0.001M0I)，37°C吸附lh，接毒后48h觀察細胞病變，并以未接毒的細胞作為陰性對照，挑選病變最明顯的Marcl45細胞克隆株進行傳代，獲得Marcl45克隆細胞，亦即猴腎細胞系Marcl45-1株，并用液氮保存。
[0044]實施例2:猴腎細胞系Marcl45_l株的生物學性狀研究 [0045]1.細胞形態學
[0046]分別接長成單層的Marcl45母細胞和猴腎細胞系Marcl45_l株制備成細胞懸液，經細胞計數后，按照8 X IO4個/cm2接種于T25細胞培養瓶，加入含8%~?Ο%胎牛血清的DMEM生長液，于37°C 5%C02條件下培養48h，觀察兩者的細胞形態。細胞貼壁良好、形態飽滿、界限清晰，表面光滑。猴腎細胞系Marcl45-1株較Marcl45母細胞變小，密度增大，細胞之間的界限更明顯、整齊，細胞折光性強，胞質飽滿，核質清晰。
[0047]2.細胞動力學檢測
[0048]將長滿單層的Marcl45母細胞和猴腎細胞系Marcl45_l株制備成細胞懸液，經細胞計數后，按照8 X IO4個/cm2接種于24孔細胞培養板，加入含8%~10%胎牛血清的DMEM生長液，于37°C 5%C02條件下培養。24h后取3瓶細胞，制成細胞懸液，分別進行計數，三次測定結果取平均值。以后每隔24h取3瓶細胞計數一次，連續計數7d。
[0049]根據細胞計數結果(見表1)，以活細胞總數(個/孔)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線(見圖1)。
[0050]用下列公式計算細胞的比生長速率(μ )和分裂指數(Cd)。
「 nInXn-1nX11-1
[0051]μ =-

tn - tn -1
[0052]其中，X代表每毫升活細胞數目；t代表采樣的時間點；n代表采樣點。
[0053]

細胞培養最后的密度
—°82 細胞接種的密度
[0054]表1細胞動力學檢測對比結果
[0055]
【權利要求】
1.一種用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養的細胞株，其中，所述細胞株為猴腎細胞系 Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏編號為:CCTCCN0:C2012185，保藏于中國典型培養物保藏中心。
2.根據權利要求1所述的細胞株，其特征在于:所述培養為增殖培養。
3.一種根據權利要求1或2所述的細胞株在豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養中的應用，其包括: 步驟B，將豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒接種到猴腎細胞系Marcl45-1株進行培養； 步驟C,收獲病毒液。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:在步驟B中，所述的培養為增殖培養。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:在步驟B之前還包括步驟A，培養猴腎細胞系 Marcl45_l 株。
6.根據權利要求 5所述的應用，其特征在于:在步驟A中，所述的培養為增殖培養。
7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:在步驟C之后還包括步驟D，對步驟C中收獲的病毒液進行毒價測定。
8.根據權利要求3~7中任意一項所述的應用，其特征在于:所述豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株CH-1R株以及豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株HBR株。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒強毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株及豬繁殖以及呼吸系統綜合征病毒CH-1R株。
【文檔編號】C12R1/93GK103966157SQ201310046123
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2013年2月5日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司