專利名稱：豬生殖與呼吸綜合征分離株及其使用方法
技術領域：
本發明是關于新的野生型PRRS病毒分離株及其相應的改良型減毒PRRS病毒，該減毒病毒在疫苗及免疫組合物中的用途，以及檢測該病毒分離株病毒血癥水平，生長速度，抗體反應，或其組合的方法。更具體的，本發明提供一種預測新的或先前未表征的PRRS分離株的致病性的方法，減毒該分離株的方法，以及該病毒分離株在疫苗與免疫組合物中的用途。
背景技術：
豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種具包膜的單鏈RNA病毒，是屬于披衣病毒科(Arteriviridae)(Cavanaugh，1997年)。該病毒會造成一種普遍性的豬疾病，此癥在1987年首先出現于美國(Hill，1990年)并被稱為神秘豬病(mystery swine disease)。其臨床病征在于造成各年齡層豬的呼吸道疾病，而導致某些較年輕豬的死亡，以及對處于生殖年齡的母豬造成嚴重的生殖問題。
PRRSV的動態特性使其在疾病中持續地改變，為新的病毒分離株的出現充分提供了的機會(Andreyev等人，1997年；Murtaugh等人，1998年；Meng，2000年)。由于PRRSV不斷地演變，加上對豬農造成破壞性難題的能力，使其成為一個重要的主題而得到研究(Mengeling等人，1998年；Pejsak等人，1997年)、開發疫苗以及尋找其它降低傳染力的方法。病毒分離株致病性標準的差異，已在豬的肺部損傷及死亡情形中得以證明(Halbur等人，1996年)，但將這些生物學及免疫學上的差異與特定基因變異的相關的嘗試則多半失敗(Albina等人，1998年；Key等人，2001年；Yuan等人，2001年；Murtaugh等人，2002年；Grebennikova等人，2004年)。Labarque等人(2003年)，Mengeling等人(2003年a)及Nodelijik等人(2001年)的研究中，測試了PRRS疫苗的安全性及效率。這些研究證明，在實驗情況下，改良的PRRS活疫苗可降低病毒血癥的量和持續性，以及減輕病毒侵襲后造成的熱病和肺部損傷。
Opriessing等人(2002年)證明，當病毒分離株在開放讀框5(open readingframe 5，簡稱ORF5)具有高度氨基酸序列相似時，會造成豬有顯著不同程度的肺炎(pneumonia)產生。宿主差異也會影響豬對于PRRSV有不同反應(Mengeling等人，2003b)。研究已證明，致病性與PRRSV在豬中的復制速率和分布(Hayne等人，1997年)、巨噬細胞的銅離子清除能力(Thanawongnuwech等人，1998年)、以及宿主動物的貧血程度(Halbur等人，2002年)有關。然而，這些方法并無法提供有效預測新的或先前未表征的PRRS病毒分離株的致病性的方法。
根據前述，本領域需要一種預測PRRS病毒分離株致病性的方法。本領域進一步需要將病毒分離株給予或暴露或至既往無PRRS的豬后，根據豬體內PRRS病毒的生長速率和/或病毒血癥水平，來預測病毒分離株的致病性的方法。

發明內容
本發明克服上述問題，并且提供新的野生型PRRS病毒分離株，和該病毒分離株的減毒型，及其對應疫苗，該疫苗是含有減毒型PRRS病毒的藥物組合物。具體而言，本發明的野生型病毒分離株名稱為SDSU73、17198-6、MN 184，及其混合株。這些病毒分離株的減毒型，及包含減毒型分離株的完整疫苗，都能提供豬體內對抗PRRS的免疫力，而不會產生明顯的PRRSV臨床病征。
本發明的減毒型PRRS病毒分離株的另一特征為，它們大部分保留了野生型或未減毒病毒分離株產生病毒血癥的情況。因此，減毒型病毒產生的病毒血癥是野生型未減毒病毒所產生病毒血癥的至少50％，優選至少約75％。以這種方式，減毒型病毒能夠賦予豬較快速且完全的PRRS免疫力。
附圖簡述

圖1是實施例1中的豬測試的圖，其為平均血清病毒效價對時間的變化，所述病毒效價以log10 TCID50/ml表示；圖2是實施例1中的豬測試的圖，其為利用實時RT-PCR測定的平均血清PRRSV病毒濃度；圖3為使用商用ELISA測定法測定的平均S/P比值相對于對時間的圖；圖4圖示實施例1中商用ELISA化驗與log10 TCID50/ml數據的重復測量分析，其中用ELISA S/P比值曲線下的組平均值對log10 TCID50/ml下的組平均面積作圖；圖5圖示實施例1中商用ELISA化驗與RT-PCR濃度數據的重復測量分析，其中用ELISA S/P比值曲線下的組平均面積對RT-PCR濃度曲線下的組平均面積作圖；圖6a是實施例1中吸收值對時間作圖的圖；圖6b是用吸收值對時間作圖的圖，說明PRRSV分離株對nsp-4 IgG反應的影響，其中數據是十只動物的平均數值，但如動物死亡則不列入計算；圖7圖示了利用實施例1中的nsp-4與log10 TCID50/ml數據的重復測量分析，其中用nsp-4曲線下的組平均面積系對log10 TCID50/ml曲線下的組平均面積作圖；圖8是利用實施例1的臨床評分與log10 TCID50/ml數據的重復測量分析的圖，其中用臨床評分曲線下的組平均值對log10 TCID50/ml曲線下的組平均面積作圖；以及圖9是本申請中每個分離株的IHC評分的圖。
實施方式野生型病毒可以通過許多方法來進行減毒，例如使病毒在細胞培養中重復連續繼代、基因插入、基因轉換(gene switching)、基因缺失、堿基對置換與溫度敏感突變等。使用在本領域中所熟知的方法，所述減毒型病毒可以用于各種免疫組合物中，包括疫苗。在某些情況下，這些減毒型病毒可以利用本領域中所熟知的方法進一步被殺死或滅活，然后摻入或包含在根據本發明的致免疫組合物中。可用于防止PRRS感染或降低PRRS感染后臨床病征的嚴重程度的致免疫組合物的例子包括利用Abst-1或JA-142所制備而成的疫苗。
也發現本發明的疫苗可以以冷凍狀態進行儲存備用，而不會減損疫苗的所欲特征。這解決此技術中長久以來的問題，因為先前的PRRS疫苗并不適合冷凍儲存。
本發明進一步提供預測新的或未表征的PRRS病毒分離株致病性等級的方法。該方法通常涉及對新的或先前未表征的PRRS病毒分離株進行以下幾項參數中至少一項的評估病毒生長速率、病毒血癥水平、抗體反應、或其組合。然后利用評估得到的結果，來預測新的或先前未表征的病毒分離株的致病性等級。該方法通常涉及給予或將未受PRRS病毒感染的豬暴露于一定量的新的或先前未表征的PRRS病毒分離株，使病毒復制達約15天的一段時間，優選從約2到12天，更優選從約3到10天，更優選從約3到7天。給予病毒的方式可以用常規方式來實現，包括口服、鼻內、肌肉內、淋巴結內、皮內、腹腔內、皮下、或其組合，但是最佳的方式則是透過鼻內投藥。鼻腔投藥所使用劑量優選達約5毫升，更優選約在0.5到4毫升之間，更優選約1到3毫升之間，更優選則是約2毫升。每劑的病毒濃度應達約5.0 Log10 TCID50/ml，更優選約在1.0到4.0 Log10 TCID50/ml之間，更優選約在2.5到3.5 Log10 TCID50/ml之間，最優選是約3.0 Log10TCID50/ml。在此病毒復制期間選定的時間點，從豬獲取生物樣品，測量所給予病毒的生長速率、病毒血癥水平、抗體反應、和/或其組合。隨后將從這些分析收集的數據與其它已知或已確認的病毒分離株的病毒生長速率、病毒血癥水平、抗體反應、或其組合進行比較，作為預測新的或未表征的病毒分離株的致病性的標準。
利用本發明的方法，測量對其施予了八種不同PRRSV分離株中的一種的豬中的PRRS病毒生長、病毒血癥水平、抗體反應、和/或其組合。這些病毒分離株中的每一種都有已知的致病性水平與臨床病征。也測量對其給予了所有八種分離株的組合的豬中的上述特性。
更具體來說，將100只2到3周大的豬，根據其體重隨機分成10組，每組10只。所有豬皆利用HerdChekPRRS ELISA 2XR(IDEXX LaboratoriesInc.，Westbrook，ME)測試PRRS感染。其中對八組給予八種病毒分離株中的一種，一組給予所有八種病毒株的組合，最后一組則給予Eagle’s極限必需培養基(EMEM)當作對照組。對每種病毒接種進行取樣重新進行定量，以確定病毒效價。優選，設計給予的病毒效價使其與病毒的自然暴露水平相似。在整個實驗進行的不同階段，收集血液形式的生物樣品。通過病毒分離，定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，HerdChekPRRS ELISA 2XR，以及PRRSV蛋白特異性ELISA分析每個樣品。
病毒分離是通過連續稀釋血清并將其與EMEM、遺傳霉素(gentamicin)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)及兩性霉B(Fungizone)(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)混合在CL2621(一種MA 104細胞株)細胞上進行的。隨后保溫稀釋液，檢驗其致細胞病變效應(cytopathiceffect)(CPE)。利用Reed-Muench法計算病毒效價。
RT-PCR是利用QIAamp Viral RNA Mini-Kit(購自Qiagen，Inc.，Valencia，CA)進行的，而PRRSV則是利用Tetracore公司(Gaithersburg，MD)的單管分析(single-tube assay)來檢測的。為了確定病毒量，首先建立標準曲線，通過將對已知濃度的3’UTR轉錄產物作圖的循環閾值進行線性外推求得未知樣品的濃度。
使用ELISA S/P比值的抗體檢測是利用HerdChekPRRS ELISA 2XR根據制造商說明書而產生的。PRRSV蛋白特異性ELISA是利用在BL21(DE3)-RP細胞(購自Stratagene，La Jolla，CA)的重組病毒分離株VR2332表達的核衣殼蛋白(N)以及非結構性蛋白4(nsp4)來進行的。
在研究的開始與終點對所有豬進行體重測量。此外，在研究過程中的每一天，由獸醫對每只豬的PRRS病的臨床病征進行評估與評分。所有所得到的數據經統計分析，并基于群組進行比較。
十組中的九組隨后再次用高致病性病毒分離株攻擊，來進一步評估同源保護作用以及疫苗相對野生型異源保護作用(活病毒暴露的概念)。經過此次攻擊，評估豬并驗尸以使用病毒分離與免疫組織化學法而進行分析。
因此，本發明也提供包含減毒型PRRS病毒分離株的致免疫組合物。在優選的形式中，該組合物也可包括藥學上相容的載體和/或佐劑。該組合物其中一個例子包括Abst-1和/或利用上述方法所預測為具致病性PRRS病毒的減毒型。
本發明也提供一種改良的方法，來挑選用來減毒并包含入致免疫組合物的PRRS病毒分離株。該方法通常包括以下步驟a)取得致病性未知的PRRS病毒分離株；b)給予一定量的該PRRS病毒分離株到未感染PRRS的豬；c)使該病毒分離株在豬中復制約3到15天的時間；d)測量該期間內病毒生長速率和/或病毒血癥水平；e)將該生長速率或病毒血癥水平與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長速率和/或病毒血癥水平作比較；f)根據與致病性已知的病毒分離株相比較的生長速率和/或病毒血癥水平，選擇病毒分離株，用以減毒并包含入致免疫組合物。盡管有時會采用預測為致病性較低(包括那些無致病性)的病毒分離株，但是優選挑選預測為具高致病性的病毒分離株用以包含入致免疫組合物。這是因為預測為具高致病性的病毒分離株有較高生長速率和/或病毒血癥水平，如此通常造成較旺盛且保護作用較強的免疫反應。利用本發明的方法，簡化了挑選用以包含入致免疫組合物的病毒分離株的過程，并且增加了得到有效疫苗來對抗致病型PRRS病毒分離株的可能性。
此處所用“生長速率”意指測量病毒在豬中的復制隨時間的變化，實施例1提供優選實例。此處所用“病毒血癥水平”意指豬血液的病毒循環濃度，實施例1也提供優選實例。
參考實施方案的簡要說明以下實施例說明了根據本發明的優選病毒分離株及步驟。應理解，這些實施例僅為例示性，其不應視為對本發明范疇的限制。
實施例實施例1材料與方法一百頭2到3周大的健康豬獲自未受PRRS病毒感染的購得的豬群，并在獸醫師的管理下，飼養在愛荷華州安姆斯獸醫資源公司(VeterinaryResouces Inc.，Ames，Iowa)。豬的飲水與食物任意提供。參與本研究的所有動物照料人員及實驗室人員對于各組動物的處理方式均不知情。利用HerdChehPRRS ELISA 2XR(IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook，ME)對豬進行檢測，確定豬是否受到PRRSV感染。本實施例中所有的豬經測試均呈陰性。然后根據體重將豬隨機分成10組，每組有10頭豬。
本實施例所用PRRSV分離株總共有八種，這些病毒分離株已被命名為VR-2332、IngelvacPRRS MLV、JA 142、IngelvacPRRS ATP、SDSU 73、Abst-1、MN 184、與17198-6。這八種病毒分離株橫跨整個PRRS病的病史，表現出各種不同程度的致病性等級，并呈現相關的臨床病征。所有病毒分離株均生長在ATCC細胞系CL2621細胞上(CL2621是來自NVSL，Ames，IA的私有細胞株)(一種MA-104猴腎臟細胞系)。三株原始野生型病毒分離株VR-2332、JA-142與SDSU 73，也具有其對應減毒型，分別稱作IngelvacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.，St.Joseph，MO)、IngelvacPRRS ATP(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.，St.Joseph，MO)、以及Abst-1。這些減毒型病毒分離株均顯示較低或不可檢出的致病性，其通過在活體外傳代來減毒而衍生的。PRRSV分離株ATCC VR-2332是1991年在明尼蘇達州(Minnesota)分離出來，使用的是第三代細胞傳代培養物。此病毒的減毒型可商業購得，商品名稱為IngelvacPRRS MLV。PRRSV分離株JA142(ATCC編號為PTA-6504)由愛荷華州安姆斯國家動物疾病中心(NationalAnimal Disease Center)的William Mengeling所提供，是1997年在愛荷華州，從造成繁殖障礙的嚴重“流產風暴(abortion-storm)”病例中分離，使用第5代細胞傳代培養物。JA 142的減毒型可商業購得，其商品名稱為IngelvacPRRS ATP，且ATCC編號為VR-2638。PRRSV SDSU 73(ATCC編號為PTA-6322)是1996年在愛荷華州，從嚴重的繁殖疾病病例中發現，使用第一代細胞傳代培養物。SDSU 73的減毒型，稱為Abst-1(ATCC編號為PTA-6320)，通過52次傳代獲得。PRRSV分離株17198-6(ATCC編號為PTA-6321)，是1997年在俄克拉荷馬(Oklahoma)從一群患有嚴重繁殖疾病的豬中獲得的，使用第四代細胞傳代培養物。PRRSV MN184(ATCC編號為PTA-6319)是在2001年在南明尼蘇達從遭遇嚴重繁殖疾病與母豬死亡的養豬場中取得，由圣保羅明尼蘇達大學(University of Minnesota，St.Paul)的KurtRossow所提供，使用病毒分離株的第一代細胞傳代培養物。此外，我們也制備了包含所有病毒分離株的組合的混合株。
在第零天，將八種PRRSV分離株中的每一種及PRRSV混合株在含有4％胎牛血清(FBS)(JRH Bioscience，Lenexa，KS)的Eagle’s極限必需培養基(EMEM)(JRH Bioscience，Lenexa，KS)中稀釋至大約3.0 log10 TCID50/ml，然后經鼻內投藥至豬，劑量為一劑2毫升(每鼻孔1毫升)。給予未處理的對照組2毫升的培養液。在含有3日齡CL2621細胞的96孔板上滴定接種物以利用Reed-Muench法(Reed等，1938)確定效價。所觀察到施用至豬的效價，以及致病性水平的描述和分離信息列在表1中。
表1分離株的致病性和接種效價

*代表減毒型RRSV病毒**含有八種病毒分離株的混合物***發表在Symposium on Emerging Diseases(羅馬，2003年)中關于肺部損傷的摘要然后通過分析百分比序列同一性比較分離株以確定其基因相似度。序列同一性是將病毒樣品委托明尼蘇達大學診斷實驗室(Diagnostic Laboratory)進行序列分析來確定的。提供ORF 5-6的結果，然后將其與PRRS病毒的共有序列進行比較。個別堿基對的差異被注明，然后比較各病毒分離株的％序列同一性。如本領域技術人員所知的，blast搜尋也能在不同的網站上進行。例如，明尼蘇達大學提供一個PRRSV數據庫(ccgb.umn.edu/cgi-bin/common/web_blast.cgi)，其中列出從1989到2003年病毒分離株的序列。另一個常被使用的網站是NCBI BLAST，網址為ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。
根據表2顯示的百分比序列同一性與系統樹圖，致病性野生型病毒分離株的基因差異非常明顯，且代表多個組的PRRSV分離株。相反地，親代與疫苗PRRSV對在基因上相同。表2的成對比較(pairwise comparison)與系統樹圖是用序列分析工具中的Lasergene軟件套件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)所產生。
表2，本研究所用的致病型與減毒型PRRSV分離株的ORF5核苷酸序列的成對比較。相似百分比顯示在表格右上角，差異百分比顯示在表格左下角。系統樹圖顯示病毒分離株的遺傳相關度。條帶代表每一百殘基有一個核苷酸改變。VR2332是Ingelvac PRRS MLV的親代病毒分離株，JA 142是Ingelvac PRRS ATP的親代病毒分離株，SDSU 73是Abst-1的親代病毒分離株。
相似百分比


差異百分比在第49天，將2毫升致病型分離株PRRS MN 184經鼻內投藥至第1到9組。MN 184分離株系稀釋于MEM+4％FCS中，使其濃度等于log3.0+/-0.5每毫升。經稀釋的攻擊病毒(challenge virus)于內含用于測試的三日齡CL2621細胞的96孔板內滴定。動物被評估14天，然后進行驗尸。
病毒血癥的評估在第0、1、3、7、15、21、28、35、42、與49天，利用真空采血管(vacutainer)從各組的每只豬中采集血液樣品。以6000RPM離心20分鐘從凝集的全血中分離血清。然后將血清樣品分裝以用于通過病毒分離、TCID50分析、定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、HerdChekPRRS ELISA 2XR、和PRRSV蛋白特異性ELISA進行分析。本研究的血清樣品在收集后立即處理，并且在取得后三小時內放置冰上降溫。樣品儲存在4℃最久不超過24小時，之后儲存在-70℃。以RT-PCR檢測的血清樣品在收集當天凍在-70℃，并儲存直到樣品數目足以在24小時內進行測試，再將樣品解凍，提取，以及測試。
對于TCID50分析，將100微升來自每只豬的血清加到含有900微升EMEMm+2％FBS+50微克每毫升遺傳霉素(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)+2.5微克每毫升兩性霉素B(Invitrogen Corporation，Grand Island，NY)的稀釋管中。將稀釋管渦旋震蕩，取100微升到另一含有900微升EMEMm+2％FBS+50微克每毫升遺傳霉素+2.5微克每毫升兩性霉素B的稀釋管中。重復此步驟直到達到最終的稀釋度10-6。將每次稀釋的4種重復體鋪于內含每孔100微升CL2621(MA 104細胞)的96孔盤中，置于37℃與4％CO2的條件下培養八天。接著檢驗每個孔的細胞病變效應(CPE)，并利用Reed-Muench計算法測定效價。對于病毒分離，將100微升血清加到含有MA 104細胞的一式兩份的測試孔的每一個中。然后將板置于37℃、4％CO2下保溫1小時。接下將500微升EMEM+2％FBS+50微克每毫升遺傳霉素+2.5微克每毫升兩性霉素B加入每個孔。將板置于37℃、4％CO2下保溫八天，然后檢驗CPE。
為了從血清中提取病毒的RNA以用于定量RT-PCR，如試劑盒中的指示所述使用QIAamp Viral RNA Mini-kit(購自Qiagen Inc.，Valencia，CA)。對于實時PCR，商業可購得的實時單管RT-PCR試驗(其用于檢測美國PRRSV)系由Tetracore公司(Gaithersburg，MD)提供，并被用于檢測PRRSVRNA。通過比對GenBank PRRSV分離株并基于3’UTR引物與探針區的保守區域，從3’非翻譯區(UTR)PRRSV基因組區域設計小溝結合型(minorgroove binding，MGB)5’核酸酶探針與引物。使用由Tetracore U.S.PRRSVMaster Mix(18.9微升Master mix、2微升Enzyme mix 1、與0.1微升Enzymemix 2)與4微升提取的PRRSV RNA所組成的25微升反應體積，在單個管中轉錄PRRSV RNA。將反應管置入Smart Cycler IIblock(Cepheid，Sunnyvale，CA)中，將熒光檢測的軟件工具設定為用于基線的自動計算，并開啟背景扣除。溫度循環程序由以下組成52℃1800秒，95℃900秒，與以94℃30秒，61℃60秒和72℃60秒進行45個循環。假如循環閾值(Ct)水平在小于或等于45個循環獲得，PCR反應被認為是陽性。為定量，使用已知量的連續稀釋的體外轉錄RNA產物(1×10-1到1×108拷貝每微升)來產生標準曲線。未知樣品的拷貝/ml濃度通過將對濃度已知的3’UTR轉錄產物作圖的Ct值進行線性外推來測定。
抗體檢測ELISA S/P比值通過由根據生產商的說明進行HerdChekPRRS ELISA2XR(INDEXX Laboratories，Westbrook，MA)而產生。用于HerdChek的PRRSV蛋白特異性ELISA利用重組病毒分離株VR2332的核衣殼蛋白(N)以及非結構性蛋白質4(nsp4)來進行，其在BL21(DE3)-RP細胞(購自stratagene)中自質粒pET 24b表達為含有氨基末端myc標簽與羧端6x組氨酸標簽(6x histidine tag)的融合蛋白。變性蛋白質在0.1M Tris HCl，pH8.0，6M胍-HCl，2mM EDTA中透析，并調整濃度到3毫克每毫升。將DTT加至300mM，以0.45微米膜過濾溶液。經還原的蛋白質被加到重折疊緩沖液(100mM Tris HCl，pH8.0，0.5ML-精胺酸，8mM氧化型谷胱甘肽，2mM EDTA，10μM pepstatin A，10μM leupeptin，1mM PMSF)中，過濾(0.22μm)并攪拌過夜。經純化的蛋白質通過切向流式過濾(tangential flow filtration)(Pellicon XLUltracel PLC 5kd，Millpore)濃縮，再用20mM Tris HCl(pH8.0)透析。將蛋白質在具有Protein LabChip的Agilent 2100 Bioanalyzer上分析。經純化的蛋白質溶液儲存在-80℃。
蛋白特異性ELISA是通過用在pH9.6碳酸緩沖液中的100ng重組蛋白質或用單獨的緩沖液包被微量滴定板來進行。該板用含有0.1％Tween20(PBST)的磷酸鹽緩沖鹽水中的2.5％脫脂牛奶封閉(block)。將100微升稀釋度1∶2000的血清加入一式二份的孔中2小時，然后以PBST清洗盤，抗體的結合通過以下方法檢測與1∶5000稀釋的辣根過氧化酶偶聯的山羊-抗豬IgG(重+輕鏈(購自KPL，Gaithersburg MD))保溫1小時，接著洗滌，并用100微升TMB底物(購自KPL)呈色。反應利用1M磷酸終止，在波長450nm讀板值。
體重在第0天(研究第1天)及第49天(研究最后一天)對所有豬進行稱重。豬在可攜式電子重量-橫杠天平系統Weigh-TronixTM模式615XL(Wight-Tronix，Inc.，Fairmont，MN)上秤重。天平在每次使用前后以合格檢驗砝碼進行校正。
臨床評分在研究中每一天，每一豬由獸醫師對呼吸癥狀、行為、以及咳嗽進行評分，每一種臨床癥狀的評分為1到4分。正常動物給3分，最嚴重的臨床疾病給予9分，而死亡動物得到12分。研究中死亡的所有豬的樣品，被送至愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室進行病理檢驗。
肺部免疫組織評估在驗尸當天，將來自每只豬的肺部樣品用福爾馬林固定，以用于通過免疫組織化學及顯微鏡檢查符合PRRSV的損傷。此檢驗由愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室進行。
統計分析所有數據均輸入SAS(版本8.02)進行數據管理與分析。對所有適合的目標變量(out come variable)產生統計摘要，包括平均值、標準差、標準誤差、中位數、及頻率分布。對于體重、RT-PCR、及Log10 TCID50/ml的數據，通過單向ANOVA分析處理群組間的整體差異，并通過最低顯著差異t測定法(Least Significant Difference t test)對處理組間的差異進行成對檢測。組間差異的所有測試設計為雙向檢測(two-sided test)。差異在p值小于或等于0.05時被認為是統計上顯著的。
數據會進行一些變動以利于相關性分析。Log10 TCID50/ml的數值小于2.00時，會被設定為1.0。RT-PCR數值為陰性時，設定為1.0，而所有RT-PCR數值在分析前通過轉換為以10為底的對數(log base 10)進行常態化(normalize)。對照組的結果不包含在相關性分析中。每只豬的結果利用梯形法則(Trapezoidal Rule)轉換為曲線下近似面積。計算整個研究周期、從第一次觀察到第15天與從第15天到最后一次觀察的曲線下面積，但在圖中只顯示整個研究周期。
結果病毒分離與Log10 TCID50/ml的定量在感染當天的暴露以前，沒有動物對PRRSV測試陽性。透過鼻內感染的后第1天，五組中只有13只動物的病毒測試為陽性。然而，在感染后第3天，除了感染17198-6病毒分離株的動物以外，其它感染野生型(field)病毒分離株的所有動物皆呈為病毒陽性，平均Log10 TCID50/ml值為從2.1(SDSU-73)到3.9(MN 184)。相反地，接種減毒型病毒分離株的豬的細胞培養一律呈現陰性。這些結果在圖1顯示。對于5株致病性病毒分離株中的4株，在第7天達到病毒血癥峰值水平，其為從3.6到4.6 Log10 TCID50/ml。17198-6病毒分離株在第15天達到最高。所有致病性病毒組中的效價維持在接近或高于2 Log10 TCID50/ml 21天，但除了JA 142感染組具有低于該水平之外。
在接種了減毒型PRRSV分離株的豬中，病毒血癥程度比在接種致病型野生型病毒分離株的豬中低。減毒型病毒分離株的效價的組平均最高值比最低的致病型組效價的最高值低一個log值。除了在接種后第3天外，Abst-1分離株不曾被重新分離。從第7到28天，IngelvacPRRS MLV的病毒血癥在0.5到1.0 Log10 TCID50/ml之間變動，而從第7到28天，IngelvacPRRSATP的病毒血癥在0.4到1.2 Log10 TCID50/ml之間變動。減毒型病毒分離株的病毒在第28天后，無法從血清中回收，而到第35天，病毒僅可從二個致病型野生型病毒分離株組(分離株混合物-感染的與MN 184感染的豬)回收(結果也表示在圖1)。在第42及49天，病毒分離的結果顯示，幾乎所有豬均無病毒血癥發生。
整體來說，觀察到致病性越高的病毒分離株比減毒型病毒分離株在豬中復制速度更快，效價更高。具體地，MN 184病毒分離株感染的豬表現出非常迅速增加的病毒復制(其在第三天前開始)，在第7天達到超過4.5 Log10TCID50/ml的峰值。在達到峰值以后，MN 184病毒血癥不斷下降，但是在第28與35天，比起其它病毒分離株，仍然維持在顯著較高的效價(t檢驗，p值小于或等于0.05)。在所有其它致病型組(VR2332、JA 142、SDSU 73、與分離株混合物)中，均觀察到相似的趨勢(見圖1)。感染17198-6的豬，與MN 184感染組的趨勢相同，但是并不很接近。
施予減毒型病毒分離株(IngelvacPRRS MLV，IngelvacPRRS ATP與Abst-1)的豬的組的趨勢不同。在第3天后，它們開始顯示出適中的病毒當量增加，在第7到15天的間達到最大值，其病毒當量比任何致病型暴露組低一個對數值，并且比MN 184感染組低數個數量級。然后，在這些減毒型暴露組所觀察到的效價，在第35天或的前會下降到0(見圖1)。
當比較第二次暴露后的群組平均值時，減毒型組的病毒效價有非常急劇的增加，而致病型組只顯現較小的增加或甚至完全無增加。舉例來說，在第二次暴露后7天，Abst-1的效價為3.76logs，而MN 184的效價為0。其它減毒型組在第二次感染后第3天其效價達到最高。在第二次感染后對任何致病型組觀察到的最高效價為1.32logs，所述情況JA 142暴露后3天見到。
通過實時RT-PCR定量病毒病毒血癥水平也可利用實時RT-PCR測定，因為在CL2621細胞上的生長對于所有病毒分離株可能不相同，而且因為對于病毒血癥RT-PCR可比在細胞上生長更為靈敏。如圖2所示，致病型暴露組在第1天顯現平均濃度急劇增加，且所有組在第7到15天間的最大值達到超過8logs每毫升。致病型暴露組濃度接著在下幾個星期逐漸變低，在第49天濃度低于4logs每毫升。
減毒型病毒分離株暴露組的濃度同樣在大約第1天開始顯示遠較不明顯的增加，且其平均組效價從未到達或超過7logs每毫升(圖2)。對減毒型暴露組所觀察到的濃度，在暴露后數星期維持在顯現大范圍上下波動的水平。此波動主要是由于偶爾會在單個豬中檢測到高值。三種減毒型分離株暴露組都在研究的不同天數達到最大值。IngelvacPRRS MLV感染組在第28天達到最大濃度4.31logs每毫升，IngelvacPRRS ATP感染組在第3天達到最大值6.58logs每毫升，而Abst-1感染組在第35天達到最大值6.85logs每毫升，其是減毒型分離株達到的最高效價(圖2)。此外，在第3及15天，觀察到致病型分離株組的平均濃度明顯高于減毒型分離株組平均濃度(p值小于0.05)，但是在第49天，致病型分離株組的平均濃度明顯低于減毒型分離株組的平均濃度(p值小于0.05)。
HerdChekPRRS ELISA 2XR如圖3所示，由HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值所測得對PRRS病毒的體液性免疫反應顯示，在第15天時，致病型分離株暴露組的陽性結果平均提高超過0.4截點(cut off)。相反地，減毒型分離株暴露組平均值為陰性且所有三組均維持低于0.4直到第21天之后。IngelvacPRRS MLV與IngelvacPRRS ATP組在第28天顯示陽性結果，但是直到第42天，Abst-1病毒感染組未顯示超過0.4的平均S/P比值。
在致病型病毒分離株或分離株混合物感染的組與接種了減毒型病毒分離株的組的體液性免疫反應的比較中，很清楚抗體反應的動力學與量級與病毒血癥水平有相關性，特別是在感染后第14到35天之間。此觀察進一步由HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值與病毒效價或RT-PCR的成對比較所確定的病毒血癥水平與體液性抗體反應間的相關性所支持。圖4與圖5顯示體液性抗體反應在整個研究期間與病毒負荷密切相關，病毒效價的相關系數γ＝0.858，RT-PCR的相關系數γ＝0.794。此相關性是高度顯著的(每種情況中p值小于0.0001)，此外，減毒型病毒分離株表現出低抗體反應與低病毒負荷，而致病型病毒分離株顯示高反應。
PRRSV蛋白特異性ELISA為了獲得對PRRSV接種物與體液性免疫反應的差異間的相關性的進一步了解，測定針對N(主要結構蛋白)與nsp4(重要但次要的非結構蛋白酶)的抗體效價。圖6a顯示核衣殼蛋白抗NIgG抗體反應的動力學對所有組幾乎相同，在第28天達到最大效價，隨即在的后7到14天后急速減小，之后在第42到49天間維持不變或輕微增加。
每個分離株的反應程度與HerdChekPRRS ELISA 2XR結果所得相似，并且與病毒血癥水平一致。在第28天，最低的峰效價值在接種了減毒型病毒分離株的組中觀測到，而最高效價值在感染了高度致病型MN 184病毒分離株的豬中觀測到。到第49天，除MN 184與分離株混合物組之外，各組中抗N抗體的效價均相同，顯示對MN 184的體液反應可能在性質上不同。此外，到第49天，這兩組中每組只有5只豬存活，反映出第49天時，在MN 184組中的標準誤差增加。
如圖6b所示，對nsp4的IgG反應實質上與對N的不同。在第21天之前并沒有檢測到抗nsp4抗體，總體反應低得多，而且在接受IngelvacPRRS MLV與Abst-1的組中沒有檢測到明顯反應。此外，抗nsp4反應程度與病毒血癥水平沒有相關性。對于VR 2332、JA 142、MN 184及分離株混合物的反應均相同，在第28天到達最高值，隨后在第35天下降，然后在第42天再度上升，而在此四組中，病毒血癥的量級，時程與持續時間皆有不同變化。圖7表示當檢查重復測定分析(repeated measures analysis)時，nsp4 ELISA的數據與Log10 TCID50/ml數據相比，可發現病毒血癥水平與nsp4體液性抗體反應并無相關性。在第49天對MN 184病毒分離株的第二次暴露后，第二次反應也非常低。
體重在實驗第0天時，任一組的平均體重并無明顯差異(p值為0.099)。在第49天時，接種了減毒分離株Abst-1病毒的豬具有最高平均體重，除對照組外，明顯高于其它所有組(表3)。此外，在第49天時，除17198-6組外，所有致病型分離株暴露組的平均體重明顯低于對照組(表3)。減毒型分離株暴露組IngelvacPRRS MLV與IngelvacPRRS ATP以及對照組的平均體重在統計上相等(表3)。
表3平均體重病毒分離株第0天 第49天
VR23326.381 33.5bIngelvacPRRS MLV6.5634.6*JA 1426.4232.7bIngelvacPRRS ATP6.2435.0*SDSU-73 6.5932.9bAbst-16.6939.4aMN 1846.7323.7c17198-6 6.3634.5*混合物**6.5123.0c控制組6.4838.4*1體重以公斤為單位。第0天時的平均體重并無顯著差異。
*表示第49天時，這幾組的體重在統計上相同。
**混合物代表含有所有八分離株的混合物。
a除對照組外，顯著高于所有組(p值小于或等于0.05)。
b代表顯著低于對照組。
c代表顯著低于所有組。
臨床評分僅有在致病型暴露組中的四組觀察到平均臨床評分增加JA 142、SDSU 73、MN 184、與混合物組。在整個研究中，一直維持較高的評分，而剩下的組(包括致病型與減毒型暴露組)在研究期間基本上具有正常臨床評分。在本研究中所觀察到平均臨床評分改變唯一主要的因素是，一或多只動物在相關的處理組中死亡(表4)。
表4感染后豬死亡率組別病毒分離株 死亡率 死亡天數1 VR 2332 0/10 無2 IngelvacPRRS MLV 0/10 無3 JA 142 1/10(10％) 174 IngelvacPRRS ATP 0/10 無5 SDSU-73 2/10(20％) 9，23
6Abst-10/10 無7MN 1845/10(50％)14，14，17，23，41817198-6 0/10 無9混合組**5/10(50％)12，16，17，21，2110 對照組2/10*41，48減毒型PRRSV0/30(0％)致病型PRRSV13/60(22％)在處理組中所有死亡均是由于PRRS病毒與第二次細菌感染所造成的中度或嚴重非化膿性間質性肺炎(non-suppurative interstitial pneumonia)。
*由細菌性肺炎造成死亡，與PRRS病毒無關。
**混合物是含有所有八分離株的混合物。
臨床疾病的嚴重性與病毒負荷高度相關(病毒效價的p值小于0.001)。如圖8所示，MN 184與混合物感染的組的最高臨床評分。每組有百分之五十的豬死亡，病毒效價顯示，感染水平實質上比所有其它組高。根據RT-PCR所測定的病毒負荷的差異較不明顯(數據未顯示)，而臨床病征與由RT-PCR所測定的病毒負載的相關性比與病毒效價的相關性低(分別為γ＝0.556相對于γ＝0.803)。第10組(控制組)的臨床評分在兩只豬死于細菌性肺炎后增加。通過肺組織的免疫組織染色、陰性病毒分離與實時RT-PCR分析，顯示兩只豬皆呈PRRSV陰性，并且HerdChekPRRS ELISA 2XR或蛋白特異性ELISA顯示完全沒有血清轉化(seroconversion)。之后的發現顯示，在研究中意外死亡的豬，存在許多細菌性病原，因此可能由于受到第二次細菌感染而導致死亡(表5)。
表5暴露后死亡的原因豬編號 組別 死亡原因 死亡天數993 JA 142PRRS與豬鏈球菌(Streptococcus suis)17948 陰性對照組化膿性隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)與敗血41性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)983 陰性對照組化膿性隱秘桿菌與敗血性巴氏桿菌48922 SDSU 73 PRRS與細菌性肺炎*9
918SDSU 73 PRRS與埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)23973MN 184 PRRS與豬放射桿菌(Actinobacillus suis) 14992MN 184 PRRS與豬放射桿菌 14980MN 184 PRRS與埃希氏大腸桿菌 17971MN 184 PRRS與埃希氏大腸桿菌 23958MN 184 PRRS與埃希氏大腸桿菌 41976混合物 PRRS與豬放射桿菌 12970混合物 PRRS與豬鏈球菌16972混合物 PRRS與豬鏈球菌17995混合物 PRRS與豬鏈球菌21969混合物 PRRS與化膿性隱秘桿菌 21*診斷報告表示無所列特定因子的“細菌性肺炎”。
肺部免疫組織學評估雖然各組的平均IHC評分與所觀察到PRRSV損傷之間無明顯差異，但當根據致病性來比較IHC評分時，有明顯的差異存在。平均IHC評分與PRRSV損傷，如圖9與表6所示。
表6根據致病性的平均IHC評分

*＝p≤0.05時顯著。
討論本實施例的一個目的在于檢驗致病性水平已知的不同PRRSV分離株，來測定是否與其體內復制有關系，其可用于預測PRRSV分離株的致病性，而不需進行受控制的攻擊實驗。此外，興趣在于測定病毒分離株的致病性、病毒血癥水平、與體液性抗體反應之間的關系。最后，興趣在于利用本發明的方法，開發對抗被發現具有致病性的PRRSV分離株的疫苗。目標是獲得對其它致病性病毒分離株提供某種程度上的保護的疫苗；然而，此種交叉效用可能不是普遍地針對所有PRRSV分離株，且需要再進一步試驗。無論如何，明顯地本發明提供一種有效的工具，來鑒定疫苗開發的主要候選物。
為了在相同狀況下測試PRRSV分離株，所使用的經許可的疫苗(licensed vaccine)的劑量，必須低于美國農業部(USDA)所確定的最小免疫劑量，并且必須不是典型的商用劑量。此外，本研究所使用的MLV疫苗的經鼻內投藥途徑不是符合USDA標示，而僅是模仿較自然的暴露。經改良的活PRRS疫苗(Ingelvac PRRS MLV與Ingelvac PRRS ATP)的典型商用劑量要比本試驗使用的高得多。這些經改良活PRRS疫苗在實驗中所使用的低劑量，不代表此領域中所使用的實際產品劑量與型式，并且很容易解釋所報告的血清效應。使用疫苗的商用劑量時，利用IDEXX測定可在第14天測得血清學效價。在使用效價約為3logs的本試驗中，此血清反應會延遲且較低。這種現象本來是預期的，但進行它以確保在組間效價投與的一致性，并促進致病型與減毒型病毒分離株之間的分析與比較。雖然沒有在本實施例中特別指出，但是劑量所造成的影響對于減毒型或致病性較低的病毒比其對于致病性野生型病毒分離株很可能明顯得多，所述致病性野生型病毒在豬血清中可以快速生長，在暴露后3到7天內就可以收獲超過4logs每毫升的病毒量。較高的推薦的商用肌肉內劑量，在接種后14天(觀察本研究所用劑量的時間的二分之一)得到的HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值高于0.4截點(cutoff)(Roof等人，2003年)。本研究中的例行劑量(每只豬2×103TCID50)，在接受MN 184病毒分離株的組中造成50％致死率，并在所有組別造成抗核衣殼蛋白反應。較高的劑量并未進行測試，因為在用高致病性病毒分離株攻擊的組中的過多死亡會妨礙到本研究的目的。此外，先前的研究已經證明，在接種PRRSV分離株VR2332的年輕豬，在劑量為每只動物102.2，103.2與104.2TCID50時，臨床病征與病毒血癥并無差異。
Log10 TCID50/ml與實時RT-PCR的結果都顯示，在PRRSV暴露后組間的病毒血癥水平有明顯變化。這代表豬中PRRSV生長速率是病毒的一種表型特征，且其與豬對于病毒感染的耐受性的可能差異無關。此外，通過適應在CL2621細胞株中生長來使PRRSV減毒，不僅降低病毒在豬中生長，并且改變病毒復制的動力學，使病毒血癥峰值較晚出現。Chang等人(2002年)也有類似的觀察，他們證明即使在細胞傳代培養一段有限的時間，中度致病型PRRSV分離株VR 2332在豬中的病毒生長也會減慢，并且達到病毒血癥峰值的時間明顯延遲。然而，延遲病毒血癥峰值時間，對于體外細胞傳代培養或減毒并無診斷意義，因為高度致病型病毒分離株17198-6也表現出病毒血癥峰值時間延遲。
總而言之，當接種同樣劑量時，致病型病毒分離株與減毒型病毒分離株相比表現實質上更高的血清病毒血癥水平。舉例來說，在第15天對于給予IngelvacPRRS ATP的豬，任一減毒型病毒分離株暴露組中所觀察到最大的病毒效價為1.22logs，然而，在第15天任何致病性組的最低效價則是SDSU 73組中的2.40logs。在致病型PRRSV分離株中，病毒血癥在最大值出現在3到7天，及其所檢測到的病毒水平(全部大于3.5logs每毫升)有高度一致性，雖然其中MN 184在程度及持續時間上明顯較高，在第28和35天仍存在病毒效價。這支持以下概念高度致病型PRRSV分離株與減毒型或低致病型病毒分離株相比，在體內復制到較高的效價，但在野生型PRRSV中并無法建立致病性水平與體內生長速度之間的直接的量化關系(Haynes等人，1997年)。所述的組顯示對MN 184分離株的二次暴露的廣范的防護作用。例如，在MN 184及混合株組并沒有檢出病毒，兩者在最初均接受MN184病毒分離株。可見到Abst-1在暴露至MN894后賦予極小的保護。這些觀察進一步鞏固以下概念同源暴露比異源暴露提供更多的保護作用。同源致病型暴露系較防護性，而異源致病型暴露則較低保護性，但仍比異源減毒型暴露高。
實時RT-PCR結果在統計上與Log10 TCID50/ml結果非常類似，說明兩種方法都測量組與組間感染性病毒的相對水平。在第7天所測得數據中，RT-PCR與Log10 TCID50/ml值的皮爾森相關系數(Pearson correlationcoeffcient)為0.89，而平均實時RT-PCR與Log10 TCID50/ml值結果的皮爾森相關系數為0.88。實時RT-PCR所測定的濃度值比Log10 TCID50/ml值高幾個量級，原因包括含有目標擴增子(amplicon)的病毒顆粒與完全感染CL2621細胞的病毒顆粒的頻率的差異，以及能降低感染力的中和型抗體的存在(Dianzani等人，2002年)。然而，中和型抗體不太可能解釋其差異，因為在所有時間點(包括抗PRRSV抗體反應產生的前的時間)都可觀察到所述差異。
實時RT-PCR測得的拷貝每毫升值，比在細胞培養中由TCID50/ml所測得的感染效價值還高。這是因為基于病毒基因體拷貝數的標準曲線例行使用在定量RT-PCR中，其直接擴增病毒基因組序列而非已知的感染性病毒顆粒。生物分析例如細胞培養測量感染力的存在，然而其無法計數制備物中存在的所有感染性顆粒。影響感染性效價的因子(例如細胞培養條件與體內抗體(該抗體可以中和病毒)在其它研究中已經被觀察到，導致低估在血清中以TCID50/ml所測得的感染性病毒的量。或者，某些非感染性或復制缺陷型病毒可能存在，其可由較高拷貝數反映。
普遍來說，ELISA觀察結果支持以下想法體液性免疫反應規模與急性感染期間的病毒復制量相關。圖4與圖5所示的趨勢說明此相關性。利用細胞培養的減毒型病毒分離株引發較慢、較低的體液性免疫反應，而致病型病毒分離株則引發較快、較強的體液性免疫反應。此外，這些觀察也證明，至少有兩個因子(病毒分離株種類與感染劑量)影響在HerdChekPRRS ELISA 2XR中的相對S/P比值。雖然圖3所示的ELISA結果顯示明顯的陽性或陰性平均群組反應，但重要的是應注意個體動物間的差異。有些在減毒型病毒組中的豬在直到第21天一直呈現陽性反應，而有些致病型病毒組中的豬直到第21天仍為陰性反應。
分析對N及nsp4蛋白特異性抗體反應顯示，對PRRSV的免疫反應在程度上的變化與所接種的病毒分離株無關。在接種高度致病性病毒分離株MN 184與JA 142的動物中，對于N蛋白的抗體反應，顯示了與其它所有病毒分離株相似的趨勢，但在程度上較高。如圖1與2顯示，接種MN 184與JA 142的豬也具有最高病毒效價。這表明體液性免疫反應的程度在急性感染中可能與病毒負荷(如病毒效價所測定的)有關。有趣的是，所有組的反應的時間過程(time course)相同，雖然在高度致病性病毒分離株17198-6及減毒型病毒分離株中，最高效價到達時間延遲。反之，nsp4抗體反應在所有時間點且對于所有病毒分離株(減毒型及致病型)都很低。抗nsp4反應的時間流程在所有組中均相同，盡管與抗N蛋白抗體反應的觀察結果相同，每組到達最高病毒負荷的時間有所差異。圖7顯示所有豬的抗nsp4反應都很低。
這些觀察表明，某些PRRSV蛋白引起宿主免疫系統較強的反應，并且與所暴露的病毒分離株的致病性無關。然而，觀察也顯示，對于致免疫性較強的蛋白，其引發免疫反應的規模，可能與所暴露的病毒分離株的致病性，或病毒分離株在體內復制能力有關。另一可能性為，抗體反應的差異可能只是由于病毒分離株的基因差異，因而導致抗原反應性的差異，所以抗其它病毒分離株的N與nsp4的抗體不與VR2332病毒分離株表達的重組蛋白(其用于包被ELISA板)反應，或反應較差。然而，許多證據顯示，所觀察到抗體水平上的差異，反映出免疫相關性反應。根據ORF5比較測定，MN 184與VR2322病毒分離株基因差異最大，但是卻表現出最高抗N抗體反應。先前Kapuer等人(1996年)顯示，PRRSV分離株間在一開放讀框中的相對差異，在其它開放讀框中也同樣存在。此外，單一蛋白含有保守及非保守區域(例如Kapur等人，1996年)，而強烈的成免疫反應性可能針對保守性抗原決定區(Ostrowski等人，2002年)。雖然如此，根據對經純化PRRSV蛋白的抗體反應的ELISA結果可能受到基因及抗原差異影響，而這些效應需被考慮進去。對重組蛋白進行重折疊，但在包被了未經重折疊或經重折疊的蛋白的ELISA板之間未觀察到差異。
需要注意的是，大約在接種后4到5周，發生對N及nsp4的抗體反應相對上較大的降低。Foss等人(2002年)先前對GP5(主要的膜醣蛋白)也觀察到相似的1到2周的抗體反應性高峰然后抗體反應性降低。總之，這些觀察結果提示，對于單一病毒蛋白的反應可能無法代表豬對PRRS病毒的免疫反應的全貌，因為由HerdChekPRRS ELISA 2XR所測定的體液性免疫反應并未顯現抗體反應性的相似的短暫峰值。
生長減慢和死亡是使致病性及病毒的體內生長速率相互關聯的關鍵。在致病性病毒暴露組中觀察到的較低平均重量最可能反映PRRSV分離株在豬體內復制并誘導較嚴重疾病的能力的差異。這些觀察與先前報導數據一致(Thacker，2003年)PRRS感染可能造成食欲不振，而日增重(daily weightgain)降低25到40百分比。暴露于致病型病毒的豬的臨床評分在接種后不久顯現快速增加，但此時，減毒型病毒暴露組動物的臨床評分實際上并無改變。臨床病征的增加在接受PRRS分離株MN 184、SDSU 73、與JA 142的致病型暴露組中表現為所觀察到的死亡率分別為50％、20％與10％。反之，減毒型暴露組并未造成豬死亡。當比較暴露于MN 184與Abst-1的組時，在相同病毒感暴露況下，快速的病毒生長與病毒致病性的間關系最明顯。接種效價實際上相同，分別為4.10logs每毫升及4.18logs每毫升，但是如圖8顯示，兩病毒分離株影響豬的方式存在顯著差異。Abst-1病毒分離株幾乎無活性，幾乎不在體內復制，且不導致臨床病征出現。相反地，MN 184病毒分離株在活體內復制至高效價，并造成嚴重臨床病征，使50％暴露的動物死亡。另外需注意的是，暴露至所有病毒分離株的混合物的豬，表現出與暴露至MN 184的豬的相同的病毒學、臨床及免疫學反應。這個發現表明，在混合感染中，復制最快速的病毒可能勝過它種病毒分離株，導致最終結果與感染生長潛力最高的單一病毒分離株的情況相同。
致病型與減毒型PRRSV分離株在體內引人注意的差異，使我們明白病毒的致病性與其體內生長及復制的間的相關性。當給予豬相等劑量時，致病性越高的病毒分離株顯示的Log10 TCID50/ml當量值及RT-PCR濃度值與減毒型病毒分離株相比呈指數式升高。致病型病毒分離株誘發較快速、較強的體液性免疫反應。致病型病毒分離株與減毒型病毒分離株相比，負面地影響獲重并且造成較高死亡率與較嚴重的臨床病征。
總結來說，本申請案的實施例及實驗表示，減毒型及致病型PRRSV分離株造成顯著不同的臨床病征，以及不同規模的免疫反應。這些差異的原因是病毒在體內復制能力，其為可在血清樣本中定量檢測，并可以建立以預測PRRSV分離株致病性的表型特征。
實施例2本實施例提供幾種對PRRS病毒分離株的減毒及將其包含入致免疫組合物的方法。
材料與方法配制疫苗制備物，其中摻入了經修飾或減毒的活病毒，以用于使豬通過感染PRRS病毒而獲得免疫。用于疫苗制備物的PRRSV病毒是在MA-104持續性細胞株中繁殖，優選ATCC No.CL2621。細胞系生長在含有加入10％胎牛血清的MEM的培養瓶中。培養基的pH值調整至大約7.2，并培養在大約37℃。之后通過加入大約1毫升冷凍接種物到液態培養液基而用病毒接種細胞。使病毒吸附到細胞上，保持24小時。此時，將生長培養基更換為維持培養基(由加入4％胎牛血清的MEM，pH7.6所組成)。環境優選為35到37℃。使病毒生長，直到50％MA-104細胞薄層被病毒破壞。將樣本冷凍，并準備傳代至另一燒瓶的MA-104細胞。持續此過程，使病毒在細胞系中傳代25代。之后在31℃，而非35到37℃，用上述相同技術，讓病毒繼續繁殖12代。將第12代進行分裝，冷凍，稱為種原病毒株(Master SeedVirus)。
以下詳細說明較佳的方法。
I.培養基a.Eagles極限必需培養基(MEM)，購自JRH Biosciences，貨號為#200-2041。
b.胎牛血清(FCS)，購自JRH Biosciences。
c.細胞培養的生長培養基-MEM+10％胎牛血清d.維持培養基-MEM 4％胎牛血清e.胰蛋白酶-Versene IXf.5％或飽和的碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate)。
II.組織培養所使用細胞系MA-104(非洲綠猴(African Green Monkey)腎細胞，維持在20傳代數水平內(繼代數約58到78代)。
III.設備75cm組織培養瓶設定在35到37℃的培養箱設定在31℃的培養箱離心機IV.用于生長在25到37℃的減毒PRRS病毒的方法。
A.制備組織培養的母液(stock)將5到7天的MA-10475cm儲存瓶，依下列方式以1比4方式分裝a.倒掉所有培養基(每個培養瓶50毫升)。
b.使用10毫升胰蛋白酶-Versene，在37℃保溫5到10分鐘，以移出細胞薄層。
c.將細胞從瓶中取出，以270xg離心5到10分鐘。
d.倒掉上清液，并將細胞再懸浮在5到10毫升生長培養基(MEM10％FCS)中。
e.將所有細胞加到200毫升MEM 10％FCS中，然后分配到四個75cm培養瓶中，每瓶50毫升以1比4分裝。之后將培養瓶置于35到37℃，直到實驗所需(可在無二氧化碳環境下進行)。
f.已形成細胞薄層的3到4天的培養瓶可立即使用。
g.調整培養瓶中的50毫升培養液的pH值到7.2，然后加入1毫升病毒到培養基中，將培養瓶置于35到37℃(可在無二氧化碳環境下進行)。
h.24小時后，倒掉培養基，重新加入50毫升MEM 4％FCS(pH7.6)到培養瓶中，再置于35到37℃。
i.此次液體更換24小時后，CPE應出現，而當50到60％孔洞出現在細胞薄層中時，將其冷凍。
j.將上述培養瓶解凍，取1毫升其中液體并將其移到新的75cm培養瓶，如上述，以制造下個病毒繼代。
進行此以上步驟總共25次，生長在35到37℃。
V.用于減毒生長在31℃的PRRS病毒的方法。使用在35到37℃繼代25次的病毒來制備生長在31℃病毒的第1繼代。
A.準備組織培養的母液5到7天的MA-104細胞75cm儲存瓶，依下列方式以1比4方式分裝a.倒掉所有培養基(每個培養瓶50毫升)。
b.使用10毫升胰蛋白酶-Versene在37℃保溫5到10分鐘，以移出細胞薄層。
c.將細胞從瓶中取出，以270xg離心5到10分鐘。
d.倒掉上清液，并將細胞再懸浮在5到10毫升生長培養基(MEM10％FCS)中。
e.將所有細胞加到200毫升MEM 10％FCS中，然后分配到四個75cm培養瓶中，每瓶50毫升，1比4分裝。之后將培養瓶置于35到37℃，直到實驗所需(可在無二氧化碳環境下進行)。
f.已形成細胞薄層的3到4天的培養瓶可立即使用。
g.調整培養瓶中的50毫升培養基pH值到7.2，然后加入1毫升病毒到培養基中，將培養瓶置于31℃(可在無二氧化碳環境下進行)。
h.24小時后，倒掉培養基，重新加入50毫升MEM 4％FCS(pH7.6)到培養瓶中，置于31℃。
i.此次液體更換24小時后，CPE應出現，而當50到60％孔洞出現在細胞薄層中時，將其冷凍。
j.將上述培養瓶解凍，并取出1毫升此液體以制備下個SIRSVR-2332病毒繼代。
在31℃執行以上步驟總共12次。將生長在31℃病毒的第12繼代稱為種原病毒株(Master Seed Virus)，用來生產疫苗。
利用基因缺失使PRRS病毒減毒熟習此技術者可以利用傳統基因缺失方式使PRRSV減毒。一般來說，該方法包括使編碼病毒的致病表型的相關基因缺失。該方法可以改編自如Elbers等人(U.S.Pat.App.No.20020012670)或Schall等人(U.S.Pat.No.6,740,324)的參考文獻，其教示與內容系以引用方式包含入本文中。
利用溫敏型突變使PRRS病毒減毒熟習此技術者也可以利用傳統溫敏型突變方法使PRRSV減毒。一般來說，此方法包括造成突變，其限制病毒活化的溫度范圍。例如，可以改編Skiadopoulos等人(”Identification of Mutations Contributing to theTemperature-Sensitive，Cold-Adapted，and Attenuation Phenotypes of the Live-減毒的Cold-Passage 45(cp45)Human Parainfluenza Virus 3 CandidateVaccine”，73 No.2 Journal of Virology 1374，(February 1999))的方法以用于PRRSV。Skiadopoulos等人的教示及內容系以引用方式包含入本文中。
利用建立感染性殖系使PRRS病毒減毒熟習此技術者也可以利用傳統建立感染性殖系的方法使PRRSV減毒。一般來說，該方法包括建立含有所需病毒基因型的全長cDNA克隆，該克隆也對目標動物具有致病性。例如，可以改編Nielson等人(”Generation of anInfections Clone of VR-2332，a高ly Virulent North American-type Isolate ofProcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus”，77 Journal of Virology3702(Mar.2003))的方法以用于PRRSV的減毒型。Nielson等人的教示及內容系以引用方式包含入本文中。
利用基因插入使PRRS病毒減毒熟習此技術者也可以利用傳統基因插入方法使PRRSV減毒。一般來說，該方法包括將一段基因插入到病毒中，該基因抑制病毒的致病性表型。例如，可以改編Schall等人(U.S.Pat.No.6,740,324)的方法以用于此等PRRS病毒的減毒型。Schall等人的教示及內容系以引用方式包含入本文中。
利用堿基對置換使PRRS病毒減毒熟習此技術者也可以利用傳統密碼子與堿基對置換方法使PRRSV減毒。一般來說，密碼子或堿基對置換包含用不同的密碼子或堿基對置換密碼子與堿基使病毒基因編碼限制病毒病原性的蛋白質。例如，可以改編McAuliffe等人(”Codon Substitution Mutations at Two Positions in the LPolymerase Protein of Human Parainfluenza Virus Type 1 Yield Viruses with aSpectrum of Attenuation In Vivo and Increased Phenotypic Stability In vitro”，78Journal of Virology 2029(February 2004))的密碼子置換方法，來建立用于減毒PRRS病毒的基因置換方法。此外，Hurrelbrink與McMinn(”Attenuationof Murray Valley Encephalitis Virus By Site-Directed Mutagenesis of the Hingeand Putative Receptor-Binding Regions of the Envelope Protein”，75 Journal ofVirology 7692(Auguest 2001))以及Elbers等人(U.S.Pat.App.No.20020012670)提供堿基對置換方法，其可被改編來建立經減毒PRRS病毒分離株。McAuliffe等人、Hurrelbrink與McMinn、以及Elbers等人的教示及內容系以引用方式包含入本文中。
利用嵌合型PRRS構建體使PRRS病毒減毒熟習此技術者也可以利用傳統嵌合型構建體的方法使PRRS病毒減毒。一般來說，嵌合型構建體系帶有不同種的基因以在宿主細胞中誘發產生抗原性反應。例如，可以改編Harris等人(U.S.Pat.App.No.20040157307)的方法，來建立具有PRRS基因的嵌合型構建體。
將減毒型PRRS病毒分離株摻入致免疫組合物在對新的病毒分離株進行減毒后(優選以上述方法之一)，將該減毒型分離株摻入可有效提供對抗PRRS致病性分離株的免疫反應的組合物。優選方式是，對于接受有效量組合物的動物，該組合物可以提供對抗PRRS病毒感染的防護性免疫。在以后暴露或受到致病型病毒分離株感染的接種后的動物中，此種防護性免疫可以降低PRRS病毒感染的臨床病征的嚴重度。優選，所述臨床病征會通過投藥有效量的致免疫組合物或疫苗而得以防止。在某些形式中，減毒型PRRS分離株會被用來制備經改良的活病毒疫苗，其中在致免疫組合物中，減毒分離株以其存活狀態使用。在其它形式中，減毒分離株會在包含入致免疫組合物前被殺滅或滅活。
參考文獻以下每個參考文獻的教示與內容系以引用方式包含入本文中。
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權利要求
1.一種預測致病性未知的PRRS病毒分離株的致病性的方法，其步驟包括將一定量的該PRRS病毒分離株給予到未受PRRS病毒感染的豬，使病毒在所述豬中復制大約3到15天的一段期間，測量該期間內病毒生長速率和/或病毒血癥水平，并比較該生長速率和/或病毒血癥水平與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長速率和/或病毒血癥水平，以其作為致病性未知的PRRS分離株的致病性預測指標。
2.根據權利要求1的方法，所述期間大約在3到7天之間。
3.根據權利要求1的方法，包括在所述期間測量病毒血癥水平，以及比較該水平與所述已知PRRS病毒分離株的病毒血癥水平的步驟。
4.根據權利要求1的方法，該給予的病毒的量類似于動物自然暴露所接受的量。
5.根據權利要求1的方法，該PRRS病毒通過選自口服，鼻內、肌肉內、淋巴結內、皮內、腹腔內、皮下、或其組合所組成的組的方法而給予。
6.根據權利要求1的方法，該生長速率或病毒血癥水平在來自所述豬的生物樣品中測量。
7.根據權利要求1的方法，該病毒血癥的測量通過Log10TCID50/ml、逆轉錄酶聚合酶鏈反應、PRRS特異性ELISA、PRRS蛋白-特異性ELISA、或其組合來進行。
8.根據權利要求1的方法，進一步包括在給予所述PRRS病毒分離株后觀察該豬PRRS感染的臨床病征的步驟。
9.根據權利要求8的方法，該臨床病征包括呼吸癥狀、行為、咳嗽，或其組合。
10.根據權利要求1的方法，進一步包括當該PRRS分離株的生長速率或病毒血癥水平與具有高致病性的病毒分離株相似時預測該PRRS病毒分離株具有高致病性的步驟。
11.根據權利要求1的方法，進一步包括當該PRRS分離株的生長速率或病毒血癥水平與具有低致病性的病毒分離株相似時預測該PRRS病毒分離株具有低致病性的步驟。
12.根據權利要求1的方法，其中該PRRS病毒的給予量可達大約5毫升接種物，其病毒濃度可達5.0 Log10TCID50/ml。
13.一種致免疫組合物，其包括減毒型PRRS病毒分離株與藥理學上相容的載體，該減毒型PRRS病毒分離株選自由Abst-1以及根據權利要求1的方法被預測為具致病性的PRRS病毒的減毒形式所組成的組。
14.根據權利要求13的組合物，該減毒型病毒分離株為Abst-1。
15.根據權利要求13的組合物，所述根據權利要求1的方法被預測為具致病性的PRRS病毒分離株選自由ATCC VR-2332、ATCC PTA-6504、ATCC PTA-6319、ATCC PTA-6321、與ATCC PTA-6322所組成的組。
16.一種挑選用于減毒并包含入致免疫組合物中的PRRS病毒分離株的方法，其包括以下步驟a)獲得致病性未知的PRRS分離株；b)將一定量的該PRRS病毒分離株給予未受PRRS病毒感染的豬；c)使該分離株在該豬中復制從大約3到15天的一段期間；d)在該期間測量病毒生長速率和/或病毒血癥水平；e)將該生長速率和/或病毒血癥水平與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長速率和/或病毒血癥水平比較；以及f)根據分離株的生長速率和/或其病毒血癥水平與致病性已知的分離株的比較，挑選用于減毒并包含入致免疫組合物的分離株。
17.根據權利要求16的方法，步驟(f)進一步包括挑選與高致病性分離株具有相似的生長速率和/或病毒血癥水平的分離株。
18.根據權利要求16的方法，進一步包括使所選病毒減毒的步驟。
19.根據權利要求18的方法，該病毒選自通過在細胞培養物中重復連續傳代、基因插入、基因轉換、基因缺失、堿基對置換、與溫度敏感突變所組成的組的方法來減毒。
20.根據權利要求18的方法，進一步包括將該所選病毒包含入致免疫組合物的步驟。
全文摘要
本發明提供一種預測新的或未表征的PRRS病毒分離株的致病性的方法，其中，將病毒分離株注射到豬，使其復制一段時間(大約3到15天)。在該期間，測量病毒生長速率和/或病毒血癥水平，并將此數據與致病性已知的PRRS病毒分離株的生長速率和/或病毒血癥水平作比較，以此當作新的或未表征的PRRS病毒分離株的致病性的標準。此外，本發明也提供一種根據所預測的致病性來挑選用以包含在致免疫組合物中的病毒分離株的方法，以及包含預測為致病型病毒的減毒型的組合物。
文檔編號C12N7/04GK101090981SQ200580038053
公開日2007年12月19日 申請日期2005年9月21日 優先權日2004年9月21日
發明者邁克爾·魯夫, 埃里克·沃恩, 韋斯利·約翰遜 申請人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡有限公司