專利名稱：一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，尤其涉及一種病毒的檢測試劑盒及其方法，特別是一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒及方法。
背景技術：
豬圓環病毒2型(Porcine circovirus-2, PCV-2)可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、繁殖障礙(Iteproductive failure)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、增生性壞死性肺炎(PNP)及先天性震顫(CT)等多種疾病，但以PMWS 最為常見，目前該病在世界范圍內廣泛流行，死亡率10% 30%不等。郎洪武等(郎洪武， 2000)采用ELISA方法對北京、河北、山東、天津、吉林、河南等七省(市)22個豬群的559 份血清進行了檢測。樣品總陽性率為42. 9% 040/559)，其中20日齡未斷奶仔豬抗體陽性率為0(0/58)、1 2月齡斷奶仔豬陽性率為16.5% (23/139)、后備母豬陽性率為43. 3% (61/141)、經產母豬陽性率為85. 6% (107/125)、育肥豬陽性率為51.0% (49/96)。從這些數字中可以看出，豬的血清樣品大多數存在PCV-2抗體，不同豬群相同年齡段的陽性率不同，不同年齡段的陽性比率也有不同。王忠田、楊漢春等(王忠田，2001)用PCR方法對我國北京、天津、河北、山東、山西、廣東等地的12個規模化豬場發病豬群進行PCV-2感染的流行病學調查發現，我國的PCV-2感染情況相當嚴重。加上繼發感染和混合感染的因素，給我國養豬業帶來了很大的經濟損失。Gagnon CA等人于2006年夏天在加拿大一家發生PMWS的豬場中發現一株PCV-2 的變異株，其直接的臨床表現就是，豬場豬群的死亡率比一股發生PMWS豬場的死亡率要高許多。同時在美國的豬場中無論是否發生PMWS也都發現這種PCV-2變異株，這種變異株被命名為PCV-2b，而先前發現的未變異株則被命名為PCV-2a。這種變異株的感染在世界范圍呈蔓延趨勢，在許多國家的豬場中都有分離的報道，我國也有很多學者對PCV-2基因亞型進行了研究和報道，張建武等人(張建武，2009)在2007年針對中國部分地區豬內臟樣本進行PCV-2的分子流行病學調查，發現中國地區PCV-2感染已經比較普遍，發病豬場的感染率高于正常豬場，且近兩年的PCV-2陽性率明顯高于高于前年的陽性率，表明PCV-2的感染呈上升趨勢，值得我們關注。但是傳統分型鑒定采用的是測序方法，其有一定的局限性，對同一豬體PCV-2不同亞型的混合感染無法判定，且費時、費力，所以應當建立一種快速、方便、 直觀的熒光PCR檢測方法，既可以達到檢測目的，又可以達到基因分型的目的。

發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒及方法，所述的這種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒及方法能夠快速的檢測豬圓環病毒2型和分型， 而且特異性強、敏感性高、成本低。本發明提供了一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，含有(1)、熒光PCR反應液，所述的熒光PCR反應液中含有特異性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；(2)、針對PCV-加型的TaqMan特異性探針a，探針a的序列如SEQ ID NO 5所示， 在探針a的5’設計有熒光物質，在探針a的3’設計有帶有淬滅物質；(3)、針對PCV-沘型的TaqMan特異性探針b，探針b的序列如SEQ ID NO 6所示， 在探針b的5’設計有熒光物質，在探針b的3’設計有帶有淬滅物質；(4)、熱啟動Taq酶和酶保護劑；(5)、PCV-2a型和PCV_2b型質粒DNA陽性對照。進一步的，所述的特異性引物的濃度為0.32μΜ。進一步的，所述的探針a和b的濃度均為10 μ Μ。進一步的，所述的熒光PCR反應液含有濃度均為0. 24mM的dATP、dTTP、dGTP和 dCTP，還含有濃度為2. 4mM的Mg2+。進一步的，所述的熱啟動Taq酶的濃度為lU/uL，所述的酶保護劑的濃度為0. 2U/
uLo進一步的，在探針a的5’設計有FAM熒光物質，在探針a的3’設計有帶有BHQ淬滅物質。進一步的，在探針b的5’設計有HEX熒光物質，在探針b的3’設計有帶有BHQ淬滅物質。本發明還提供了一種用于檢測豬圓環病毒2型和分型的特異性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示。本發明還提供了一種用于檢測豬圓環病毒加型的TaqMan特異性探針，其堿基序列如SEQ ID NO 5所示。本發明還提供了一種用于檢測豬圓環病毒2b型的TaqMan特異性探針，其堿基序列如SEQ ID NO 6所示。本發明還提供了采用上述的試劑盒檢測豬圓環病毒2型和分型的方法，包括以下步驟(1)待檢樣本的DNA提取；(2)熒光PCR檢測按照擴增對象數量，取熒光PCR反應液、探針、熱啟動Taq酶混于一離心管中，震蕩，分裝，蓋上管蓋備用；將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的 DNA加入對應反應管中，最后取陽性對照加入一反應管中，各反應管標記后離心，取出置熒光PCR儀中；(3)結果判定反應液測定Ct值均大于35或無數值的標本為陰性；FAM通道測定 Ct ^ 30的標本為A型標本；HEX/VIC通道測定Ct ^ 30的標本為B型標本；測定30 < Ct < 35的標本建議復測，復測結果Ct < 35為陽性，復測結果Ct >= 35的為陰性。進一步的，熒光PCR擴增條件為95°C預變性:3min ；按以下參數循環40次95°C變性 15sec、58°C采集熒光 40sec。PCV-2可分為PCV-加和PCV-沘兩個亞型，其中PCV-加為176^p，登錄號為 AB072302-JAPAN-2009，其全基因序列如 SEQ ID NO 1 所示，PCV_2b 為 1767bp，登錄號為 DQ141322-CHINA-2005，其全基因序列如 SEQ ID NO :2 所示。根據PCV-加和PCV_2b基因序列設計一對特異性引物如下
上游引物Cl :5，-CCA，GAA，TTC，AAC，YTT，AAC，CTT，YCT，TAT-3，；下游弓丨物C2 :5，-GRC，RGT，GGA，CAT, GMT，GAG，A-3，；其作用是能夠特異性同時擴增兩種亞型的DNA片段，并且其DNA片段包含兩種亞型的變異區。根據PCV-加和PCV_2b基因序列的變異區設計兩個探針，其序列如下a FAM-AGG, GTA, TAG, AGA, TTT，TGT，TGG，TCC, CCC, CTC-BHQb HEX-CAA，ACC，CCC，kCw, CTG，TGC，CCT，TTG，A-BHQ ；其作用是a與PCV-加的變異區特異性結合，在PCR擴增中釋放FAM熒光信號；b 與PCV-2b的變異區特異性結合，在PCR擴增中釋放HEX熒光信號，當熒光PCR儀通過相應的通道采集熒光時，就可以特異性觀察到兩種擴增曲線，既達到檢測PCV-2的目的，同時也達到分型的目的。本試劑盒熒光PCR反應條件的優化過程為(1)、引物濃度的優化設置引物終濃度范圍為50 ΙΟΟΟρΜ，用不同濃度梯度的引物進行熒光PCR試驗， 結果表明此濃度范圍的引物都可以擴增S型曲線，并且當每條引物終濃度為270pM時效果最佳。O) Mg2+濃度的優化設置Mg2+終濃度范圍為1. 5 5. OmM,結果表明此濃度范圍內的Mg2+均能擴增出 S型曲線，并且當Mg2+終濃度為2. 88mM時，擴增效果最好。(3) dNTPs濃度的優化四種dNIPs等當量混合，設置每種dNIPs終濃度范圍為0. 1 ImM，結果表明此濃度范圍內的dNIPs均能擴增出曲線，并且每種dNIPs終濃度以0. 288mM,即總dNIPs終濃度為1. 152mM時為最佳。(4)探針濃度的優化設置探針終濃度范圍為0. 05 1 μ Μ，用不同濃度梯度的探針進行熒光PCR試驗， 結果表明此濃度范圍的引物都可以擴增S型曲線，并且當每條探針終濃度以0. 2 μ M時效果最佳。(4)退火溫度的篩選根據所采用的PCR引物和探針，運用公式T = 2(A+T)+4(G+C)計算退火溫度，再按照實際情況，確定PCR反應的中限溫度是59°C，溫度范圍是56 66°C，結果表明該范圍溫度下均能擴增出S型曲線，當退火溫度為58°C，PCR擴增出的曲線效果最佳。因此，選擇 58°C作為熒光PCR敏感性和特異性試驗的退火溫度。(5)熱啟動Taq酶和酶保護劑濃度的優化設置熱啟動Taq酶和酶保護劑終濃度范圍為0. 001 0. IU/μ L，用不同濃度梯度的熱啟動Taq酶和酶保護劑進行熒光PCR試驗，結果表明此濃度范圍的熱啟動Taq酶和酶保護劑都可以擴增S型曲線，并且當熱啟動Taq酶和酶保護劑濃度為以0. 067U/ μ L時效果最佳。本發明和已有技術相比，其技術進步是顯而易見的。本發明的試劑制備簡單、方法簡便快捷、特異性強、敏感性高、結果判斷容易，對兩種亞型的混合感染具有鑒別診斷作用。


圖1是TaqMAN熒光探針法檢測PCV_2的原理圖之一，顯示了 TaqMAN探針一端連接發光基團，一端連接淬滅基團，并且連接的DNA鏈能夠與特異性DNA目的片段結合。圖2是TaqMAN熒光探針法檢測PCV_2的原理圖之二，顯示了一對特異性引物在 TaqDNA聚合酶作用下一方面進行DNA片段的合成，當到達探針結合位置時，它同時發揮限制性酶切作用，將探針中連接發光基團和淬滅基團的DNA鏈切斷，釋放發光基團。圖3是TaqMAN熒光探針法檢測PCV-2的原理圖之三，顯示了發光基團游離在反應體系中時，受到激發就可以發出熒光，并被儀器收集到，形成擴增曲線，達到檢測目的。圖4是熒光PCR圖，其中呈S型的曲線分別為PCV_2a和PCV_2b的DNA樣本，其余樣本均為陰性，表明該試劑盒特異性好。圖5是熒光PCR圖，其中，3條呈S型曲線的樣本為PCV_2a陽性質粒，其質粒大腸桿菌濃度分別為 6. 25X 105f/mL、6. 25 X IO4 個/mL、6. 25 X IO3 個/mL，當樣本中 PCV_2a 陽性質粒大腸桿菌濃度為6. 25 X IO3個/mL時，熒光PCR在FAM通道可觀察明顯的S型曲線。圖6是熒光PCR圖，其中，3條呈S型曲線的樣本為PCV_2b陽性質粒，其質粒大腸桿菌濃度分別為3. 14X105個/mL、3. 14X IO4個/mL、3. 14X IO3個/mL，當樣本中PCV_2b陽性質粒大腸桿菌濃度為3. 14X103個/mL時，熒光PCR在VIC通道可觀察明顯的S型曲線。圖7是熒光PCR圖，其中，在_20°C儲存時間分別為30d, 60d, 90d, 120d, 150d, 180d 的試劑盒對PCV_2a陽性樣本進行檢測，結果表明本試劑盒穩定性良好。圖8是熒光PCR圖，其中，在_20°C儲存時間分別為30d, 60d, 90d, 120d, 150d, 180d 的試劑盒對PCV-2b陽性樣本進行檢測，結果表明本試劑盒穩定性良好。圖9、圖10和圖11是3份PCV-加和7份PCV_2b陽性樣本用本試劑盒重復試驗三次的熒光PCR圖，結果均能擴增出S型曲線，顯示試劑盒的穩定性。圖12是采用-20°C保存1 12個月的試劑盒檢測PCV-加的熒光PCR圖。圖13是采用-20°C保存1 12個月的試劑盒檢測PCV_2b的熒光PCR圖。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述發明，而不是以任何方式限制發明，在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的待批權利范圍之內。實施例1試劑盒組成熒光PCR反應液2管(25 4 17反應\100)，其中的(^1 、(1111\( ^13和(1013終濃度為0. 24mM、Mg2+終濃度為2. 4mM，引物C1、C2終濃度為0. 32 μ Μ,探針a、b混合物1管O μ L/ 反應X 100)，濃度都為5 μ Μ,熱啟動Taq酶和酶保護劑混合物1管O μ L/反應X 100)， 其中熱啟動Taq酶濃度為IU/ μ L，酶保護劑濃度為0. 2U/ μ L，陽性質粒對照a和b各1管 (250 μ L/管)，陰性質粒對照1管(250 μ L/管)。本試劑盒采用30 μ L反應體系，反應液組成為熒光PCR反應液為25 μ L、酶2 μ L、 探針混合物IyL及模板2 μ L。實施例2豬圓環病毒2型二重熒光PCR檢測試劑盒的使用方法
1、樣本處理請自行提取DNA，陽性對照無需提取，直接加樣。2、熒光PCR的檢測(1)按照檢測樣品數n(n =待檢樣品數+2)取PCR反應液、熱啟動Taq酶和探針混于一離心管中，于渦旋振蕩器上振蕩，按每管分裝，蓋上管蓋備用。(2)現將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的DNA加入對應反應管中；最后取出陽性對照加入另一反應管中，各反應管標記后離心，取出置熒光PCR儀中。(3)熒光PCR反應條件94°C預變性:3min，按以下參數循環40次94°C變性15sec、 58°C采集熒光40sec。58°C時熒光檢測，檢測通道FAM，VIC/HEX。3、質控標準(1)陰性對照的Ct值應等于none。(2)陽性對照的Ct值應<30，否則，此實驗視為無效。(Ct值應以S型曲線拐點的循環數為準)(3)應該同時滿足上述2項條件，否則試驗無效。4、結果判定(I)Ct值> 35或無數值的標本為陰性。(2) FAM通道Ct值≤30的標本為a型標本。(3)HEX/VIC通道Ct值≤30的標本為b型標本。(4)30 < Ct值< 35的樣本建議重做。重做結果Ct值為none為陰性，否則為陽性。實施例3試劑盒特異性試驗取豬圓環病毒1型毒株、豬偽狂犬毒株、豬細小病毒、PK-15細胞等4個對照樣本的DNA各2 μ L為模板進行試劑盒的特異PCR擴增，同時設陰性對照組。PCR擴增條件95°C預變性3min，按以下參數循環40次95°C變性15sec、58°C采集熒光40sec。熒光PCR結果表明僅PCV-加和PCV_2b的DNA擴增出曲線，而作為對照樣本的豬圓環病毒1型毒株、豬偽狂犬毒株、豬細小病毒、PK-15細胞的DNA均無此擴增曲線出現(見圖4)。實施例4試劑盒敏感性試驗將計數后的PCV_2a和PCV_2b陽性質粒大腸桿菌進行10倍梯度稀釋， PCV-2a(625X 106)和 PCV-2b(3. 14X107)都按 1 IO1,1 IO2,1 IO3,1 IO4,1 IO5 進行稀釋，抽提DNA。從每個梯度DNA中各取2μ L模板用熒光PCR試劑盒進行檢測。擴增條件同上，同時設陰性對照。通過6個濃度梯度的PCV-加和PCV-2b質粒DNA的熒光PCR 反應，結果表明當樣本中PCV-加陽性質粒大腸桿菌濃度為6. 25X IO3個/mL時，熒光PCR 在FAM通道可觀察明顯的S型曲線(見圖5)；當樣本中PCV-2b陽性質粒大腸桿菌濃度為 3. 14X IO3AiL時，熒光PCR在VIC通道可觀察到明顯的S型曲線(見圖6)。實施例5試劑盒的穩定性和重復性試驗試劑盒內所用試劑均在_20°C儲存，儲存時間為30d，60d，90d，120d, 150d, 180d時取出，用已知PCR陽性樣本檢測試劑盒的穩定性。此外，PCV-2a和PCV-2bPCR陽性樣本各15份用本試劑盒進行重復性實驗3次；15份PCR陰性樣本用本試劑盒進行重復性實驗3次。 擴增條件同上，并記錄結果。結果表明在30，60，90，120，150，180d各時段分別取出試劑盒， 用PCV-2a和PCV-2bPCR陽性質粒進行熒光PCR檢測，均能擴增出曲線，且無非特異性曲線， 陰性對照均為陰性(見圖7和圖8)。3份PCV-加和7份PCV-2b陽性樣本用本試劑盒重復試驗三次，結果均能擴增出S型曲線(見圖9、10、11)。實施例6試劑盒的保存期試驗將在-20°C分別保存1 12個月的試劑盒對已知樣品進行檢測。擴增條件同上。 結果表明本試劑盒均在-20°C下可以長期保存，在試驗的12個月內均能擴增出S型曲線，陰性對照均為陰性(見圖12和圖13)。實施例7普通PCR方法的對比采集了上海及周邊地區豬臨床內臟樣本共101份，編號后放入4°C冰箱待檢。(一)、樣本的前處理1、將采集的豬內臟樣本剪取心、肝、脾、肺及淋巴結共5克左右放入研缽中，加入 PBS液進行研磨，取上清，4°C保存備用；2、樣本DNA的提取(參考AXYGEN公司Axyft^p體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書)(1)取研磨的豬內臟樣本上清200μ L，加入DNA裂解液Buffer V_L，渦旋震蕩混合均勻，靜置5min。(2)加 75 μ L Buffer V-N,渦旋振蕩混合均勻，12000 Xg 離心 5min。(3)將上清轉移到新的2ml離心管中，加300 μ L異丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置 6 8次，混合均勻。(4)將制備管置于2ml離心管中，取步驟3中混合液移入制備管中，6000 X g離心 lmin。(5)棄濾液，將制備管置回到于2ml離心管中，加SOOyLBufferWlA，室溫靜置 lmin。12000Xg 離心 lmin。(6)棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，加800 μ L Buffer W2，12000 Xg離心 lmin。(7)將制備管置回至IJ 2ml離心管中，12000 Xg離心lmin。(8)將制備管置于潔凈的1. 5ml離心管中，在制備管膜中央加40 60 μ LBuffer TE，室溫靜置lmin，室溫靜置lmin。12000 Xg離心Imin洗脫DNA，-20°C保存備用。(二)普通PCR方法檢測參考張建武等的方法(張建武，莊金山，劉長龍.2007年中國部分地區豬圓環病毒2型分子流行病學分析[J]中國農業科學，2009,42(8) =2949-2957)合成上下游引物 PCF1096/PCR1588。(1)組織樣品中PCR的擴增PCV-2檢測的PCR反應體系如下PCV_2檢測用的上下游引物PCF1096/ PCR1588 (IOymol · L-1)各 1 μ L, IOXBuffer 2μ L,2. 5mmol · L-IdNTP 2 μ L，rTaqDNA 聚合酶5U，加入2 μ L提取的病毒核酸，加入滅菌雙蒸水至25 μ L，PCR循環條件為94°C 5min ； 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，40循環，72°C IOmin0當PCR結束后在的瓊脂糖膠上進行電泳，EB染色后，在紫外燈下成像。(2)組織樣品中PCV-20RF2的克隆及鑒定在紫外燈下將上述PCR的目的條帶取出，按照DNA膠回收試劑盒的步驟進行回收， 取回收產物與PBS-T載體連接，連接反應體系為回收的PCR產物7 μ L，IOX連接Buffer IuL, pBS-T載體lyL，T4DNA連接酶1 μ L，4°C連接過夜，然后轉化T0P10感受態菌，在 IPTG、X-gal誘導下37°C培養12 16h，挑取白斑菌落接種LB液體培養基培養過夜后提取質粒，選取大小陽性的質粒用限制性內切酶)(bal I和HindIII進行陽性重組子的雙酶切鑒定。(3)血清或組織樣品中PCV-20RF2的核苷酸序列的測定與分型取上述經雙酶切鑒定的陽性重組質粒送hvitrogen公司進行序列測定，并連同已發表的PCV-2 0RF2的核苷酸序列進行比對，確定其基因亞型。(三)熒光PCR方法檢測(1)按照檢測樣品數n(n =待檢樣品數+2)取PCR反應液、熱啟動Taq酶和探針混于一離心管中，于渦旋振蕩器上振蕩，按每管分裝，蓋上管蓋備用。(2)現將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的DNA加入對應反應管中；最后取出陽性對照加入另一反應管中，各反應管標記后離心，取出置熒光PCR儀中。(3)熒光PCR反應條件94°C預變性:3min，按以下參數循環40次94°C變性15sec、 60°C采集熒光40sec。60°C時熒光檢測，檢測通道FAM，VIC/HEX。(四)檢測結果同時用普通PCR方法和熒光PCR方法對上海及周邊地區101份豬臨床內臟樣本進行PCV-2基因型檢測，結果見表1。表1.普通PCR方法和熒光PCR方法對豬臨床內臟樣本進行PCV-2基因型檢測結果的比較
權利要求
1.一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于它含有(1)、熒光PCR反應液，所述的熒光PCR反應液中含有特異性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；(2)、針對PCV-加型的TaqMan特異性探針a，探針a的序列如SEQID NO 5所示，在探針a的5’設計有熒光物質，在探針a的3’設計有帶有淬滅物質；(3)、針對PCV_2b型的TaqMan特異性探針b，探針b的序列如SEQID NO 6所示，在探針b的5’設計有熒光物質，在探針b的3’設計有帶有淬滅物質；(4)、熱啟動Taq酶和酶保護劑；(5)、PCV-2a型和PCV-2b型質粒DNA陽性對照。
2.根據權利要求1所述的一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物的濃度為0. 32μΜ。
3.根據權利要求1所述的一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的探針a和b的濃度均為ΙΟμΜ。
4.根據權利要求1所述的一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的熒光PCR反應液含有濃度均為0. 24mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，還含有濃度為2. 4mM 的 Mg2+。
5.根據權利要求1所述的一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的熱啟動Taq酶的終濃度為lU/uL，所述的酶保護劑的終濃度為0. 2U/uL。
6.根據權利要求1所述的一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于在探針a的5’設計有FAM熒光物質，在探針a的3’設計有帶有BHQ淬滅物質。
7.根據權利要求1所述的一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于在探針b的5’設計有HEX熒光物質，在探針b的3’設計有帶有BHQ淬滅物質。
8.一種用于檢測豬圓環病毒2型和分型的特異性引物，其特征在于其上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示。
9.一種用于檢測豬圓環病毒加型的TaqMan特異性探針，其特征在于其堿基序列如 SEQ ID NO 5 所示。
10.一種用于檢測豬圓環病毒2b型的TaqMan特異性探針，其特征在于其堿基序列如 SEQ ID NO 6 所示。
11.采用權利要求1所述的試劑盒檢測豬圓環病毒2型和分型的方法，其特征在于包括以下步驟(1)待檢樣本的DNA提取；(2)熒光PCR檢測按照擴增對象數量，取熒光PCR反應液、探針、熱啟動Taq酶混于一離心管中，震蕩，分裝，蓋上管蓋備用；將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的DNA加入對應反應管中，最后取陽性對照加入一反應管中，各反應管標記后離心，取出置熒光PCR 儀中；(3)結果判定反應液測定Ct值均大于35或無數值的標本為陰性；FAM通道測定 Ct ^ 30的標本為A型標本；HEX/VIC通道測定Ct ^ 30的標本為B型標本；測定30 < Ct < 35的標本建議復測，復測結果Ct < 35為陽性，復測結果Ct >= 35的為陰性。
12.如權利要求11所述的檢測豬圓環病毒2型和分型的方法，其特征在于熒光PCR擴增條件為95°C預變性:3min ；按以下參數循環40次95°C變性15seC、58°C采集熒光40sec。
全文摘要
本發明提供了一種檢測豬圓環病毒2型和分型的試劑盒，屬于生物檢測領域，解決了檢測豬圓環病毒2型和分型方法程序復雜，周期長的技術問題。本發明的試劑盒中含有熒光PCR反應液，反應液中含有特異性引物，其中上游引物的序列如SEQIDNO3所示，下游引物的序列如SEQIDNO4所示，還含有針對PCV-2a型的TaqMan特異性探針a和針對PCV-2b型的TaqMan特異性探針b。本發明還提供了采用上述的試劑盒檢測豬圓環病毒2型和分型的方法。本發明的二重熒光PCR檢測試劑盒可以快速準確地檢測PCV-2，同時能夠進行其亞型的鑒定，適用于PCV-2快速診斷、流行病學調查、風險評估及基因型分析。
文檔編號G01N21/64GK102206715SQ20111010318
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月22日 優先權日2011年4月22日
發明者劉佩紅, 劉健, 周錦萍, 張維誼, 王建, 葛菲菲, 鞠厚斌 申請人:上海市動物疫病預防控制中心