專利名稱：豬圓環病毒2型elisa抗原檢測試劑盒及其制備方法和其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒及其制備方法和其應用。
背景技術：
豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引發斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。除了引發 PMWS外，PCV2還與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征(PDNS)、母豬繁殖障礙等疾病相關。自1996年在加拿大首次發現PMWS以來，PCV2感染引起的相關疾病已經在全世界廣泛存在。截止目前，我國養豬業受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2 抗原檢測試劑盒的臨床需求日益迫切。
目前，國內外采用的PCV2檢測方法主要包括病毒分離培養、間接免疫熒光、免疫酶單層實驗(MPA)、原位雜交(ISH)、聚合酶鏈式反應(PCR)等。盡管這些方法可以檢測 PCV2，但存在使用不便，操作繁瑣，耗時長，不易普及等缺陷。
CN102183650A公開了一種豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒，該試劑盒采用雙單抗結合技術檢測PCV2抗體。
CN1584597A公開了一種豬圓環病毒2型抗原或抗體ELISA檢測試劑盒，其中，所述的抗原檢測試劑盒使用雙單抗夾心法，包被的抗體為原核表達的蛋白制備所得，并僅能依靠檢測孔的深淺來判斷強陽性、陽性、弱陽性和陰性等定性檢測結果。該文獻公開的試劑盒至今還沒有市場化，分析原因可能是試劑盒的特異性或敏感性不能滿足市場檢測的需要。 為此，急需研究一種能夠高效、定量檢測PCV2的方法。
CN201110440750. 7公開了一種豬圓環病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應用，該申請公開的內容全文作為本申請的參考。發明內容
本發明的目的在于提供一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒 (VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液為3，3’-5，5’-四甲基聯苯胺溶液，所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。
本發明的優選技術方案中，所述的包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板孔包被的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體為由純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)作為抗原免疫實驗兔后純化血清所得，所 述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的包被量為O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀釋液為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的pH9. 6。
本發明的優選技術方案中，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3。
本發明的優選技術方案中，所述封閉液選自質量濃度為1-10%的BSA、質量濃度為 1-10%的脫脂牛奶的任一種或其組合。
本發明的優選技術方案中，所述樣品稀釋液由質量濃度為O. 1-10%牛血清白蛋白 (BSA)和含有O. 01-0. 05%NaN3的磷酸鹽緩沖液(PBS)組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為 O. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4。
本發明的優選技術方案中，所述濃縮洗滌液為含有O. 5v/v%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為O. lmol/L, pH7. 2-7. 4。
本發明的優選技術方案中，所述的酶底物A溶液為10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液為含有O. 012% (質量濃度)雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. O。
本發明的優選技術方案中，所述終止液為lmol/L H2SO4溶液。
本發明的優選技術方案中，所述樣品稀釋液的配制為配制PH7.2-7.4、濃度為O. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入BSA和NaN3,使其濃度分別為O. 1_10%BSA和 0. 01-0. 05%NaN3,即得。
本發明的優選技術方案中，所述濃縮洗滌液的配制為在0. lmol/L PBS溶液中加入吐溫-20 (Tween-20)，使得吐溫-20的濃度為0. 5v/v%。
本發明的優選技術方案中，所述的酶底物A溶液為10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)溶液，其配制為稱取IOOmg TMB，將其加入到IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。
本發明的優選技術方案中，所述的酶底物B溶液為0. 012%雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. 0，其配制為稱取IOg乙酸鈉，溶于IL純化水，用乙酸調PH5. O,再加入400 μ I濃度為30%Η202，即得。
本發明的優選技術方案中，所述顯色液用酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得。
本發明的優選技術方案中，所述的試劑盒中還含有抗原標準品和陰性對照液，其中抗原標準品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2-Cap蛋白，將其配制至lug/ml而得；所述的陰性對照液用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清配制而成。
本發明的優選技術方案中，所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法包括如下步驟
(I)獲得本發明所述的重組桿狀病毒轉移載體pFastBac Dual_20RF2 ；
(2)同源重組，產生重組桿狀病毒DNA ；
(3)包裝，產生表達PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒；
(4)獲得本發明制備的重組桿狀病毒；
(5)培養宿主細胞，接種步驟(4)的重組桿狀病毒；
(6)滅活病毒；
(7)分離純化重組PCV2Cap蛋白。
在本發明的一個優選技術方案中，所述重組桿狀病毒轉移載體是分別在PFastBacDual轉移載體的PlO啟動子和Ppolh啟動子(多角體蛋白啟動子)之后各插入一個拷貝的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2。
在本發明的一個優選技術方案中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、 未經修飾的PCV2b 0RF2。
在本發明的一個優選技術方案中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本發明的一個優選技術方案中，所述PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過 BamHI/Hind III 和 Kpn I/Xho I 雙酶切插入 pFastBac Dual 轉移載體中。
在本發明的一個優選技術方案中，所述重組桿狀病毒轉移載體為 pFastBacDual_20RF2。
在本發明的一個優選技術方案中，所述的同源重組是將步驟(I)所述的重組桿狀病毒轉移載體轉化進含穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態細胞DHlOBac中，產生重組桿狀病毒DNA。
在本發明的一個優選技術方案中，所述的包裝是將步驟(2)產生的重組桿狀病毒 DNA感染sf9細胞，包裝出重組桿狀病毒。
在本發明的一個優選技術方案中，所述重組桿狀病毒為rBac_20RF2。
在本發明的一個優選技術方案中，所述的步驟(5)包括利用生物反應器無血清培養基懸浮培養sf9細胞作為宿主細胞，按感染復數(MOI)為O. 001-10的量接種步驟(4)所述的重組桿狀病毒后，繼續培養，使PCV2Cap蛋白在sf9細胞中高效表達。
在本發明的一個優選技術方案中，所述生物反應器的培養參數設定為pH 6. 0-6. 5，溫度25-30°C，溶氧30_80%，攪拌速度50_250rpm，優選所述生物反應器的培養參數設定為PH 6. 2，溫度27°C，溶氧50%，攪拌速度100_180rpm。
在本發明的一個優選技術方案中，所述步驟(5)包括將細胞經過5L-50L培養體積逐級放大培養后，于50L生物反應器培養并接種所述重組桿狀病毒；或者，將細胞經過 5L-50L-500L培養體積逐級放大培養后，于500L生物反應器培養并接種所述重組桿狀病毒。
在本發明的一個優選技術方案中，所述步驟(5)的培養方法選自批式培養方法、分批補料培養方法、半連續灌注培養方法或連續灌注培養方法的任一種或其組合，優選為分批補料培養方法。
在本發明的一個優選技術方案中，所述步驟(6)包括向細胞培養液中加入滅活劑二乙烯亞胺(BEI)滅活所述的重組桿狀病毒，并可選的，在滅活結束后使用硫代硫酸鈉中和過量的BEI。
在本 發明的一個優選技術方案中，所述步驟(7)包括收集步驟(6)滅活后的細胞培養物，通過離心或中空纖維過濾除去細胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的細胞培養上清， 再通過超速離心和CsCl密度梯度離心，獲得純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。
本發明的另一目的在于提供一種利用豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒的檢測方法，包括下述步驟
I)將待檢試樣用樣品稀釋液1:100稀釋，將其加入均勻包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板孔中，每孔加100μ 1，同時設置陽性對照組、陰性對照組和空白對照組，其中，陽性對照組加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀釋的抗原標準品各100 μ 1，陰性對照組加入100 μ I陰性對照液，空白對照組加入100 μ I樣品稀釋液，每個試樣和對照平行加樣2-6個孔；
2)加樣完成后，將酶標板置37°C孵育I小時后，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得；
3)每孔加入100 μ IHRP標記的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體的二抗，37°C孵育I 小時，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得；
4)每孔加入100 μ I顯色液，避光顯色5-10分鐘后，每孔再加入50 μ I終止液，其中，所述的顯色液由酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得；
5)將酶標板置于酶標儀中，在450nm測定其光吸收值0D45(lnm；
6)結果計算與判定
其中，定性結果的判定Cut off (CO值)=陰性對照光吸收值OD45tlnmX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45tol/C0值，其中，樣品值>1為陽性；樣品值彡I為陰性；或者，
定量結果的判定以2為底OD值的對數為X軸，以2為底標準品的稀釋倍數為Y 軸，利用“EXCEL”軟件獲得線性曲線及方程式，將以2為底樣品OD值的對數帶入曲線方程式計算出樣品的濃度。
本發明的另一目的在于提供本發明的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒用于檢測豬群PCV2抗原或PCV2疫苗產品的應用。
本發明的優選技術方案中，所述的PCV2抗原選自豬群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一種。
本發明的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括下述步驟
1)將前述純化的PCV2_Cap蛋白常規免疫實驗兔，當兔血清ELISA效價達到1:1000 以上時,采集兔血清；
2)將步驟I)制得的兔血清經硫酸銨沉淀，純化，制得純化的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體；
3)在步驟2)制得的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體中加入0. 1-10%牛血清白蛋白、0. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20°c保存備用。
本發明的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體的二抗可以商購，或按照本領域的常規方法制備，如參照文獻(曹雪濤，精編免疫學實驗指南[M]. 北京科學出版社，2009;酶標記抗體一 HRP標記抗體原理及方法，戊二醛二步法和過碘酸鈉法，[EB/0L]//www. seekbio. com/biotech/Immunity/2007/2007831543528. html2007-8-3.)公開的方法制備。作為示例，本發明的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗 PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗的制備方法，包括下述步驟
1)將前述純化的PCV2_Cap蛋白常規免疫Balb/c小鼠，當小鼠血清ELISA效價達到1:10000以上時，取脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)以5X107 =IXlO7的比例進行融合；用 HAT選擇性培養基篩選雜交瘤細胞；用ELISA方法和間接免疫熒光(IFA)方法進行陽性雜交瘤細胞的篩選；將篩選到的陽性雜交瘤細胞經三次有限稀釋得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株及抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體；
2)將步驟1)制得的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體經硫酸銨沉淀，純化，制得純化的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體；
3)用改良的過碘酸鈉氧化法對步驟2)制得的純化的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆 抗體進行HRP標記，制得辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二 抗；
4)在辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體的二抗中加入 O. 1-10%牛血清白蛋白、O. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20°C保存 備用。
本發明的濃縮洗滌液為10倍洗滌液，檢測時需加水稀釋10倍，制得洗滌液。
本發明的顯色液用酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶 液為10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基聯苯胺(TMB)溶液；酶底物B溶液為O. 012% (質量濃 度)雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. O。
本發明所述的抗原標準品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2_Cap蛋白至Iug/ ml制成。
本發明所述的陰性對照液用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清 配制而成。
本發明所述的空白對照液為樣品稀釋液。
除非另有說明，本發明涉及液體與液體之間的百分比時，所述的百分比為體積/ 體積百分比；本發明涉及液體與固體之間的百分比時，所述百分比為體積/重量百分比；本 發明涉及固體與液體之間的百分比時，所述百分比為重量/體積百分比；其余為重量/重量 百分比。
與現有技術相比，本發明的試劑盒具有下述有益技術效果
1、經試驗驗證，本發明采用了中國流行的PCV2b亞型的編碼Cap蛋白的基因序列， 針對性地用于檢測和預防中國流行的豬圓環病毒病；
2、本發明所述重組桿狀病毒含有雙啟動子(多角體蛋白啟動子和PlO啟動子)，可 表達雙拷貝的Cap蛋白編碼基因，顯著提高了蛋白的表達效率；并且，插入的外源基因所表 達的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒樣顆粒(VLPs)，保持了病毒抗原的空間構象 結構，提高了表達蛋白的免疫原性，且生產的抗原含量高；
3、本發明的豬圓環病毒2型(PCV2 )ELISA抗原檢測試劑盒采用由形成病毒樣顆粒 (VLPs)的PCV2-Cap蛋白研制的多克隆抗體制備反應板，抗PCV2_Cap蛋白的單抗進行HRP 酶標記后制備二抗，進而組成用雙抗夾心法酶聯免疫吸附實驗檢測豬圓環病毒2型抗原的 試劑盒。本發明的試劑盒除具有ELISA試劑盒的優點外，還克服了抗原空間構象問題所致 的特異性低和二抗問題所致的靈敏度低等缺陷，顯著提高了檢測的特異性和靈敏度。
4、本發明的試劑盒里還配備了抗原標準品，可以檢測到樣品中PCV2_Cap蛋白的 準確含量，特別適合用于PCV2基因亞單位疫苗的定量檢測，最高檢測到抗原標準品的濃度 為 4ng/ml。
5、本發明試劑盒可以定性何定量檢測PCV2，其檢測特異性達100%，靈敏度高達 4ng/ml，可用于豬群PCV2抗原檢測和PCV2疫苗產品的定量檢測。


圖1本發明的重組桿狀病毒轉移載體構建流程圖。
圖2本發明的重組桿狀病毒構建流程圖。
圖3單拷貝、雙拷貝重組bacmid PCR鑒定圖。其中，圖3A是雙拷貝重組bacmid 鑒定結果圖，I是陰性對照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。圖3B是單拷貝重組 bacmid鑒定結果圖，I是陰性對照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。
圖4本發明表達的Cap蛋白形成病毒樣顆粒(VLPs)電鏡圖片。
圖5本發明試劑盒的制備工藝流程圖。
圖6實施例3制得的PCV2_Cap蛋白SDS-PAGE分析圖，其中，M是Marker，I是純 化的PCV2-Cap蛋白。
圖7實施例8中由標準品繪制的標準曲線圖。
具體實施方式
以下將結合實施例具體說明本發明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方 案，并非限定本發明的實質。
實施例1 重組桿狀病毒的構建
使用Bac-to-Bac系統構建重組桿狀病毒，根據GENBANK公布的基因序列(NCBI登 陸號EU340257.1)設計以下引物
PlTCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG
P2 GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
P3 TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG
P4 GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
以PCV2b株病毒0RF2序列為模板(該模板根據已公布的PCV2b 0RF2序列登陸號 EU340257.1合成獲得)，PI, P2擴增PCV20RF2基因，并將該基因克隆入pMD_19T載體中，獲 得重組載體PMD-19T-0RF2-1，以PCV2b株病毒0RF2序列為模板，P3，P4擴增PCV20RF2基 因，并將該基因克隆入PMD-19T載體中，獲得重組載體pMD-19T-0RF2-2。
通過BamH I和Hind III雙酶切pMD_19T-0RF2_l，將0RF2基因克隆入轉移 載體pFastBac Dual中，構建載體pFastBac Dual_0RF2 ；通過Kpn I和Xho I雙酶切 PMD-19T-0RF2-2,將0RF2基因克隆入轉移載體pFastBac Dual_0RF2中，構建包含雙拷 貝0RF2基因的重組轉移載體pFastBac Dual_20RF2，將該重組轉移載體轉化大腸桿菌 DHlOBac，獲得插入雙拷貝0RF2基因的重組質粒bacmid-20RF2 (PUC M13 F/R引物鑒定 bacmid結果見圖3A)，將該重組質粒bacmid_20RF2轉染入昆蟲細胞Sf9中，獲得重組桿狀 病毒rBac-20RF2 (0RF2序列如SEQ ID NO 1所述)，擴增重組桿狀病毒rBac_20RF2作為 種毒備用。將重組轉移載體pFastBac Dual_0RF2轉化大腸桿菌DHlOBac，獲得插入單拷貝 0RF2基因的重組質粒bacmid-0RF2，將該重組質粒bacmid_0RF2轉染入昆蟲細胞Sf9中，獲 得重組桿狀病毒rBac-0RF2(0RF2序列如SEQ ID NO :1所述)，擴增重組桿狀病毒rBac_0RF2 備用(PUC M13F/R引物鑒定bacmid結果見圖3B)。
實施例2 昆蟲細胞的生物反應器無血清懸浮培養及Cap蛋白的表達定量
在IOOOml搖瓶中無菌培養Sf9昆蟲細胞3_4天，待濃度長到3_5X 106cells/ml， 活力大于95%時，將細胞接種到5L的生物反應器中，接種濃度為3-8X105cells/ml。當細胞濃度達到3-5X106cells/ml時，將細胞接種到50L生物反應器中，待細胞長至濃度為 3-5X106cells/ml，接種至Ij 500L生物反應器中，待細胞濃度達到2-8X 106cells/ml時，接種重組病毒rBac-20RF2或rBac_0RF2，感染復數(Μ0Ι)為O. 001-10，反應器培養條件為pH 6. 0-6. 5、溫度25-27°C、溶氧30_80%、攪拌速度100_180rpm。考慮到細胞培養的最適條件， 優選的PH 6. 2、細胞培養階段溫度設定27°C、溶氧50%、攪拌速度100_180rpm。在感染之后繼續培養5-9天后，加入終濃度為5mmol/L的BEI，37°C作用24h后，加lmol/L Na2S2O3至終濃度5mmol/L終止滅活。通過離心或中空纖維過濾的方法收獲細胞培養上清，置2-8°C保存疫苗原液。
制備的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通過ELISA定量檢測。用包被緩沖液稀釋純化的捕獲抗體兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合適濃度，每孔100μ 1，4°C過夜，PBST洗滌三次， 1%BSA封閉I小時。加入不同濃度的抗原標準品(通過CsCl密度梯度離心純化的形成病毒樣顆粒VLPs的Cap蛋白)和梯度稀釋待檢樣品，37°C孵育I小時，PBST洗三次。每孔加入檢測抗體-抗PCV2Cap蛋白的單克隆抗體，37°C孵育I小時，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育I小時，PBST洗三次。TMB顯色10分鐘，2MH2S04終止反應。酶標儀讀數，通過標準曲線計算待檢樣品中Cap蛋白的量。
使用三種不同MOI (O. 01、0. 1、1)接種兩種不同的病毒，分別于接種后7-11天取樣定量分析培養上清中的目的蛋白含量，結果見表I。
表I不同感染復數接種兩種病毒蛋白表達量(μ g/ml)分析
權利要求
1.一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液為3，3’ -5，5’ -四甲基聯苯胺溶液；所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。
2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體為由純化的重組桿狀病毒表達的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)作為抗原免疫實驗兔后純化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的包被量為O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀釋液為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的PH為9. 6。
3.根據權利要求2所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHC03。
4.根據權利要求1-3任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述封閉液選自質量濃度為1-10%的牛血清白蛋白(BSA)或質量濃度為1-10%的脫脂牛奶的任一或其組合。
5.根據權利要求1-4任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述樣品稀釋液由質量濃度為O. 1-10%牛血清白蛋白和含有O. 01-0. 05%疊氮化鈉(NaN3)的磷酸鹽緩沖液組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為O. 01mol/L, pH7. 2-7. 4。
6.根據權利要求1-5任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述濃縮洗滌液為含有O. 5% (v/v)吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為O.lmol/L, ρΗ7· 2-7. 4。
7.根據權利要求1-6任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述的酶底物A溶液選自濃度為10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基聯苯胺溶液；所述的酶底物B溶液含有質量濃度為O. 012%雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為IOmg/ml, pH 為 5. O。
8.根據權利要求1-7任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述終止液為lmol/L的H2SO4溶液。
9.根據權利要求1-8任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，其中，抗原標準品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2-Cap蛋白至lug/ml制成。
10.根據權利要求1-9任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述的試劑盒中還含有陰性對照液，所述的陰性對照液為用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清配制而成。
11.根據權利要求1-10任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，所述重組PCV2-Cap蛋白的制備方法包括如下步驟 Cl)獲得重組桿狀病毒轉移載體PFastBac Dual_20RF2，其中，所述載體是分別在PFastBac Dual轉移載體的PlO啟動子和Ppolh啟動子(多角體蛋白啟動子)之后各插入一個拷貝的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2，優選所述的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、未經修飾的PCV2b 0RF2,更優選所述PCV 2Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過BamHI/Hind III和Kpn I/Xhο I雙酶切插入pFastBac Dual轉移載體中; (2)同源重組，產生重組桿狀病毒DNA； (3)包裝，產生表達PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒； (4)獲得重組桿狀病毒rBac-20RF2； (5)培養宿主細胞，接種步驟(4)的重組桿狀病毒，使其表達Cap蛋白，并自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)； (6)滅活病毒； (7)分離純化重組PCV2Cap蛋白。
12.根據權利要求11所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒，其中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
13.—種利用權利要求1-12任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒的檢測方法，包括下述步驟 1)將待檢試樣用樣品稀釋液1:100稀釋，將其加入均勻包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板孔中，每孔加100μ 1，同時設置陽性對照組、陰性對照組和空白對照組，其中，陽性對照組加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀釋的抗原標準品各100 μ I，陰性對照組加入100 μ I陰性對照液，空白對照組加入100 μ I樣品稀釋液，每個試樣和對照平行加樣2-6個孔； 2)加樣完成后，將酶標板置37°C孵育I小時后，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得； 3)每孔加入100μIHRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗，37°C孵育I小時，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得； 4)每孔加入100μ I顯色液，避光顯色5-10分鐘后，每孔再加入50 μ I終止液，其中，所述的顯色液由酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得； 5)將酶標板置于酶標儀中，在450nm測定其光吸收值OD45tol； 6)結果計算與判定 其中，定性結果的判定Cut off (CO值)=陰性對照光吸收值OD45tlnmX2.1倍，樣品值=樣品光吸收值OD45tlmZCO值，其中，樣品值>1為陽性；樣品值彡I為陰性；或者， 定量結果的判定以2為底OD值的對數為X軸，以2為底標準品的稀釋倍數為Y軸，利用“EXCEL”軟件獲得線性曲線及方程式，將以2為底樣品OD值的對數帶入曲線方程式計算出樣品的濃度。
14.權利要求1-12任一項所述的豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒用于檢測PCV2抗原或PCV2疫苗產品的應用，優選所述的PCV2抗原選自豬群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一種。
全文摘要
本發明涉及一種豬圓環病毒2型ELISA抗原檢測試劑盒及其制備方法和其應用。其中，所述檢測試劑盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標準品、HRP標記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標準品為純化的重組豬圓環病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)。本發明試劑盒的特異性達100%，靈敏度高達4ng/ml，可用于豬群PCV2抗原檢測和PCV2疫苗產品的定量檢測。
文檔編號G01N33/577GK103033622SQ20121035655
公開日2013年4月10日 申請日期2012年9月21日 優先權日2011年12月26日
發明者廖園園, 漆世華, 朱薇, 李建, 秦偉, 王威, 熊媛媛, 張萍, 秦紅剛, 李偉, 謝紅玲, 溫文生, 王楨楨, 靖志強, 吳玉石, 韓興, 劉潔 申請人:武漢中博生物股份有限公司