豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭 AlphaLISA檢測試劑盒及其方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及其方法，其包括供體微珠、受體微珠、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體及帶His標簽的N蛋白抗原。本發明通過優化供體微珠、受體微珠、單克隆抗體、抗原以及血清等試驗反應條件，建立了檢測PRRSV抗體的競爭AlphaLISA檢測方法。利用本發明的試劑盒進行PRRSV抗體的檢測，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響，檢測成本低，檢測時間短。
【專利說明】豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AIphaLISA檢測試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的免疫學檢測，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征病（PRRS)的主要病原。該病主要引起懷孕母豬流產、早產、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙，仔豬和育肥豬呼吸道癥狀，感染豬免疫抑制和亞臨床感染，并對其它致病因子的易感性增加。自1987年美國首次報道了豬繁殖與呼吸綜合征以來，該病呈世界性流行，給養豬業造成巨大損失。我國自1996年首次分離到該病毒以來，已先后在廣東、上海、福建等省暴發和流行，目前該病在我國已普遍存在。現有的檢測方法主要有病毒的分離鑒定、免疫過氧化物酶技術，免疫膠體金技術，免疫熒光抗體染色技術，核酸探針雜交技術（ISH)，ELISA、PCR和real time PCR等，各有優缺，且特異性差異較大。同時，方法對樣品和人員的要求較高。由于豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒或免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均能產生相應的抗體，且抗體能較好的反應其免疫或感染病毒的情況，因此，可以通過檢測PRRSV的抗體來反應其免疫感染病毒情況。
[0003]AlphaLISA技術主要依賴于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用。當生物反應使供體微珠和受體微珠相互接近時，激光激發級聯反應，從而產生極大放大的信號。具體來說，在680nm的激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周圍環境中的氧氣轉化為更為活躍的單體氧。單體氧擴散至受體微珠，產生一系列的化學發光反應，最后將能量傳遞到銪，發射波長為615nm。在生物分子不存在特異的互相作用時，單體氧無法擴散到受體微珠，則不會有信號的產生。AlphaL ISA技術憑借一種專有的基于微珠的技術，將傳統的ELISA轉化為均相的“無需洗滌”的檢測。
[0004]AlphaLISA技術所使用的稀土元素銪（Eu)，發射波長非常尖銳，為615nm，從而大大減少了檢測樣品中雜質的干擾，可直接檢測復雜樣品(血清和體液）中的生物分子。在臨床上，這非常適合測定人和動物的血清和體液樣本。而此技術的高通量、高靈敏度、操作簡便，能更準確、更省時的測定細胞因子等生物標志物。目前，已廣泛用于藥物篩選、細胞因子、病變基因、血清抗體等的檢測。
[0005]中國發明專利（申請號為:201210031802. X,201210047016. 9)分別公開了采用AlphaLISA技術檢測腸道病毒71型衣殼蛋白（Anti-EV71 VPl IgM)和甲型肝炎病IgM的方法。但是，目前尚無利用AlphaLISA技術檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的試劑盒及檢測方法的報道。

【發明內容】

[0006]本發明的第一目的是提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測用試劑盒，第二目的是提供一種用于食品安全檢測的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測方法。
[0007]豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，包括供體微珠、受體微珠、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體及帶His標簽的N蛋白抗原。
[0008]其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PE, ASlOlD (即Nickel chelate Donorbeads (PE, AS101D))，濃度為80 y g/mL, 500 y L ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE, AL105C (即 Anti-mouse IgG Acceptor beads (PE, AL105C))，濃度為 80 u g/mL, 500 u L。
[0009]所述帶His標簽的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010]所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體是針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的特異性抗體。
[0011]前述試劑盒，包括供體微珠80 u g/mL、受體微珠80 u g/mL、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標簽的N蛋白抗原180nM/L。使用時，以總體系20 ii L計，每孔添加量為 ：801^/1^受體微珠31^、801^/1^供體微珠51^、180碰/1帶把8標簽的N蛋白抗原5iiL、100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體5 y L及待測樣本2 ii L。待測樣本可以是血清、體液等。
[0012]具體地，編碼前述帶His標簽的N蛋白抗原的基因為PRRSV N基因，其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 2。
[0013]更具體地，前述PRRSV N基因是通過RT-PCR擴增反應得到的；RT_PCR擴增反應的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
[0014]一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟：
1)反應板的待測孔中每孔加入2y L待測樣本，反應板的對照孔中加入2 y L IX稀釋緩沖液；
2)每孔加入5ii L 180nM/L帶His標簽的N蛋白抗原和5iiL 100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體，1000rpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育Ih;
3)每孔加入80ii g/mL受體微珠3 u L、80 y g/mL供體微珠5 y L, 1000rpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min ；
4)結果讀取：將反應板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測系統中讀值。
[0015]采用上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果：利用本發明的試劑盒進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的檢測，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響。
[0016]本發明的優點是（I)、操作簡單，不需要洗滌；（2)、高特異性：抗原與抗體的特異性結合,均相的反應,所需樣本體積小,僅需2 --L ;(3)、檢測時間短：檢測時間比傳統的ELISA時間短，僅需1.5 h即可完成檢測；（4)、靈敏度高：最低檢測極限比普通ELISA高5~10倍；樣本檢測的檢出率達到96. 7% ; (5)、背景低，抗淬滅能力強：采用長波長激發，短波長發射，不會有來自熒光的背景；且利用時間分辨熒光的檢測模式，進一步降低了背景，確保結果的真實性，615nm的發射波長，非常尖銳，基本沒有來自樣品的淬滅干擾，是進行血清、血漿、體液等復雜樣品檢測的理想選擇；（6)、用途：可用于血清及其相關樣本中豬繁殖與呼吸綜合征抗體的快速檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖I為PRRSV N基因全長的核酸擴增電泳圖；
圖2為PRRSV N蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結果；圖中M-為預染蛋白分子量標準，從上至下分子量依次為 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、IOKD ; I-為未誘導的對照；2_為誘導的全菌液，3-為誘導的上清液，4-為沉淀；2、3、4泳道均為PRRSV N全長1-372，分子量大小約為31 KD，與預期結果一致；
圖3為His-標簽PRRSV N全長蛋白的Western blot鑒定結果；圖中I和2為His標簽的PRRSV N蛋白全長1-372，分子量大小約為31 KD; M為Western blot蛋白分子標準，從上至下分子量依次為 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、IOKD ;
圖4為重組質粒pET-32a-PRRSV N經Xho I、Kpn I雙酶切后電泳圖；圖中1_為pET-32a-PRRSV N進行雙酶切后，2-為空載體，3-為pET-32a_PRRSV N進行雙酶切前，M-為15000DL Marker0
【具體實施方式】
[0018]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0019]以下實施中使用的豬繁殖與呼吸綜合征病毒VR2332株購自美國ATCC，保存于重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心。
實施例`
[0020]一、PRRSV N重組蛋白原核表達質粒的構建及鑒定 I、目的片段擴增
I. I RT-PCR 擴增
以毒株PRRSV VR2332 (GenBank No. :EF536003. I)的基因組為模板，進行反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR)擴增所需目的片段PRRSV N基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
[0021]上下游引物分別引入Kpn I和Xho I酶切位點，引物設計采用Primer Preier5( —種引物設計軟件），引物由寶生物(大連）公司合成，引物序列見表1。
[0022]表1引物序列
【權利要求】
1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于：包括供體微珠、受體微珠、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體及帶His標簽的N蛋白抗原； 其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PEjASIOID ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE, AL105C ； 所述帶His標簽的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有與N蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于：所述供體微珠80y g/mL、受體微珠SOil g/mL、豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標簽的N蛋白抗原180nM/L ； 使用時，以總體系20 ii L計，每孔添加量為：80 u g/mL供體微珠5 y L、80 u g/mL受體微珠3 ii L、180nM/L帶His標簽的N蛋白抗原5 y L、100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體5 u L及待測樣本2 u L0
3.根據權利要求1或2所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于：編碼所述帶His標簽的N蛋白抗原的基因為PRRSV N基因，其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 2。
4.根據權利要求3所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于：所述PRRSV N基因是通過RT-PCR擴增反應得到的；RT_PCR擴增反應的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
5.利用權利要求1或2所述試劑盒進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體競爭AlphaLISA檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟： 1)反應板的待測孔中每孔加入2y L待測樣本，反應板的對照孔中加入2 y L IX稀釋緩沖液； 2)每孔加入5ii L 180nM/L帶His標簽的N蛋白抗原和5iiL 100nM/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體，1000rpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育Ih; 3)每孔加入80ii g/mL受體微珠3 u L、80 y g/mL供體微珠5 y L, 1000rpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min ； 4)結果讀取：將反應板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測系統中讀值。
【文檔編號】G01N33/577GK103487582SQ201310471251
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】聶福平, 王昱, 楊俊 , 向海洋, 王國民, 肖進文 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心