專利名稱：檢測真菌的材料及方法
技術領域：
本項發明涉及用于檢測各種真菌的核酸以及應用該核酸進行的各種真菌的檢測方法。
現有技術作為深部真菌病的主要病原菌包括假絲酵母屬(Candida以下簡稱C.)真菌、曲霉屬真菌(Aspergillus以下簡稱A.)、隱球酵母屬真菌(Cryptococcus.以下簡稱Cr.)等。假絲酵母屬的主要病原菌包括白色假絲酵母、乳酒假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等；隱球酵母屬的主要病原菌包括新型隱球酵母。在與假絲酵母屬同樣重要的病原菌曲霉屬中，有關的病原菌包括煙曲霉、黃色曲霉、黑色曲霉、構巢曲霉、土曲霉等。可望有方法能對這些菌種迅速地檢出、分類并鑒定。
近年來，深部真菌病在免疫功能不全的患者當中感染的機會增多了，但是這些患者多伴有危重的原發疾病，因此，早期明確致病菌并給予恰當的治療是必要的。深部真菌病的診斷以血液培養方法為基本但在檢出率方面還存在問題。至此，用于診斷的抗體已成為商品，但依據抗體進行診斷對免疫功能不全的患者不起作用。基于這種現狀，近年來開發出了直接檢測抗原及其他菌體成分的方法。例如依據甘露聚糖，D-阿拉伯糖醇、葡聚糖等的檢驗而診斷感染的方法。另外，隨著分子生物學的發展，開發出了通過提取結核菌、衣原體等各種病原菌的DNA、即所謂的通過采用PCR方法等檢出核酸而進行診斷的方法。在深部真菌病的方面，也提出了通過檢測核糖體RNA進行診斷的方法(臨床病理、43卷附冊、119頁、1995年)。
發明的公開本發明的目的，旨在提供用于檢測導致深部真菌病的病原菌即曲霉屬真菌的核酸，并提供利用這些核酸而能簡便、迅速、特異并且高敏感度地檢測這些真菌的方法。
發明人，通過對各種真菌癥的病原菌、特別是對曲霉屬真菌的基因進行反復研究，把著眼點放在了存在于線粒體中的能引起各種真菌癥的真菌的細胞色素b基因上，為了對基因進行部分擴增而合成了各種核酸。通過在那些核酸當中查尋能導致真菌的細胞色素b的基因擴增的引物，而發現了序列表中的序列號1-4的核酸。而且通過利用序列號1-4的核酸而對存在于線粒體中的細胞色素b基因進行部分擴增，而成功地解讀了那些序列。發明人以那些序列為基礎進行了反復研究，發現了曲霉屬真菌的各種特異的序列，并以此為基礎設計了不同特異的引物。例如，發現了作為煙曲霉的特異性引物在序列表中的序列號為10、65、68、69，黃曲霉菌的特異性引物的序列號為11、12、66、67，黑色曲霉菌的特異性引物的序列號為13、64、70、71，構巢曲霉菌的特異性引物的序列號為14、63、72、73，土曲菌的特異性引物的序列號為15、62、74、75。
通過提取能簡便、迅速、特異并高度敏感地檢測分類及鑒定曲霉屬真菌的核酸，并據此建立起了應用該核酸的檢驗方法從而完成了本發明。進一步，利用含序列表序列號1及2表示的堿基序列的引物進行改良，并提供序列號為57所示的堿基配對的引物，由此除上述真菌外，使巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholletiae)及卷枝毛霉的檢測成為可能。
總之，本發明提供了用于擴增真菌線粒體細胞色素b基因的引物，它由序列表中序列號57所示的堿基序列(但任意位點的胸腺嘧啶可換為尿嘧啶)或其互補的堿基序列中連續的至少含有10個以上堿基序列的核酸片段所組成。而且本發明還提供了堿基對序列表中序列號3、58-61所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶)或其互補序列中連續的至少由10個以上堿基對的核酸片段所組成的真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用的引物。而且本發明還提供了含有序列表中序列號5、6、7、8、9中各堿基序列(但任意位點的胸腺嘧啶可置換為尿嘧啶)或其互補堿基對序列中連續的10至100個堿基組成的堿基序列的核酸片段各自組成的用于檢測煙曲酶(序列號5)、黃曲霉菌(序列號6)、黑色曲霉(序列號7)、構巢曲霉(序列號8)、土曲霉(序列號9)的核酸。進一步說，本發明提供了至少由10個堿基以上的核酸構成的檢測煙曲霉的核酸，該核酸由序列表中序列號5所示的序列第24位的T、第99位的T、144位的T，252位的C、277位的G、304位的G、312位的A或393位的G作3′末端，至少含有10個堿基以上核酸或在序列號5所示的序列的互補序列的與上述相對應的堿基作3′端。此外，本發明還提供了序列號6的所示的序列第174位的Y作為3′端，至少由10個以上堿基組成的核酸或在序列號6中所示的互補堿基序列中與上面相對應的堿基作3′端，至少由10個堿基以上核酸組成的黃曲霉菌的檢測用核酸。此外，本發明還提供了檢測黑色曲霉用的核酸。此核酸由序列號7所示的堿基序列第42位的A、第69位的C、第126位的C、第207位的A、第213位的A、第246位的A或第396位的G作3′端，至少含10個堿基以上的核酸，或把序列號7所示的與上述堿基相對應的互補堿基當作3′端，至少含10個以上堿基的核酸。本發明還提供了構巢曲霉檢測用核酸。此核酸為由序列號8所示的序列第60位的T、第221位的C、第271位的A、第285位的A、第366位的T及第387位的A為3′端，至少10個堿基以上的核酸或者為與序列號8所示上述堿基相互補的堿基作為3′端，由至少含10個堿基以上核酸組成構巢曲霉檢測用核酸。本發明還提供了土曲霉檢測用核酸。此核酸為序列號9所示的序列第25位的T、第48位的T、第162位的T、第225位的C、第261位的C、第339位的C、第360位的A、第375位的A或第411位的A作為3′末端，含至少10個堿基以上的核酸或者如序列序列號9所示與上述堿基相對應的互補堿基作為3′端，由至少10個堿基以上核酸組成了土曲霉檢測用核酸。另外，本發明還提供了利用基因擴增的方法而擴增曲霉屬真菌的細胞色素b基因片段，從而檢出曲霉屬真菌并進行鑒定的方法，此方法是將序列表中序列號1、2及57所示的堿基序列(但是任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中連續的至少有10個堿基的核酸片段作為正向引物，而將序列號11～15及62～65中所示的堿基序列(任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中互補的堿基序列中至少含有10個堿基的核酸片段中至少任一個的核酸片段作為反向引物。本發明還提供了將序列號66～75中所示的堿基序列(但任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中連續至少10個堿基構成的堿基序列的核酸片段中至少任何一個作為正向，而將序列號3、4、58～61中所示堿基序列(任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中互補的堿基配對中連續的至少由10個堿基構成的堿基序列的核酸片段作為反向引物，利用這些引物通過基因擴增方法而擴增曲霉屬真菌的細胞色素b的基因片段從而提供了對曲霉屬真菌的檢測及鑒定的方法。本發明還通過將序列號1、2及57中所示的堿基序列(任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中連續的至少由10個堿基構成的堿基序列的核酸片段中至少任何一個作為5′端引物，將序列號3、4、58～61的任一個中所示的堿基序列(任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中互補的堿基序列中連續至少由10個堿基構成的堿基序列而成的核酸片段中至少任何一個作為正向引物，利用這些引物通過基因擴增的方法而擴增真菌細胞色素b的基因片段從而提供了真菌的檢測方法。
本發明使分類、鑒定曾很費時的病原真菌現在能被迅速、簡便而且高效地檢出、分類并鑒定。本發明的核酸即可作為擴增反應用的引物，也可作為直接檢測用的探針。而且可用探針和限性制酶檢測通過引物擴增的產物，其敏感度、特異性得到了進一步的提高，其臨床意義很大。
附圖簡述

圖1為應用本發明實施例的各種引物，通過PCR方法將各種真菌的線粒體的細胞色素b的基因進行擴增、將擴增產物走電泳所得到的電泳帶型的模式圖。
圖2為應用本發明其它實施例的各種引物將各種真菌的線粒體的細胞色素b基因應用PCR進行擴增，其擴增產物進行電泳所得的電泳帶型的模式。
圖3為應用本發明的其他的實施例的各種引物將各種真菌的線粒體的細胞色素b基因進行PCR擴增，將擴增產物電泳所得的電泳帶型的模式圖。
圖4為應用本發明其它實施例中的各中引物將各種真菌的線粒體的細胞色素b基因進行PCR擴增，將擴增產物電泳所得的電泳帶型的模式圖。
發明的最佳實施方案將序列號1、2及57的核酸與序列號3、4及58～61的互補配對序列構成的核酸進行組合而選擇出的核酸對作為引物，使之與曲霉屬真菌或假絲酵母屬真菌的線粒體中的細胞色素b基因進行雜交，通過使引物延長反應周期性反復進行，就能夠將真菌類的線粒體的細胞色素b基因片段進行擴增。再者，在這樣的序列中，序列號1、2及4中所記錄的序列，是以構巢曲霉的線粒體的細胞色素b基因序列(Waring，R.B.et al.，細胞27，4-11(1981))為基礎進行設定的。另一方面，含有序列號57、3、58～61中所示堿基序列的核酸為復數(序列號27、3、58～61中的堿基序列用一般式表示)，各序列號中各自所示的核酸可以單獨應用，但將之作為混合物應用將會更好。將這些核酸作為混合物應用的時候，可對曲霉屬真菌以外(土曲霉除外)的真菌、例如土曲霉、假絲酵母屬真菌、毛癬菌屬真菌、小克銀漢霉屬真菌、毛霉屬真菌的線粒體的細胞色素b基因片段進行初步的擴增。再者，含有序列號57、3、58～61中所示的堿基序列的核酸，如果是有至少10個以上連續堿基的核酸，可以作為引物使用。如果有各序列號中所示的全部序列的話將會更好。
應用上述各種核酸作為引物對各種真菌類的多數菌珠的線粒體的細胞色素b基因片段進行擴增，從而測定其堿基序列。擴增后的DNA片段在各自菌種中共同的堿基序列如序列號5～9中所示。序列號5所示由煙曲霉而來，序列號6所示由黃曲霉而來，序列號7所示由黑色曲霉而來，序列8所示由構巢曲霉而來，序列9所示由土曲霉而來的擴增了的DNA片段的序列。將這些擴增的片段為模板就可以利用后面所講的各種真菌不同種類特異的引物進一步地進行核酸擴增。或者用限制性內切酶將這些擴增產物切斷，通過比較那些片段形成的帶型而能檢出引物的延長物(PCR-RFLP)。
而且，含有這些擴增片段的任意連續的10～100個堿基，優選是由15～30個堿基而成的序列的核酸，可以作為上述各個真菌的檢出用核酸。在此，所說的檢出用核酸，包含核酸擴增用的引物及探針，作為探針應用的時候，可以用眾所周知的方法對核酸進行標記。
象下面實施例中具體記載的，發明人對曲霉屬真菌中不同種類的菌株進行了基因擴增，并測定了其堿基序列，通過將那些堿基序列進行深入比較，發現了不同菌株其各自特異的部位。這些特異的部位1個堿基，例如煙曲霉在序列號5所示的序列中第24位的T、第99位的T、144位的T、252位的C、277位的G、304位的G、312位的A、393位的G，黃曲霉在序列號6所示的序列中的第174位的Y，黑曲霉在序列號7所示序列中第42位的A、第69位的C、第126位的C、207位的A、213位的A、246位的A、396位的G，構巢曲霉在序列號8所示的序列中第60位的T、第221位的C、第271位的A、第285位的A、第366位的T、第387位的A，土曲霉在序列號9所示序列中第25位的T、第48位的T、第162位的T、第225位的C、第262位的C、第339位的C、第360位的A、第375位的A、第411位的A分別為不同菌株的特異的堿基部位。這些特異的部位也在序列號5～9中所示的序列的互補序列中作為互補堿基而存在。把這些特異的部位(1個堿基)作為3′端寡核苷酸核酸擴增用的引物，只擴增不同種類的各自線粒體的細胞色素b的基因片段，因此可以將不同菌種特異性地檢出，也就是說，不同菌種的鑒定成為可能。
將含有序列號1、2和/或57中所示堿基序列的核酸(作為正向引物應用)組合起來，如上所述可以作為引物應用的核酸(作為反向引物應用)的序列的實例表示在序列號10～15、62～65中。這些在序列號5～9中所示的序列互補的序列中，上述的任何特異部位作為3′端的寡核苷酸，是至少含有10個堿基以上的核酸。也就是說，含有序列號10及65(都將序列號5第304位的G和相對應的C作為3′端，序列號5的互補鏈)中所示堿基配對序列的核酸作為煙曲霉的檢出用核酸，將含有序列號11及12(全部將與序列號6的第174位的Y(C或者T)相對應的G或A作為3′末端、序列號6的互補鏈)中所示堿基序列的核酸作為黃曲霉的檢出用核酸。將含有序列號13(序列號7的第126位的C相應的G作為3′末端，序列號7的互補鏈)及序列號64(序列號7的第207位的A相對應的T作為3′末端，序列號7的互補鏈)中所示的堿基配對序列的核酸作為黑曲霉的檢出用核酸，將含有序列號14(序列號8的第221位的C相對應的G作為3′末端、序列號8的互補鏈)及序列號63(序列號8的第271位的A相對應的T作為3′末端，序列號8的互補鏈)中所示堿基序列的核酸作為構巢曲霉的檢出用核酸，將含有序列號15(序列號9的第375位的A相應的T作為3′末端，序列號9的互補鏈及序列號62(序列號9的第360位的A相對應的T作為3′末端，序列號9的互補鏈)所示的堿基配對序列的核酸作為土曲霉的檢出用核酸。
另一方面，將含有序列號3、4、58、59、60和/或61中所示堿基序列的核酸(作為反向引物應用)與上述的特異的部位(1個堿基)作為3′端的寡核苷酸作為正向引物相結合，可以設計用于擴增鑒定不同種類真菌的核酸的引物。例如可以從以下的寡核苷酸中進行選擇。諸如煙曲霉的序列號5所示的序列中第24位的T、第99位的T、第144位的T、第252位的C、第277位的G、第304位的G、第312位的A及第393位的G中的任一個堿基作為3′末端的至少含10個堿基以上寡核苷酸中選擇。對于黃曲霉菌可以從序列號6所示的序列中第174位的Y作為3′末端的至少含10個堿基以上的寡核苷酸中選擇。對于黑曲霉可以從序列號7所示的序列中第42位的A，第69位的C、第126位的C、第207位的A、第213位的A、第246位的A及第396位的G中任意一個作為3′端的至少含10個堿基以上的寡核苷酸中進行選擇。對于構巢曲霉可以在序列號8所示的序列中第60位的T、第221位的C、第271位的A、第285位的A、第366位的T及第387位的A中的任何一個作為3′端的至少含10個堿基以上寡核苷酸中選擇。對于土曲霉可以從序列號9所示序列中第25位的T、第48位的T、第162位的T、第225位的C、第261位的C、第339位的C、第360位的A、第375位的A及第411位的A中的任意一個作為3′末端的至少含有10個以上堿基的寡核苷酸中選擇。其中優選用作正向引物的序列是序列號66至75。含有序列號66及67(全部將序列號6的第174位的Y(C或T)作為3′末端)所示堿基序列的核酸作為黃曲霉菌的檢出用核酸。將含有序列號68(序列號5的第304位的G作為3′末端)及序列號69(序列號5的第312位的A作為3′末端)中所示的堿基序列的核酸作為煙曲霉的檢出用核酸。將含有序列號70(序列號7的第126位的C作為3′末端)及序列號71(序列號7的第213位的A作為3′末端)中所示的堿基序列的核酸作為黑曲霉的檢出用核酸，將序列號72(序列號8的第221位的C作為3′末端)及序列號73(序列號8的第285位的A作為3′末端所示堿基序列的核酸作為構巢曲霉的檢出用核酸。將含有序列號74及75所示的堿基序列的核酸作為土曲霉的檢出用核酸(全部將序列號9的第375位的A作為3′末端)。
而且，這些寡核苷酸不僅可以用作引物，當連上適當的標記之后還可以當作不同種類真菌的特異的探針。被當作引物或探針用的上述的核酸，如果從3′末端起有連續10個以上堿基，就可以用于作引物或探針。不過，核酸的堿基數優選為10～100，特別優選是15～30個堿基。而且如果有序列號10-15、62-75中所示序列的全部堿基序列的話將會更優選。
上述本發明的核酸的各序列號中所示的堿基序列中的胸腺嘧啶(T)可以為尿嘧啶(U)。也就是說，本發明的核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩種。而且，本發明的核酸可以是在堿基序列中任意位點的T可作為含有U這樣的尿苷的DNA，同樣任意位點的U可以是含有T這樣胸苷殘基的RNA。進一步講就是各核酸的互補鏈也包含在本發明的范圍之內。因為真菌的DNA有兩條鏈組成，因此各核酸的互補鏈也對于各核酸雜交鏈的互補鏈進行雜交。而且各核酸僅限于上述的用途，當核酸中發生缺失、插入或置換這種點突變及修飾核苷酸存在也沒有問題。這些也包含本發明的范圍之內。
本發明的核酸的獲取方法沒有特別地限定。較好的方法是化學合成。這種方法可以容易、大量且便宜地獲得一定品質的核酸。其化學合成可以根據亞磷酸胺法、磷酸三酯法等常法進行。
本發明的曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定的方法，是以利用上述的曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定核酸為特征建立的方法。該方法是(1)將該核酸作為探針對曲霉屬真菌進行檢出、分類、鑒定的方法；(2)列舉了將該核酸作為引物通過PCR等方法進行延伸反應通過測定引物的延伸物而將曲霉屬真菌進行檢出、分類、鑒定的方法，這些檢出方法所使用的核酸，加入標記物后可作為標記核酸。而且利用標記了的核酸進行檢測曲霉屬真菌將更容易。標記物可選用抗原、半抗原、酶、熒光素、發光物質、酶底物、放射性物質、不溶性載體等。標記在核酸的末端或核酸序列之中都可以。而且標記物可以與核苷酸的糖、磷酸基、堿基的任何部分結合。
本發明將曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定用核酸作為探針或引物對其進行檢測、分類、鑒定的方法列舉如下(1)、(2)。
(1)將本發明的曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定用核酸當作特征應用，將該核酸探針同檢測物進行雜交后，將探針作為指標來檢測樣品中的檢測物。在這種方法中，探針最好應用經標記物標記了的核酸。這種檢出方法的實施，就是將該標記核酸作為探針，使被測樣品中曲霉屬真菌基因同該標記探針進行雜交后，將曲霉屬真菌基因同標記探針的結合物或非結合的標記探針通過適于標記物的適當的檢測方法進行檢出。
檢測物，就是被檢樣品中的曲霉屬真菌基因與探針的雜交物，將檢測物用通常的方法進行預處理、純化而成的物質作為被檢樣品，將此與作為探針的標記核酸相混合，從室溫加熱到70℃，從10分鐘到48小時以處理。而且檢測物質可以提前將本發明的核酸作為引物進行擴增反應。
(2)以本發明的將曲霉屬真菌的檢出用核酸作為引物，通過DNA聚合酶等進行延長反應而實現基因擴增，從而只對曲霉屬真菌的細胞色素b的基因片段進行特異性地擴增，通過檢測擴增產物而實現對曲霉屬真菌的檢出、分類及鑒定。在這種情況下，可以用經前面所講標記物標記過的核酸作為引物應用。在此所用的基因擴增法具體講是指PCR方法，但并不特定僅限于此種方法，將短鏈的寡核苷酸作為引物而用于基因合成的開始的任意的基因擴增法都可應用。本發明曲霉屬真菌的檢測法是通過依據上述方法而擴增了的擴增產物即細胞色素b基因片段的檢出而得以實施。或者將擴增了的細胞色素b的基因片段通過限制性內切酶的剪切而成的片段，將片段形成的帶型進行比較而得以實施。這里用的限制性內切酶可單獨，也可合并應用。擴增了的細胞色素b的基因片段或者經限制性內切酶進一步剪切下的片段的檢出方法并非是特別限定的，可使用普通的基因檢測方法(如電泳法)。擴增產物例如通過電泳所形成的分級分離的特異而且對于檢出非常鮮明的泳帶可以很容易地檢出。當要檢測復數的病原真菌時，將復數的引物混合應用，通過電泳分層而檢測的帶，由于各病原真菌各自的分子量不同，帶的位點也不同，為了實施對各病原真菌的檢測及鑒定而設計不同的引物。引物再次進行擴增反應時，將通過恰當標記物標記過的脫氧核酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)或者核糖核酸(ATP、UTP、GTP、CTP)作為DNA或者RNA的合成原料應用，據此而能使擴增產物高強度地被直接檢測出。或者也可以應用本發明的曲霉屬真菌檢出、分類、鑒定用核酸經過標記后的標記核酸作為引物而可以同樣高敏感度地檢測出擴增產物。此時，用于標記用的物質優選選用放射性物質、熒光物質、發光物質或發光誘導物質。
下面將用一個例子詳細說明本發明的曲霉屬真菌的檢出，分類、鑒定用核酸的應用方法。從被檢物質中提取出核酸，將序列號2的核酸同序列號10～15的核酸的混合物作為引物進行PCR核酸延伸反應，當煙曲霉存在時有323個堿基對長度的的核酸被擴增，當黃曲霉菌存在時有193或194個堿基對長度的核酸被擴增，當黑曲霉存在時有148個堿基對長度的核酸被擴增，當構巢曲霉存在時有244個堿基對長度的核酸被擴增，當土曲霉存在時有397個堿基對長度的核酸被擴增。擴增后的核酸由于其各自不同的分子量通過各種電泳法而可以被分離和檢出，從而可以判定有何種曲霉屬真菌存在。還有將序列號2的核酸同序列號62～65的核酸的混合物作為引物進行PCR等核酸延伸反應，當有煙曲霉存在時有329個堿基對長度的核酸被擴增，當有黃曲霉菌存在時有193或194個堿基對長度的核酸被擴增，當有黑曲霉存在時有231個堿基對長度的核酸被擴增，當有構巢曲霉存在時有294個堿基對長度的核酸被擴增。當有土曲霉存在時有379個堿基對長度的核酸被擴增。將序列號57的核酸(混合物)與序列號62～65的核酸的混合物作為引物進行PCR等核酸延伸反應，當煙曲霉存在時有330個堿基對長度的核酸被擴增，有黃曲霉菌存在時有194或195個堿基對長度的核酸，當有黑曲霉存在時有232個堿基對長度的核酸，當有構巢曲霉存在時有295個堿基對長度的核酸，當有土曲霉存在時有380個堿基對長度的核酸進行擴增。將序列號3、58、59、60和/或61(各序列為混合物)同序列號66～75的核酸的混合物作為引物進行PCR等核酸延伸反應，當有煙曲霉存在時有163個堿基對(依據序列號68)及146個堿基對(依據序列號69)長度的核酸被擴增，當有黃曲霉菌存在時有287個堿基對長度的核酸，當有黑曲霉存在時有337個堿基對(依據序列號70)及245個堿基對(參照序列號71)長度的核酸，當有構巢曲霉存在時有236個堿基對(參照序列號72)及180個堿基對(依據序列號73)長度的核酸，當有土曲霉存在時，有86個堿基對長度(依據序列號74)及83個堿基對長度(依據序列號75)的核酸各自進行擴增。另外，序列號66～75中各包含兩個使各種曲霉屬真菌擴增用的引物，從中各選一個引物，共應用5個正向的引物的混合物能夠將上述的5種曲霉屬真菌同時檢出及鑒定。
本發明用于曲霉屬真菌檢出用的樣品盒的特征是含有對此真菌檢出用核酸或者將此核酸經適當標記物標記過的核酸。本發明的試劑盒可以含有上述的核酸，也可以含有作為其他成分的標記檢出用試劑及緩沖液。試劑盒中的核酸，既可以當作引物用，也可以當作探針用。不管是將核酸當作引物用還是當作探針用，雖然兩者的手段不同，但對于曲霉屬真菌的檢出來說其本質是相同的。當該試劑盒中的核酸作為探針用時可依據上述方法(1)作為曲霉屬真菌的檢出用試劑盒，當該試劑盒中的核酸作為引物應用時，可依據上述方法(2)進行。
如果將試劑盒中的核酸當作探針應用時本發明的試劑盒中，除含有曲霉屬真菌檢出用核酸或標記過的核酸外，還含有標記檢出用的試劑及緩沖液等。當將試劑盒中的核酸當作引物應用的時候，樣品盒中除含有曲霉屬真菌檢出用核酸或標記過的核酸之外，還含有核酸合成酶(如DNA聚合物、RNA聚合酶、逆轉錄酶等)，脫氧核糖核酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、核糖核苷酸(ATP、UTP、GTP、CTP)、限制性內切酶、緩沖液等。而且，本發明的核酸同固相載體結合，可以作為捕捉探針應用。此時，可以將捕捉探針與標記探針合在一起進行。而且也有將核酸進行標記的捕捉方法。此外還有將核酸用生物素標記后進行雜交，用抗生物素蛋白結合載體進行捕捉的方法。對于原位雜交來說，如果將一方用作本發明的核酸，可以對本發明的核酸進行特異的測定，而其他核酸的特異性將會非常低下。
以下將基于本發明的實施例進行更具體的說明，但是本發明并不僅限于下述的實施例。
實施例1(各種DNA的合成)有序列表中序列號為1～4、10～15及57～75中所顯示的序列DNA，是利用商業用委托DNA合成服務而合成的。下面，將序列號1～4、10～15及57～75中所示的各種DNA，分別稱作DNA 1～4、10～15及57～75。
實施例2(煙曲霉的細胞色素b基因擴增反應)將應用ポテトデキストロ-ス液體培養基培養而得的煙曲霉各株(Aspergillus fumigatus IFM 40804、40806、40807、40819、41206、41392、45916、45917、46980、5355)的菌體經75％酒精處理后滅菌，經150g、10分鐘離心獲得菌體，各加入40ml分離用緩沖液(0.9M山梨糖醇、10mM EDTA、10mM Tris鹽酸緩沖液pH7.1)，充分振蕩混勻后經1500g、10分鐘離心后棄上清液，再加入30ml的相同緩沖液，同樣離心后棄上清，再加入9ml的相同緩沖液。另外加入1ml溶在相同緩沖液中的酶解酶(Zymolyase)生化工業(株)制(10 mg/ml)37℃溫育1小時。再加入0.9～1.33mm玻璃珠，渦流混合器處理1～2分鐘以破壞細胞壁。然后經500g，10分鐘離心后取上清，再經20000g 15分鐘離心后得沉淀。將沉淀用分離用緩沖液洗干凈、再次20000g離心15分鐘，就會得到煙曲霉各株的線粒體級分。將得到的線粒體級分中分別加入1mg/ml蛋白酶K 0.5ml，37℃溫育1小時，加入苯酚、氯仿、異戊醇的混合液(25∶24∶1)1ml，振蕩混勻后，經1500g、10分鐘離心后取上層，加入1ml飽和苯酚，振蕩混勻后經1500g、10分鐘離心取上層。再加入0.1ml 3M的醋酸鈉、0.1M氯化鎂，3ml酒精，-20℃放置一夜。然后經20000g、10分鐘離心取沉淀，將沉淀物用-20℃的75％的酒精洗凈，1500g、10分鐘離心后棄上清、得到DNA、干燥后-20℃保存。
以獲得的DNA為模板、將實施例1得到的DNA 1(序列號1)同DNA 3(序列號3)(IFM40804、40819用)或4(IFM 40806、40807、41206、41392、45916、45917、46980、5355)作為引物，使用寶酒造公司的TaKaRa PCR Amplification Kit(Roll)、三洋公司的DNA擴增裝置(MIR-D30)按以下方法進行PCR反應，將細胞色素b基因的一部分進行擴增。
反應液的組成如下×10PCR緩沖液 (試劑盒中所帶) 5μlPCR dNTP混合液 (試劑盒中所帶) 4μlTaq DNA合成酶 (試劑盒中所帶) 1μl(2.5u)DNA11μlDNA 3或41μl線粒體DNA 1μl加水總量至50μl反應條件如下加熱變性94℃1分鐘退火50℃1分鐘延伸反應72℃2分鐘將擴增后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳法分離純化，按以下的方法分析其堿基對序列。
應用PE公司的DNA測序儀(ABI Prism377)根據其操作指南，用ダィタ一シネ一タ一法進行分析。分析堿基序列用的引物選用正向側的DNA2(序列號2)、反向側為DNA3(IFM 40804、40819用)或4(IFM40806、40807、41206、41392、45916、45917、46980、5355)。確定后的堿基序列如序列號16～25所示。
實施例3(黃曲霉細胞色素b基因的擴增反應)采用同實施例2同樣的方法將黃曲霉菌各株(Aspergillus flavusIFM 40603、40800、41087、41933、45909、45910、45911、46870、5364、5366)中細胞色素b基因的一部分進行PCR反應擴增，測定堿基序列。引物包括DNA2和DNA3(IFM41933、45910、5366用)或者4(IFM40603、40800、41087、45909、45911、46870、5364用)。堿基序列分析用正向引物用DNA2、反向引物為DNA 3(IFM41933，45910、5366用)或者4(IFM 40603、40800、41087、45909、45911、46870、5364用)。確定后的堿基序列為序列號26～35所示。
實施例4(黑曲霉的細胞色素b的基因擴增反應)同例2一樣的方法將黑曲霉各株(Aspergillus niger IFM 40606、41398、41399、46897、5367、5368)中的細胞色素b基因的一部分進行擴增。測定其堿基序列。引物用DNA2和DNA3(IFM 41399用)或者4(IFM 40606、41398、46897、5367、5368)。堿基序列分析用引物為正向引物是DNA2，反向引物用DNA3或DNA4。確定后的堿基序列為序列號36～41中所示。
實施例5(構巢曲霉的細胞色素b基因擴增反應)用與實施例2同樣的方法對構巢曲霉各株(Aspergillus niduransIFM 41094、46999、47004、47006、41395)的細胞色素b基因的一部分進行PCR擴增測定其堿基序列。引物應用DNA2和DNA3(IFM47004、47006用)或4(IFM41094、46999、41395用)堿基序列分析用正向引物用DNA2，反向引物用DNA3或DNA4，確定后的堿基序列為序列號42～46所示)。
實施例6(土曲霉的細胞色素b基因擴增反應)同實施例2一樣的方法將土曲霉各株(Aspergillus terreus IFM40851、40852、41092、5372、40850)細胞色素b基因的一部分用RCR反應進行擴增，測定其堿基序列。引物用DNA2和DNA3。堿基序列分析時正向引物用DNA2、反向引物用DNA3。確定后的堿基序列為序列號47～51所示。
實施例7(乳酒假絲酵母的細胞色素b基因擴增反應)同實施例2一樣的方法，用實施例1所得的DNA1和DNA3，通過PCR反應擴增假絲酵母屬(乳酒假絲酵母IFM5773、5800)的細胞色素b的基因的一部分，并測定其堿基序列。作為堿基序列分析正向引物用DNA2，反向引物用DNA3，其堿基序列如序列號52～53所示。
實施例8(熱帶假絲酵母細胞色素b基因擴增反應)
同實施例2一樣的方法，用實施例1所得的DNA1和DNA3，將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis IFM 40018，46816)細胞色素b基因的一段通過PCR反應進行擴增，測定其堿基序列。堿基序列分析正向引物用DNA2，反向引物用DNA3，其堿基序列為序列號54～55所示。
實施例9(深紅色發癬菌的細胞色素b基因擴增反應)同實施例2一樣的方法，用實施例1所得的DNA1和DNA3，將深紅色發癬菌(Trichophyton rubrum IFM 45593)細胞色素b基因的一段通過PCR反應進行擴增測定其堿基序列。序列分析的引物正向為DNA2，反向用DNA3。其堿基配對序列如序列號56所示。
實施例10(對煙曲霉依據PCR方法進行鑒定)使用實施例1的DNA2溶液和DNA10溶液。用寶酒造公司TaKaRaPCR Amplifcation Kit(R011)，三洋的DNA擴增裝置(MIR-D30)，用同實施例2一樣的方法進行PCR反應，擴增煙曲霉的細胞色素b基因的一部分。煙曲霉的DNA通過苯酚提取法獲得。將含有10μl擴增產物的反應液進行1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后經紫外線照射發生熒光(圖1、帶1和2)。電泳條件為電壓75V，時間為45分鐘。反應液中其他分子量標記物也同時泳動，通過比較相對泳動度，算出被檢出的DNA的長度，約323個堿基對。
實施例11(對黃曲霉依據PCR法進行鑒定)使用實施例1和DNA2、DNA11和12(序列號分別為11和12)溶液，采用同實施例10的方法將黃曲霉的細胞色素b基因的一部分用PCR法進行擴增，用電泳法檢出擴增產物(圖1、帶3、4及5)。算出檢出的DNA片段的長度，約193至194個堿基對。
實施例12(黑曲霉的PCR法鑒定)使用實施例1的DNA2溶液及DNA13(序列號13)溶液，用實施例10的方法將黑曲霉的細胞色素b基因的一部分用PCR法進行擴增，將擴增產物用電泳檢出(圖1帶6、7及8)。計算檢出的DNA片段的長度，約148個堿基對。
實施例13(構巢曲霉的PCR法鑒定)使用實施例1的DNA2及DNA14(序列號14)溶液，用實施例10的方法將構巢曲霉的細胞色素b基因的一部分用PCR法擴增，將擴增產物用電泳檢出(圖1、帶9和10)。計算檢出的DNA的長度，約244個堿基對。
實施例14(土曲霉的PCR法鑒定)使用實施例1的DNA2和DNA15(序列號15)溶液，同實施例10一樣的方法將土曲霉的細胞色素b基因的一部分用PCR法進行擴增，計算擴增后的DNA片段的長度，將擴增產物用電泳法檢出，(圖1，帶11和12)，其DNA片段長度約397個堿基對。
上述圖1各帶的菌株具體描述如下帶1 煙曲霉 IFM40819帶2 黃曲霉 IFM40806帶3 黃曲霉 IFM41933帶4 黃曲霉 IFM5366帶5 黃曲霉 IFM45910帶6 黑曲霉 IFM41398帶7 黑曲霉 IFM41399帶8 黑曲霉 IFM46897帶9 構巢曲霉 IFM47004帶10構巢曲霉 IFM41094帶11土曲霉 IFM40850帶12土曲霉 IFM41092帶13大小標記(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500bp)實施例15(巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)色素b基因擴增反應)采用與實施例2 同樣的方法將巴西果小克銀漢霉菌(Cunninghamella bertholletiae IFM 46114)的細胞色素b基因的一部分通過PCR方法進行擴增。測其堿基序列，引物用DNA57和DNA58。堿基序列分析時正向引物用DNA57，反應引物DNA58，確定后的堿基序列為序列號76所示。
實施例16(卷枝毛霉的細胞色素b基因擴增反應)采用與例2同樣的方法將卷枝毛霉(Mueor circinelloides IFM40507)的細胞色素b基因的一部分用PCR反應進行擴增，測定其堿基配對序列。引物用DNA57和DNA60及DNA61。堿基序列分析時正向引物用DNA57，反向引物用DNA60及DNA61，測定后的堿基序列為序列號77所示。
實施例17用同實施例10～14一樣的方法將曲霉屬各菌種用PCR方法進鑒定。所用引物為煙曲霉用DNA57和DNA65，黃曲霉用DNA11及DNA12，黑曲霉用DNA64，構巢曲霉用DNA63，土曲霉用DNA62。電泳結果見圖2，圖2各泳帶所示菌株與圖1一樣。
實施例18采用同實施例10～14一樣的方法將曲霉屬各株用PCR方法進行鑒定。所用引物如下煙曲霉用DNA3和DNA68，黃曲霉菌用DNA66和DNA67，黑曲霉用DNA70，構巢曲霉用DNA72，土曲霉用DNA74。電泳結果見圖3。圖3所示各帶的菌株順序同圖1。
實施例19采用同實施例10～14一樣的方法將曲霉屬各菌株用PCR方法進行鑒定。所用引物如下煙曲霉用DNA58和DNA69，黃曲霉用DNA66和DNA67，黑曲霉用DNA71，構巢曲霉用DNA73，土曲霉用DNA75。電泳結果見圖4，圖4所示各菌株帶如圖1。
產業上利用的可能性本發明能使病原真菌特別是曲霉屬真菌能迅速、簡便地特異而且高度敏感地被檢查出，分類及鑒定。因此對于感染了真菌的患者，能早期明確致病菌并給予恰當的治療。序列表序列號1序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC 20序列號2序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GAGGTGCTAC AGTTATTACT A 21序列號3序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGTATAGMTC TTAAWATAGC 20序列號4序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列AAAATAGCAT AGAAAGGTAA 20序列號5序列的長度425序列的類型核酸鏈數雙鏈拓撲學直鏈假定序列無來源煙曲霉(Aspergillus fumigatus)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號6序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源黃曲霉(Aspergillus flavus)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGAYATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATYGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTWACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTYAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATYGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號7序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源黑曲霉(Aspergillus niger)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAGTTCA TATGAGGWGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AAYCCAATGC AAACTCCACC TGCWATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號8序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源構巢曲霉(Aspergillus nidulans)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTYTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180CACGATACAG TAGGATCAGG KAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420ATTTTA425序列號9序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源土曲霉(Aspergillus terreus)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCWTTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420ATTTTA425序列號10序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列AGGCATGAAG AATACAAATA C 21序列號11序列的長度22序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列TCCTACAGTA TCGTGCATAG CG 22序列號12序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列CCTACAGTAT CGTGCATAGC A 21序列號13序列的長度24序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GCTAATACAA AAGGTAATAA GAAG 24序列號14序列的長度25序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GCAAAAGGTA ATCTATCGTA ATTAG 25序列號15序列的長度24序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列CATTCTGGTA CAATAGCAGG TGGT 24序列號16序列的長度437序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40804序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTTAAGAT CTATACC437序列號17序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40806序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號18序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40807序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號19序列的長度437序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40819序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTTAAGAT CTATACC437序列號20序列的長度425序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM41206序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG 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240TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420ATTKTAAGAT CTMTACC437序列號50序列的長度437序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源土曲霉IFM5372序列TGAGGTGCTA GAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420ATTKTAAGAT CTMTACC437序列號51序列的長度437序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源土曲霉IFM40850序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT 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CATTAATTGG ACAAGATATT 60GTATTATGAT TATGAGGAGG TTTCTCAGTA TCTAACCCTA CAATTCAAAG ATTCTTTGCA 120TTCCATTACT TAGTACCATT TATTATTGCT GCTTGTGTAA TTATGCATTT AATGGCTTTA 180CATACACATG GTTCATCAAA TCCTTTAGGT GTAACAGGTA ATTTAGATAG ATTACCAATG 240CATGGATACT TTATTTTTAA AGATTTAATT ACAGTATTTG TATTCTTAAT TTTCTTCTCA 300TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACATTA GGACATCCTG ATAACTATAT TCCAGGTAAT 360CCATTAGTAA CACCAGCATC AATTGTACCT GAATGATACT TATTACCATT TTATGCTATT 420TTAAGATCTA TACC 434序列號54序列的長度434序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源熱帶假絲酵母IFM40018序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60GTACCATTTA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAGGA ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATA 420TTAAGATCTA TACC 434序列號55序列的長度434序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源熱帶假絲酵母IFM46816序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC WAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60GTACCATTTA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAGGA ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATW 420TTAAGATCTA TACC 434序列號56序列的長度437序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源深紅色發癬菌IFM45593序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATTTATTA AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATTTA 60GTAGAATTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTTTTTTCT 120TTACATTATT TATTACCTTT TATATTAGCT GCTTTAGTTT TAATGCATTT AATAGCATTA 180CATGATACTG TTGGTTCTAG TAATCCTTTA GGTATTTCAG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCTT ACTTTTTATT TAAAGATTTA GTTACTATTT TCTTATTTAT GCTTGGTTTA 300TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGACT GTGAAAATTA TGTAATGGCT 360AATCCTATGC AAACACCAGC TGCTATTGTT CCTGAATGAT ATTTATTACC TTTTTATGCT 420ATATTAAGAT CTATACC437序列號57序列的長度22序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列TGRGGWGCWA CWGTTATTAC TA22序列號58序列的長度22序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGWATAGMWS KTAAWAYAGC ATA 22序列號59序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGTATAGMWS KTAAWAYAGC 20序列號60序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGTATAGMWG TTAAWATAGC 20序列號61序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGTATAGATC TTAAWATAGC 20序列號62序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGTGGTGTTT GCATTGGGTT T 21序列號63序列的長度25序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列CAATAAAGAA TATAAATATA GTTAT 25序列號64序列的長度26序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列TATCGTAATT ACCTGATATT CCTAAT 26序列號65序列的長度27序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列TGCGTTAGGC ATGAAGAATA CAAATAC 27序列號66序列的長度24序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GCATTAGCTT TAATGCATTT AATC24序列號67序列的長度24序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GCATTAGCTT TAATGCATTT AATT24序列號68序列的長度30序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列CTGTATTTAT TTTCTTTATA GTATTATCTG 30序列號69序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列ATAGTATTAT CTGTATTTGT A 21序列號70序列的長度26序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列CATTAAACAG ATTCTTTGCA TTACAC 26序列號71序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GGATCAGGTA ATCCATTAGG A21序列號72序列的長度20序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列AATCCTTTAG GTATTTCAGC 20序列號73序列的長度28序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列ATTTAAAGAT TTAATAACTATATTTATA 28序列號74序列的長度24序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列GTTATGGCAA ACCCAATGCA AACA 24序列號75序列的長度21序列的類型核酸鏈數單鏈拓撲學直鏈假定序列無序列ATGGCAAACC CAATGCAAAC A 21序列號76序列的長度434序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholletiae)序列TGGGGAGCAA CAGTTATTAC TAATTTATTA TCTGCTATTC CTTGGATTGG TAAAGATCTT 60GTAGAATTTA TTTGGGGTGG TTTCAGTGTT GATAATGCTA CTTTAAATCG ATTCTTTAGT 120CTACATTATT TATTACCATT CATTCTTGCT GCTTTAGCAG TTATGCATTT AATTGCAAAA 180GAAGAAAATG GATCAAGTAA TCCATTAGGA ATTACAGCTA ATGCTGATAT GATTTATATG 240CATCCATATT ATATCTTTAA AGATTTAGTA ACTATTTTCT TATTCTTCTT AGTATTAGGA 300TTATTCTTAT TTTATGCTCC TAATAAATTA GGACATCCTG ATAATTATAT TCCAGCTAAT 360CCAATGCAAA CTCCAGCTTC TATTGTTCCT GAGTGGTATC TATTACCATT TTATGCTATT 420TTAASWKCTA TWCC434序列號77序列的長度434序列的類型核酸鏈數兩種類型拓撲學直鏈假定序列無來源卷枝毛霉(Mucor circinelloides)序列TGGGGAGCAA CAGTTATTAC TAACCTATTA TCGGCTATCC CTTGGATTGG TAAAGATTTA 60GTAGAATTCA TCTGGGGAGG TTTCTCTGTA GATAATGCGA CATTAAACCG ATTCTTCAGT 120CTTCACTACT TATTACCATT CATCTTAGCA GCTTTATCTT TAATGCATTT AATTGCTAAA 180GAAGAAAATG GATCTAATAA TCCACTAGGA ATTACAGCAA ACACTGATAT GGTTTATCTT 240CATCCTTATT ACGTATTTAA AGATTTAGTA ACAATTTTCT TATTCTTCTT AGTATTAGCT 300TTATTCTTAT TCTATGCACC TAATAAATTA GGTCATCCTG ATAATTATAT TCCAGCTAAC 360CCAATGCAAA CTCCTGCATC TATTGTACCA GAATGGTATC TATTACCTTT CTATGCTATT 420TTAASWKCTA TWCC 43權利要求
1.真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用引物，它是由含有序列表中序列號57所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列中連續的至少10個堿基的堿基序列構成的核酸片段構成的。
2.權利要求1的引物，它是由含有序列表中序列號57所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
3.真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用引物，它是由含有序列表中序列號3所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列中連續的至少10個堿基的堿基序列構成的核酸片段構成的。
4.權利要求3的引物，它是由含有序列表中序列號3所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
5.真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用引物，它是由含有序列表中序列號58所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列中連續的至少10個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
6.權利要求5的引物，它是由含有序列表中序列號58所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
7.真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用引物，它是由含有序列表中序列號59所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列中連續的至少10個堿基的堿基序列構成的核酸片段構成的。
8.權利要求7的引物，它是由含有序列表中序列號59所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
9.真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用引物，它是由含有序列表中序列號60所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列中連續的至少10個堿基的堿基序列構成的核酸片段構成的。
10.權利要求9的引物，它是由含有序列表中序列號60所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
11.真菌線粒體細胞色素b基因片段擴增用引物，它是由含有序列表中序列號61所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列中連續的至少10個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
12.權利要求11的引物，它是由含有序列表中序列號61所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
13.權利要求1-12任一項的引物，它是由含有各序列號中的通式所表示的堿基序列的核酸片段的混合物構成的。
14.權利要求1-13任一項的引物，其中上述真菌是曲霉屬的真菌。
15.權利要求1-13任一項的引物，其中上述真菌是假絲酵母屬的真菌。
16.權利要求1-13任一項的引物，其中上述真菌是小克銀漢霉菌屬的真菌。
17.權利要求1-13任一項的引物，其中上述真菌是毛霉屬的真菌。
18.權利要求14的引物，其中曲霉屬的真菌選自煙曲霉，黃曲霉，黑曲霉，構巢曲霉和土曲霉。
19.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的連續的10-100個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
20.黃曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號6所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的連續的10-100個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
21.黑曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號7所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的連續的10-100個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
22.構巢曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號8所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的連續的10-100個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
23.土曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號9所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的連續的10-100個堿基的堿基序列的核酸片段構成的。
24.權利要求19-23任一項的檢測用核酸，它是連續的10-100的堿基，15-30的堿基。
25.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的24位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
26.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的99位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
27.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的144位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
28.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的252位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
29.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的277位的G作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
30.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的304位的G作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
31.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的312位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
32.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號5所示的序列的393位的G作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號5中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
33.黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號6所示的序列的174位的Y作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號6中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
34.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的42位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上的堿基核酸構成的。
35.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的69位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
36.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的126位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
37.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的207位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
38.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的213位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
39.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的246位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
40.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號7所示的序列的396位的G作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號7中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
41.構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號8所示的序列的60位的T作為3’末端，至少10個堿基以上的核酸構成的；或由序列表中序列號8中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
42.構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號8所示的序列的221位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號8中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
43.構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號8所示的序列的271位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號8中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
44.構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號8所示的序列的285位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號8中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
45.構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號8所示的序列的366位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號8中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
46.構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號8所示的序列的387位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號8中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
47.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的25位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
48.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的48位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
49.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的162位的T作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
50.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的225位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
51.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的261位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
52.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的339位的C作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
53.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的360位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
54.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的375位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
55.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號9所示的序列的411位的A作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的；或由序列表中序列號9中所示的互補序列上對應的堿基作為3’末端，至少10個以上堿基的核酸構成的。
56.權利要求25-55任一項的核酸，其中核酸的堿基數是10-100。
57.權利要求56的核酸，其中核酸的堿基數是15-30。
58.權利要求25-57任一項的檢測用核酸，其中檢測用核酸是核酸擴增用的引物。
59.權利要求25-57任一項的檢測用核酸，其中檢測用核酸是標記的引物。
60.權利要求30的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號10所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
61.權利要求33的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號11所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
62.權利要求33的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號12所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
63.權利要求36的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號13所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
64.權利要求42的構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號14所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
65.權利要求54的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號15所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
66.權利要求53的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號62所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
67.權利要求43的構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號64所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
68.權利要求37的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號64所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
69.權利要求30的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號65所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
70.權利要求37的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號66所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
71.權利要求37的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號67所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
72.權利要求30的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號68所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
73.權利要求31的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號69所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
74.權利要求36的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號70所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
75.權利要求38的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號71所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
76.權利要求42的構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號72所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
77.權利要求44的構巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號73所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
78.權利要求54的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號74所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
79.權利要求54的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號75所示的堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補的堿基序列的核酸片段構成的。
80.權利要求1或2的引物，其是正向引物。
81.權利要求70或79的核酸，其是正向引物。
82.權利要求3至11任一項的引物，其為反向引物。
83.權利要求60至69任一項的引物，其為反向引物。
84.通過用基因擴增方法對曲霉屬真菌的細胞色素b基因片段進行擴增從而對曲霉屬真菌進行檢測和/或鑒定的方法，其中在基因擴增方法中使用了由含有序列表中序列號1和2所示堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)中連續的至少10個堿基的堿基序列的核酸構成的正向引物以及權利要求80的正向引物中的至少一個，和權利要求83的反向引物中的至少一個。
85.通過用基因擴增方法對曲霉屬真菌的細胞色素b基因片段進行擴增從而對曲霉屬真菌進行檢測和/或鑒定的方法，其中在基因擴增方法中使用了權利要求81的正向引物中的至少一個，和權利要求82的反向引物以及由含有序列表中序列號4所示堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)的互補序列中連續的至少10個堿基的堿基序列的核酸構成的反向引物中的至少一個。
86.通過用基因擴增方法對曲霉屬真菌的細胞色素b基因片段進行擴增從而對曲霉屬真菌進行檢測和/或鑒定的方法，其中在基因擴增方法中使用了由含有序列表中序列號1和2所示堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)中連續的至少10個堿基的堿基序列的核酸構成的正向引物以及權利要求80的正向引物中的至少一個，和權利要求82的反向引物以及由含有序列表中序列號4所示堿基序列(但是，任意位點的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)的互補序列中連續的至少10個堿基的堿基序列的核酸構成的反向引物中的至少一個。
87.含有序列表中序列號5到9任一項的堿基序列的DNA片段。
全文摘要
一種用于檢測真菌的核酸,它含有序列表中序列號3、57～75所示的序列。該核酸可用作基因擴增用的探針或引物。當用作引物的時候,通過選擇適當的引物,該核酸可對曲霉屬真菌進行檢測及鑒定,這是因為根據真菌菌種的不同,被擴增的核酸片段的大小不同。
文檔編號C12N15/31GK1207129SQ97191609
公開日1999年2月3日 申請日期1997年9月9日 優先權日1997年9月9日 公開號97191609.8
發明者橫山耕治, 王麗 申請人:愛詩愛詩制藥株式會社