Nr_027669．1在檢測器官移植患者真菌感染中的應用及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及疾病早期診斷技術領域，具體地，涉及NR_027669.1在檢測器官移植患 者真菌感染中的應用及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 據中山大學附屬第一醫院器官移植中心回顧性臨床研究發現，器官移植術后真菌 感染率為13.5%( 120/886 )，其真菌感染病死率達到70.8%;感染菌種以白色念珠菌感染為主 (67.5%)，部位以肺部為主(73.3%)。結合國內外相關報道，我們發現，器官移植受者真菌感 染的發病率高達20%~40%，而且其所導致的侵襲性感染相對一般細菌、病毒感染具有更高的 病死率，嚴重危及患者性命。雖然目前感染的主要病原真菌仍然是念珠菌，但曲霉菌、接合 菌及新生隱球菌等也在不斷增加。真菌感染譜的改變，也不斷增加了臨床診斷的難度與壓 力。
[0003] 真菌感染的早期診斷和治療，對于改善患者預后，提高患者生存率十分重要。目前 可用于臨床診斷真菌感染的實驗室方法有以下幾種： 1、抗原學檢測：包括檢測半乳甘露聚糖(Gm試驗）、真菌葡聚糖(G試驗)及深部真菌抗 原。Gm試驗檢測的是菌絲生長時，從薄弱的菌絲頂端釋放出來的半乳甘露聚糖，是最早釋放 的抗原，主要適于侵襲性曲霉菌感染的早期診斷。Gm釋放量與菌量成正比，可以反映感染程 度。但以下情況可出現假陽性：（1)使用半合成青霉素，如哌拉西林/他唑巴坦；（2)新生兒和 兒童；（3)血液透析；（4)自身免疫性肝炎等；（5)食用可能含有Gm的高蛋白食物和污染的大 米等。但其表達情況受機體免疫力影響較大，在器官移植患者中的敏感度僅為22%。6試驗檢 測的是真菌胞壁成分一（l，3)-i3-D-葡聚糖。人類吞噬細胞吞噬真菌后，能持續釋放該物 質，使體液中含量增高（淺部真菌感染無類似現象）。適用于除隱球菌和接合菌(包括毛霉 菌、根霉菌等)外所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。 以下情況可出現假陽性：（1)使用纖維素膜進行血透；（2)靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝 血因子或血液制品；（3)鏈球菌血癥；（4)使用半合成青霉素，如哌拉西林/他唑巴坦；（5)標 本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；（6)食用菌類，如蘑菇等。深部真菌抗原要 檢測白色念珠菌、曲霉菌、新型隱球菌抗原。主要通過乳膠凝集法和ELISA法檢測外周血、灌 洗液、引流液中的三種抗原成分，從而判斷感染的菌種及感染情況。其表達量的多少與菌種 數量正相關，對于監測病情變化及治療效果有積極意義。但有報道指出系統性紅斑狼瘡、結 節病、類風濕因子、巨球蛋白、結核感染等均可引起假陽性結果，考慮可能與其血清中存在 交叉抗原有關。而在感染早期，尤其是感染菌量較少、感染部位較局限時，其早期診斷意義 受限。此外，該檢測對于其他種屬的真菌感染診斷價值不大。
[0004] 2、真菌培養及鏡檢：即通過采集血液、引流液、痰液、組織等接種于沙保羅瓊脂培 養基或其他特殊培養基培養，通過觀察病原菌生長情況，從而明確所感染的致病菌種類，同 時還可進行藥敏試驗，為臨床合理用藥提供指導。但該方法敏感性和特異性均較差，常無法 區分是感染還是定植，在使用抗真菌藥物之后，其檢出陽性率將進一步降低。而且真菌培養 周期較長，常需要3-7天，不能為臨床早期診斷提供依據。樣本經直接鏡檢發現菌絲、孢子、 包囊、滋養體或囊內小體等，可為診斷真菌感染提供依據。該方法具有快速、簡便的特點，且 可以根據特征性形態區分念珠菌、隱球菌、結合菌等，但直接鏡檢的檢出率很低，取材受限， 尤其是對于深部真菌，因而容易導致漏診。而且有時候難以區分是定植菌還是感染菌，因 此，直接鏡檢法對真菌病的診斷作用有限。
[0005] 3、分子生物學檢測：分子生物學檢測是指主要以聚合酶鏈反應(PCR)技術為基礎 的一系列分子診斷方法，是目前真菌感染診斷中最活躍的領域。近年來發展迅速，主要包括 分子探針、聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、限 制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)、實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術、巢式PCR 等。該檢測手段主要針對特定菌種的特異性基因片段或者真菌界保守序列進行擴增檢測， 具有敏感性高，特異性強，簡便快速等優點，但上述不同的技術手段，其需要的設備條件、 操作技術等不完全一致，而且特異性也因其樣本純度、引物設計等而異，因此，不同實驗室 之間的檢驗準確性、最低限值等相差較大。各種因素造成假陽性、假陰性使其應用價值受到 了一定的限制，目前主體尚停留于實驗室階段。
[0006] 4、其他診斷方法:組織病理學是深部真菌感染重要的診斷方法之一，除傳統的染 色方法外，免疫組化方法可通過檢測真菌抗原特異地診斷組織中真菌病原體，還可使組織 中稀少存在的孢子更易發現，因而免疫組化技術比組織化學方法更加敏感。免疫組化是繼 培養法這一金標準之后特異診斷真菌感染的手段之一。但免疫組化法并未完全解決種屬特 異性問題，同時，該技術需要通過有創手段獲取組織，限制了其普及應用及早期診斷價值。
[0007] 隨著質譜分析技術的不斷進展，血清真菌代謝產物檢測也得到迅速發展。真菌代 謝產物主要包括D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇和甘露聚醇。采用酶熒光法檢測血、尿標本D-阿拉 伯糖醇/肌酐比值或GC-MS法檢測血、尿標本D-阿拉伯糖醇/L-阿拉伯糖醇比值，可快速預測 系統性念珠菌感染。另有研究中心使用質譜分析，根據特異真菌代謝產物快速地鑒定40多 個不同真菌菌株。但由于檢測費用昂貴，質譜分析目前并不能在臨床實驗室廣泛應用。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的是為了克服現有技術的上述不足，提供一種檢測器官移植患者真菌 感染標志物。
[0009] 本發明的另一個目的是，提供一種檢測器官移植患者真菌感染的試劑盒。本發明 專利由國家高技術研究發展計劃(863計劃)資助。
[0010] 為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的： 器官移植術后患者長期服用免疫抑制劑，機體對于真菌感染的抵抗力薄弱，疾病進展 迅速，而其早期診斷更加困難。在缺乏足夠診斷依據的情況下，加用抗真菌藥物不僅增加了 患者的治療成本和經濟負擔，也增加了不良反應的發生風險。因此，本發明通過建立特定真 菌感染的移植術后小鼠模型，將其感染早期的外周血單核細胞(PBMC)標本保存，運用基因 芯片方法篩選其差異表達的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，最后在臨床感染患者外周血標本中 進行確證，從而發現NR_027669.1可以用于早期診斷器官移植患者是否感染真菌。NR_ 027669.1的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 因此，本發發明要求保護NR_027669.1在制備檢測器官移植患者真菌感染試劑盒 中的應用。
[0012] NR_027669.1在作為檢測器官移植患者真菌感染標志物中的應用。
[0013] -種檢測器官移植患者真菌感染的試劑盒，通過該試劑盒分別檢測待測患者外周 血單核細胞中的GAPDH和NR_027669.1的Cq值，GAH)H和NR_027669.1的Cq值至少測定3次，取 平均值后按照下列公式和方法判斷結果： Λ CT 值=AVERAGE (NR_0 2 7669 · 1 的 Cq值）一 AVERAGE (GAPDH的 Cq值） 結果判斷：ACT值大于或等于3時，考慮患者存在真菌感染，結果為陽性;ACT值小于3 時，考慮患者不存在真菌感染，結果為陰性。
[0014] 優選地，通過Q-PCR檢測GAPDH的Cq值，Q-PCR檢測時的引物序列如SEQIDNO:2~3 所示。
[0015] 優選地，通過Q-PCR檢測NR_027669.1的Cq值，Q-PCR檢測時的引物序列如SEQ ID NO: 4~5所示。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果： 本發明通過檢測機體對于真菌感染而反應性產生的IncRNA表達量，從而明確機體的感 染狀況。而且本發明選定的檢測指標的表達情況不受機體免疫抑制狀態影響。而傳統的分 子生物學檢測手段主要針對的是病原體本身特定DNA