一種兔皮膚真菌復合pcr檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于,包括以下步驟：(1)疑似感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的病料用熱裂解法提取DNA；(2)合成Pa，Pb；Pc，Pd；Pe，Pf三對特異引物；(3)以病料DNA為模板，Pa-Pf3對引物混合為引物進行PCR擴增；(4)電泳檢測PCR產物。本發明的有益之處在于：提供了一種兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，經過一次PCR就能鑒別3種皮膚真菌。較傳統直接顯微觀察和病原分離培養等方法特異性強、敏感性高、省時；與其他分子生物學方法比，減少了PCR次數，也不需序列測定，具有簡單、快速、經濟等特點，且非常適合大規模樣品檢測。
【專利說明】—種兔皮膚真菌復合PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種兔皮膚真菌感染的檢測方法，具體涉及一種兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，屬于生物醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]皮膚真菌(Dermatophyte)是皮膚真菌病的病原菌。兔皮膚真菌病(Dermatomycosis)是一類傳染性極強的人畜共患病，不僅危害養兔業，造成重大經濟損失，還傳染人，影響人體健康。皮膚真菌病的病原涉及三個屬，分別為毛癬菌屬(Trichophyton)、小孢子菌屬(Microsporum)和表皮癖菌屬(Epidermophyton)。兔皮膚真菌流行病學調查顯示須癬毛癬菌、犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌是最常見皮膚真菌。不同的皮膚真菌侵染部位不同，引起的病變有差異，用藥和采取防控措施也各不相同，因此，對皮膚病真菌種類鑒定顯得非常重要。
[0003]目前，常見皮膚真菌檢測方法包括:病料直接顯微觀察、病原分離培養和分子生物學方法。病料直接顯微觀察簡單、快速，但無法鑒別真菌的種類，有5% -15%假陰性；病原分離培養雖然通過菌落、菌絲和孢子的形態，結合生化試驗，可以明確真菌種類，但由于皮膚真菌生長緩慢，一般為3-4周，耗時長，且有40%假陰性；分子生物學方法包括染色體DNAG+C的含量、總DNA同源性、線粒體DNA限制酶斷片長度多態分析、隨機引物PCR、隨機擴增DNA多態性分析、PCR指紋等。最近發現，采用核糖體DNA(rDNA)區及rRNA小亞基序列分析，特別是 ITS (analysis of internal transcribed spacer)區分析比對編碼 rRNA 小亞基(18SrRNA)基因更適應對皮膚真菌檢測，目前，把rDNA的ITS區序列分析稱為皮膚癬菌鑒定的金標準。雖然該方法特異、敏感，但需要基因序列的測定及分析，這限制了此方法的應用，且一次反應僅能鑒定一種真菌，不適合大規模樣品檢測。

【發明內容】

[0004]為解決現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種具有特異性強、敏感性高，成本低，且適合大規模樣品檢測的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法。
[0005]為了實現上述目標，本發明采用如下的技術方案:
[0006]一種兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007](I)病料DNA提取:疑似感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的病料采用熱裂解的方法提取DNA ； [0008](2)引物的合成:
[0009]須癬毛癬菌特異弓I物:Pa5’ GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3’
[0010]Pb5’ GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3’
[0011]犬小孢子菌特異引物:Pc5’GACCGCCCGTCGCT ACTAT3’
[0012]Pd5’ TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3’
[0013]絮狀表皮癬菌特異引物:Pe5’GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3’[0014]Pf5’CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3’ ；
[0015](3)復合PCR:以病料DNA為模板，Pa-Pf3對弓丨物混合為弓丨物進行PCR擴增；
[0016](4)PCR產物檢測:采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠成像分析儀觀察結
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[0017]前述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR的反應體系為=MixtureslO μ L，三對引物Pa-Pf最終濃度0.2mM,模板DNA4 μ L，加ddH20至總體積20 μ L0
[0018]前述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，在步驟(3)中，PCR循環參數為:94°C初始變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環，72°C終延伸IOmin0
[0019]前述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，前述須癬毛癬菌特異引物、犬小孢子菌特異引物和絮狀表皮癬菌特異引物的濃度配比為1:1:1。
[0020]本發明的有益之處在于:采用復合PCR方法，所用樣品量少，經過一次PCR就能鑒別3種皮膚真菌。較傳統直接顯微觀察和病原分離培養等方法特異性強、敏感性高、省時；與其他分子生物學方法比，減少了 PCR次數，也不需序列測定，具有簡單、快速、經濟等特點，且非常適合大規模樣品檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發明所述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法的一個具體實施例中獲得的電泳圖。
[0022]圖中，M為DNA分子質量標準；F1，F2，F3為疑似感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的3組病料；F4為陽性對照；F5，F6為陰性對照。
【具體實施方式】
[0023]1.DNA 提取
[0024](I)菌株DNA提取:將須癬毛癬菌、犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌的菌株接種在沙堡弱SDA培養液，27 °C，震蕩培養8天，收獲；取真菌團塊放入500 μ L裂解液(400mMTris-HCl (pH8.0), 60mMEDTA (pH8.0)，150mM NaCl，I % 十二烷基硫酸鈉);室溫放置 lOmin，加150 μ L乙酸鉀(ρΗ4.8)，漩渦震蕩，離心12000g，lmin ;上清液放入新試管，加入等體積異丙醇；DNA團塊用70%乙醇洗，干燥后，溶解在50yL的TE(10mM Tris7ImM EDTA)中，2 μ LDNA用于后續PCR。菌株DNA模板作為陽性對照組。
[0025](2)病料DNA提取:將疑似感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的三組病料F1，F2，F3分別進行下述操作:將病料加入100 μ L提取液(60mM NaHC03，250mM KCI，50mMTris,pH9.5) 95°C，IOmin ;加100 uL2%牛血清蛋白，漩渦震蕩，即可用于后續PCR。病料DNA模板作為實驗樣品組。 [0026](3)陰性對照:取沒有感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的兩組DNA樣品F5，F6為陰性對照組。
[0027]2.引物的合成
[0028]須癬毛癬菌特異弓I物:Pa5’ GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3’[0029]Pb5’ GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3’
[0030]犬小孢子菌特異引物:Pc5’GACCGCCCGTCGCT ACTAT3’
[0031]Pd5’ TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3’
[0032]絮狀表皮癬菌特異引物:Pe5’GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3’
[0033]Pf5’CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3’ ；
[0034]引物合成在北京生工生物技術有限公司，預期擴增出目的片段大小須癬毛癬菌為:288bp，犬小孢子菌為:500bp，絮狀表皮癬菌為:366bp。
[0035]3.復合 PCR
[0036](I)PCR反應體系:MixtureslOy L，三對引物Pa-Pf最終濃度0.2mM，三對引物的濃度配比為1:1:1，須癬毛癬菌特異引物、犬小孢子菌特異引物和絮狀表皮癬菌特異引物的量分別為:I μ L,模板DNA4 μ L,加ddH20至總體積20 μ L。
[0037](2)PCR循環參數:94°C初始變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環，72°C終延伸IOmin。獲得須癬毛癬菌DNA核酸序列SEQ.1D.No:1，犬小孢子菌DNA核酸序列SEQ.1D.No:2，絮狀表皮癬菌DNA核酸序列SEQ.1D.No:3。
[0038]4.PCR產物檢測:取5 μ L反應產物于I %含溴乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析儀觀察，見圖1 =Fl組出現500bp條帶，表明Fl組病料感染了犬小孢子菌；F2組出現366bp條帶，表明F2組病料感染了絮狀表皮癬菌；F3組出現288p條帶，表明F3組病料感染了須癬毛癬菌。
[0039] 由此可見，本發明的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，所用樣品量少，經過一次PCR就能鑒別3種皮膚真菌，較傳統直接顯微觀察和病原分離培養等方法特異性強、敏感性高、省時；與其他分子生物學方法比，減少了 PCR次數，也不需序列測定，具有簡單、快速、經濟等特點，且非常適合大規模樣品檢測。
【權利要求】
1.一種兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)病料DNA提取:疑似感染須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌的病料采用熱裂解的方法提取DNA ； (2)引物的合成: 須癬毛癬菌特異引物:Pa5’ GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3’
Pb5’ GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3’ 犬小孢子菌特異引物:Pc5’ GACCGCCCGTCGCT ACTAT3’
Pd5’ TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3’ 絮狀表皮癬菌特異引物:Pe5’ GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3’
Pf5，CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3，； (3)復合PCR:以病料DNA為模板，Pa-Pf3對引物混合為引物進行PCR擴增； (4)PCR產物檢測:采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠成像分析儀觀察結果。
2.根據權利要求1所述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR的反應體系為:MixtureslO μ L，三對引物Pa-Pf最終濃度0.2mM,模板DNA4 μ L，加ddH20至總體積20 μ L0
3.根據權利要求2所述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，在步驟(3)中，PCR循環參數為:94°C初始變性5min, 94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環，72°C終延伸IOmin。
4.根據權利要求1、2或3所述的兔皮膚真菌復合PCR檢測方法，其特征在于，所述須癬毛癬菌特異引物、犬小孢子菌特異引物和絮狀表皮癬菌特異引物的濃度配比為1:1:1。
【文檔編號】C12R1/645GK104004835SQ201410204465
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月15日 優先權日:2014年5月15日
【發明者】劉彥威, 劉娜, 劉利強, 杜鵑, 石玉祥, 張永英, 王慧真 申請人:河北工程大學