專利名稱：：改進的芽孢桿菌rna酶抑制劑基因的制作方法
技術領域：
：本發明涉及改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因和改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質，所述蛋白質能夠用于中和真核細胞，特別是植物細胞中芽孢桿菌RNA酶的活性。因此可以將改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因用于生產可育的恢復系植物，所述植物能夠使雄性不育系植物恢復繁殖力，所述雄性不育植物在其細胞的核基因組中含有包括雄蕊選擇性啟動子和編碼芽孢桿菌RNA酶的DNA的嵌合基因。本發明還涉及在其細胞的核基因組中含有改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的恢復系植物。
背景技術：
：在許多植物中，如果不是大多數植物，開發雜種栽培品種是非常令人滿意的，因為通常由于雜種優勢，雜種栽培品種的生產能力增強與其親本相比雜種個體具有優勢性能(參見例如Fehr,1987，栽培品種研制的原理，第一卷理論和技術，MacMillan出版公司，紐約；Allard,1960，植物育種原理，JohnWileyandSons,Inc.)。各個植物種類的雜種栽培品種的研制取決于親本之間獲得幾乎完全的交叉授粉的能力。達到這一目的最簡單的方法是通過去除花藥以手工的方式，或通過利用在一個親本的細胞質或核基因中阻止花藥和/或花粉發育(植物雄性不育的綜述，參見例如Kaul,1988，‘高等植物的雄性不育’，SpringerVerlag)而從遺傳上使親本品系之一雄性不育(即使它們處于沒有花粉或花粉沒有功能的狀態下)。對于其種子是收獲的產品(例如玉米，油菜)的雜種植物，大多數情況下，確保完全恢復雜種植物的繁殖力也是必要的。在雄性不育處于遺傳控制下的系統，需要存在和應用能夠恢復雄性不育的基因。雜種栽培品種的研制主要取決于是否可獲得合適的和有效的不育和恢復基因。對于大多數可能含有影響雄性不育的基因型的植物品系，內源性核基因座是已知的，并且通常，對于特定的隱性等位基因這樣的基因座必須是純合的，以便產生雄性不育表現型。在這樣的基因座顯性“雄性能育”等位基因的存在導致產生雄性可育。近來，已經證明通過給植物基因組提供包括編碼例如細胞毒性產物(例如RNA酶)的DNA序列(或雄性不育DNA)并且處于啟動子控制下的嵌合雄性不育基因能夠在植物中誘導雄性不育，其中啟動子在選定的雄性可再生器官的細胞中具有優勢的活性。關于這一點，已經證明雄蕊選擇性啟動子，例如煙草的TA29基因的啟動子特別適用于此目的(Mariani等人，1990，自然學347:737，歐洲專利公開(EP0,344,029)。通過給植物的核基因組提供這樣的雄性不育基因，制備了人工的雄性不育基因座，它含有導致產生雄性不育植物的人工的雄性不育基因型。另外，已經證明用包括另一個DNA序列的嵌合的能育性-恢復基因(或能育性-恢復DNA)能夠恢復雄性可育，所述能育性-恢復基因編碼例如在植物細胞中抑制細胞毒性產物的活性的蛋白質或阻止細胞毒性產物的活化的蛋白質(歐洲專利公開(EP0,412,911)。例如解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因編碼RNA酶，芽孢桿菌RNA酶，該酶受蛋白質，芽孢桿菌RNA酶抑制劑的抑制，它是由解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因編碼的。芽孢桿菌RNA酶基因可用于構建一個不育的基因，而芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因可用于構建可育-恢復基因。在不同的植物品系，例如油菜中進行的試驗已經證明嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因完全能夠恢復雄性不育系的雄性繁殖力，其中雄性不育系的雄性不育是由于存在嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因(EP0,412,911,Mariani等人，1991,CCIRC油菜會議的會議錄，1991年，7月9-11日，Saskatoon,Saskatchewan，加拿大；Mariani等人，1992，自然學357:384)。通過偶合一個標記基因，例如顯性的除草劑抗性基因(例如編碼膦蘇菌素乙酰轉移酶(PAT)的bar基因，所述PAT將除草劑膦蘇菌素轉化為非毒性的化合物[DeBlock等人，1987，EMBOJ.6:2513])，利用嵌合的雄性不育和/或可育-恢復基因，可以給育種系統提供選擇雄性不育植物的均一的群體的方法(EP0,344,029；EP0,412,911)。任何植物種類的特定的栽培品種的雜種種子的生產要求1)保持少量的各個自交系親本的純種子，和2)制備大量的各個自交系親本的種子。通常通過幾個(通常是兩個)種子繁殖循環，從少量的純種子(“基本種子”)開始，并且在各個繁殖循環中產生大量的自交系親本的純種子，最后產生自交系親本的母本種子(“親本種子”或“基本種子”)，能夠獲得這樣大量的種子，所述母本種子的量足以在種植以后產生所需量的雜種種子。當然，在各個種子繁殖循環中需要較大的種植面積(大田)。芽孢桿菌RNA酶是一種由解淀粉芽孢桿菌分泌的核糖核酸酶，芽孢桿菌RNA酶抑制劑是由該相同的微生物產生的芽孢桿菌RNA酶的抑制劑(Hartley,1988，分子生物學雜志202:913-915)。已經有人描述了幾種突變的芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質(Hartley,1993，生物化學32:5978-5984；SchreiberandFersht,1993，生物化學32:5145-5150；Guillet等人，1993，現代生物學1:165-177；Hartley,1989,TIBS14:450-454；Axe等人，1996,PNAS93:5590-5594；Serrano,1993，分子生物學雜志233:305-312)。已證明其中某些突變體基本上保留了由解淀粉芽孢桿菌產生的芽孢桿菌RNA酶和芽孢桿菌RNA酶抑制劑的生物學活性。但是，至少已經描述了兩種突變的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，它們沒有可檢測的芽孢桿菌RNA酶抑制劑活性(Hartley,1993，生物化學32:5978-5984；Guillet等人，1993，現代生物學1:165-177)。還已知其他相關的微生物能夠產生與芽孢桿菌RNA酶抑制劑和芽孢桿菌RNA酶高度類似的蛋白質。因此，Bacillustntermedius產生binase和binstar(Schulga等人，1992,NAR20:2375；Guillet等人，1993，見上文)。發明概述本發明涉及改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，它編碼具有以Met-Xaa開頭的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。優選的是芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有下列氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，所述氨基酸序列是1)SEQIDNo2的氨基酸序列，其中第二個氨基酸不是賴氨酸，而是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；2)SEQIDNo4的氨基酸序列；或SEQIDNo4的氨基酸序列，其中第二個氨基酸不是丙氨酸，而是纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。本發明還提供了改進的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，它含有低于40％的A和T核苷酸和/或具有對油菜籽，棉花，玉米，水稻和小麥，優選的是油菜籽，玉米，水稻最佳的慣用密碼子。優選的是合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有不高于7％CG雙核苷酸和/或不高于9.5％的CNG三核苷酸。優選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。特別優選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有SEQIDNo3的核苷酸序列。本發明還提供了嵌合基因，其中改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA可操作連接到植物可表達啟動子上，優選的是選擇性地在雄蕊細胞中指導表達和至少在氈絨層細胞中指導表達的啟動子；含有這些嵌合基因的植物細胞和植物。本發明進一步提供了改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA和改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質在中和植物細胞中芽孢桿菌RNA酶中的應用，特別是關于雄性可育恢復為雄性不育系的應用。本發明還提供了具有以Met-Xaa開頭的氨基酸序列的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。發明詳述本文使用的雄性不育(“ms”)植物是給定的植物種類的植物，它是由于一種整合到所述植物的核DNA的嵌合的雄性不育基因(S)的表達而導致的雄性不育植物，其中所述的嵌合基因包括下列可操作連接的DNA片段1)“不育性啟動子”，它選擇性地在雄蕊細胞，優選的是至少在氈絨層細胞中指導表達，和2)“雄性不育DNA”，它編碼芽孢桿菌RNA酶(“芽孢桿菌RNA酶DNA”)。所述雄性不育基因的一個例子是包括處于來自于煙草的TA29基因的啟動子，例如包含于質粒pVE108(WO92/29696)中的啟動子的控制下的芽孢桿菌RNA酶DNA的基因。本文描述的恢復系植物是相同植物種類的雄性可育植物，它含有整合到其細胞的核DNA中的一個可育的恢復基因(R)，包括1)“恢復啟動子”，它指導至少那些雄蕊細胞中的表達，其中不育性啟動子指導ms植物的芽孢桿菌RNA酶DNA的表達，和，2)編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的“恢復DNA”(“芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”)。對于本發明的恢復系植物，芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，如下文所述。在含有雄性不育基因的雄性不育植物的那些子代植物中存在的可育性的恢復基因使那些子代植物恢復雄性繁殖力。當然子代植物是從雄性不育植物和恢復系植物之間的雜交獲得的。本文使用的恢復系植物是指雄性可育的并且其基因組內含有雄性不育基因和可育性-恢復基因，特別是包括本發明的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的可育性恢復基因的植物(其與雄性不育植物和恢復系植物是相同的植物種類)。品系是指給定的單個植物的子代。給定的品系的植物其一個或多個特定的遺傳和/或表現型特性是互相類似的。如本文所述，雄性不育(ms)系是一組屬于一個植物種類，特別是一個植物品種的植物，由于在相同的遺傳基因座存在特定的雄性不育基因，它們都是雄性不育的。類似地，恢復系是指一組在相同的遺傳基因座都含有特定的可育性恢復基因的植物種類的植物。優選的是所有的ms品系的植物(各自的恢復系)就雄性不育基因座(各自的可育性恢復基因座)而言具有相同的基因型。通過在ms品系導入可育性恢復基因，例如通過將ms品系的植物與恢復系植物雜交以便至少某些子代植物是恢復的植物，可以使雄性不育系恢復為雄性可育。一個品種的品系的遺傳背景命名為存在于該品種中的基因的總數，所述基因總數決定該品種的特定的表現型特性。因此，可以將通過遺傳工程手段導入而產生一個品種的特定的品系的外源基因例如雄性不育基因或恢復基因導入到不同的品種(或甚至不同的種類)中，各個品種具有不同的遺傳背景。為了生產雜種種子，也將雄性不育系稱作為雌性或第一親系，還將雄性可育(恢復)系稱作為雄性或第二親系。本文所述的基因通常被理解為包括至少一個編碼RNA，蛋白質或多肽的編碼區，該編碼區可操作連接到合適的啟動子和3’調控序列上。為了本發明的目的，基因的表述例如嵌合基因的表達是指基因的啟動子指導DNA轉錄為具有生物學活性的RNA，即所述RNA能夠與另一個RNA或蛋白質互相作用，或能夠被轉譯為生物學活性的多肽或蛋白質。表現型是基因型即一個基因或一組基因的表達(或表達不足)的外部形態(例如雄性不育，在特定的植物組織存在蛋白質或RNA等等)。本文使用的芽孢桿菌RNA酶是能夠降解單鏈RNA的任何蛋白質，并且它包括由解淀粉芽孢桿菌分泌的芽孢桿菌RNA酶(分泌的芽孢桿菌RNA酶)的氨基酸序列(Hartley,1988，分子生物學雜志202:913)或包括與該序列至少具有80％，優選的是至少85％的序列等同性的氨基酸序列。本文使用的芽孢桿菌RNA酶能夠通過一個反應降解RNA，所述反應涉及將一個核苷酸的5’核糖和結合到鄰近的3’核苷酸上的磷酸基團之間的磷酸二酯鍵進行初始的裂解。該反應的初始產物是2’,3’-環狀的磷酸中間體，隨后該中間體被水解為相應的3’核苷磷酸。芽孢桿菌RNA酶也能夠將聚乙烯醇腺苷磷酸以產生高熒光團的核苷酸類似物1,N-乙烯醇腺苷(Fitzgerald和Hartley,1993，生化分析214:544-547)并且按照標準條件的測定，具有10％，優選的是至少50％，特別是至少75％的分泌的芽孢桿菌RNA酶的活性(Fitzgerald和Hartley,1993，生化分析214:544-547；Hartley,1993，生物化學32:5978-5984)。芽孢桿菌RNA酶進一步能夠特異性地結合到野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑(參見下文)，其離解常數為10-12M或更低，優選的是離解常數為10-13M-10-14M的范圍內(Schreiber和Fersht,1993，生物化學32:5145-5150；Hartley,1993，生物化學32:5978-5984)。Binase是由Bacillusintermedius分泌的胞外核糖核酸酶(Schulga等人，1992,NAR20:2375)并且還被認為是用于本發明的芽孢桿菌RNA酶。為了方便起見，用于說明書或下文的實施例中的芽孢桿菌RNA酶命名為具有由pVE108編碼的芽孢桿菌RNA酶的氨基酸序列(WO92/09696)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑是能夠與分泌的芽孢桿菌RNA酶特異性結合的任何蛋白質，其解離常數為10-12M或更低，優選的是離解常數為10-13M-10-14M的范圍內(Schreiber和Fersht,1993，生物化學32:5145-5150；Hartley,1993，生物化學32:5978-5984)。在標準條件以及等摩爾量的芽孢桿菌RNA酶抑制劑和分泌的芽孢桿菌RNA酶的混合物時，芽孢桿菌RNA酶抑制劑能夠抑制至少50％，特別是至少75％，更特別是至少90％的分泌的芽孢桿菌RNA酶的活性(Hartley,1993，生物化學32:5978-5984)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑是包括SEQIDNo2的氨基酸序列或與具有該序列至少80％，優選的是至少85％的序列等同性。野生型的芽孢桿菌RNA酶抑制劑是由解淀粉芽孢桿菌產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑并且具有SEQIDNo2的氨基酸序列(也參見Hartley,1988，分子生物學雜志202:913)。不用置疑本文使用的芽孢桿菌RNA酶抑制劑包括例如由Hartley描述的生物學活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑突變體(1993，生物化學32:5978-5984)。本文使用的芽孢桿菌RNA酶DNA(或芽孢桿菌RNA酶編碼序列)是具有編碼芽孢桿菌RNA酶的核苷酸序列的任何DNA片段。特別優選的芽孢桿菌RNA酶DNA是存在于pVE108的芽孢桿菌RNA酶DNA(WO92/09696)。芽孢桿菌RNA酶基因是植物可表達的嵌合基因，它包括可操作連接到合適的5’和3’調節區和包括植物聚腺苷酸化位點的3’區域的芽孢桿菌RNA酶DNA，所述調節區即包括由植物細胞的聚合酶識別的啟動子的啟動子區域。本文使用的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(或芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列)是具有編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的核苷酸序列的任何DNA片段。野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是編碼野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑的DNA，它具有SEQIDNo1的核苷酸序列(Hartley,1988，分子生物學雜志202:913)。芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因是植物可表達的嵌合基因，它包括可操作連接到合適的5’和3’調節區和包括植物聚腺苷酸化位點的3’區域的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，所述調節區即包括由植物細胞的聚合酶識別的啟動子的啟動子區域。如本文使用的，遺傳基因座是在植物的核基因組，即在特定的染色體中的給定的基因的位置。兩個基因座可以是在不同的染色體上，并且將獨立分離。兩個基因座可以位于相同的染色體上，那么通常被認為聯鎖(除非它們之間兩個出現足夠的重組)。內源性基因座是天然存在于植物中的基因座。外源性基因座是由于借助于遺傳轉化導入外源DNA而在植物中形成的基因座。在二倍體植物中，如在任何其它二倍體生物體中，兩個拷貝的基因存在于任何常染色體的基因座。任何基因可以以幾個變異狀態存在于核基因組稱作為等位基因。如果兩個相同的等位基因存在于一個基因座，該基因座被稱作為純合子，如果存在不同的等位基因，該基因座稱作為雜合子。一個基因座，或一套基因座的等位基因的組成是基因型。通常在一個基因座的任何等位基因以獨立的標記表示(例如R和-,S和-,-代表沒有基因)。通常外源基因座的特征在于存在和/或沒有外源DNA。通常顯性等位基因的特征為以大寫字母表示，通常與生物學活性基因產物(例如蛋白質)和可觀察到的表現型效果(例如R表示活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的產生)的存在相關。通過鑒別至少一個遺傳基因座的等位基因狀態能夠對植物的遺傳狀態進行定性。由存在于該基因座的兩個等位基因的標記(例如R/R或S/-)命名任何給定的基因座的基因型。兩個不連接的基因座的基因型能夠表示為各個基因座的基因型的序列(例如S/-,R/-)本文使用的術語雄性不育植物包含外源的“雄性不育基因座”，它含有雄性不育基因S，當該基因在植物細胞中表達時，使植物雄性不育，基本上不影響植物的生長和發育。優選的是雄性不育基因座在相同的遺傳基因座還包括至少一個第一標記基因，所述基因至少包括1)編碼第一標記RNA，蛋白質或多肽的第一標記DNA，當至少存在于植物的特定的組織或特定的細胞中時，使植物易于與其它植物分離，所述其它植物至少在特定的組織或特定的細胞中不含有由第一標記DNA編碼的第一標記RNA，蛋白質或多肽，和2)能夠指導第一標記DNA至少在特定的組織或特定的細胞中表達的第一標記啟動子；第一標記DNA是相同于第一標記啟動子和受其控制的轉錄單位。所述雄性不育基因在這樣的外源雄性不育基因座總是顯性等位基因。隱性等位基因對應于在植物的核基因組中沒有存在雄性不育基因。以前已經描述了在本發明的第一親代品系的雄性不育基因中可以使用的不育啟動子(EP0,344,029和EP0,412,911)。不育啟動子可以是任何啟動子，但是它至少應該在雄蕊細胞中是有活性的，特別是在氈絨層細胞中。特別有用的不育啟動子是在雄蕊細胞中有選擇性活性的，例如煙草的TA29基因的特異于氈絨層的啟動子(EP0,344,029)，該啟動子可以用于煙草，油菜，萵苣，菊苣，棉花，水稻，小麥和其它植物種類；來自于水稻的PT72,PT42和PE1啟動子，它可以用于水稻，玉米，小麥和其它植物種類(WO92/13956)；來自于玉米的PCA55啟動子，它可以用于玉米，水稻，小麥和其它植物種類(WO92/13957)；和鼠耳芥的特異于氈絨層的基因的A9啟動子(Wyatt等人，1992，植物分子生物學，19:611-922)。本發明是基于發現“恢復系能力”(恢復系有效地使各種各樣的ms品系恢復雄性可育的能力和效力)與在恢復系植物的雄蕊中，特別是在氈絨層細胞中產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量直接相關(并且由于包含于被恢復的植物的雄蕊，特別是氈絨層細胞)。恢復系的能力是重要的，因為有效的恢復系能夠用于使各種各樣的雄性不育系恢復雄性可育，其含量不同于在雄蕊中，特別是在氈絨層細胞中產生的芽孢桿菌RNA酶的量(由于雄性不育基因的表達)。在不同的ms品系中產生各種各樣的芽孢桿菌RNA酶的一個來源是由于位置的影響，即由于在不同的轉化體的核基因組中不同的插入位置ms基因的表達的變異。在不同的ms品系(在相同的遺傳基因座含有ms基因)中產生的芽孢桿菌RNA酶的變異的另一個來源是不同的ms品系的不同的遺傳背景。因此，當通過回交將來自于植物種類的一個品種的一個雄性不育品系的ms基因導入到相同(或密切相關)的植物種類的其它品種，以產生那些品種的ms品系時，ms基因被導入到不同的遺傳背景，這會影響表達ms基因的水平。當考慮不同的恢復系植物中的恢復基因的表達的變異時-(所述變異可起源于如上文指出的相同來源，即在不同的恢復系品系中的可育性恢復系基因的位置影響和/或不同的恢復系品系的不同的遺傳背景)，進一步增加了所觀察到的芽孢桿菌RNA酶產生的變異，和與此相關的可育性的恢復的問題。因此，為了獲得具有良好的恢復系能力的恢復系品系，具有植物可表達嵌合芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因是令人滿意的，所述基因以高水平表達，以在植物的雄蕊細胞，特別是在花藥細胞，尤其是在氈絨層細胞中產生大量的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。因此本發明提供了改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，在其它各點都相同的情況下，該DNA更有效地在植物細胞中表達-從而在那些細胞中它比野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA產生更高水平的活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質，特別是改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。因此，在至少一個植物種類的植物中(和優選的是在幾個植物種類，特別是幾個單子葉植物種類的植物中)以平均高于用類似的包括野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復系基因觀察到的水平表達改進的可育性恢復系基因。平均的較高水平的表達是指在不同的遺傳基因座和/或在不同的遺傳背景含有本發明的可育恢復基因的不同的恢復系品系的特定的器官(例如花藥)中產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量顯著地高于在不同的遺傳基因座和不同的遺傳背景含有包括野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的類似的可育性恢復系基因不同的恢復系品系的雄蕊中產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。通常本發明提供“改進的”芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼區，該編碼區具有含有作為第二密碼子的一個密碼子的核苷酸序列，所述的密碼子編碼選自于下列組纈氨酸(Val)，丙氨酸(Ala)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)的一個氨基酸。特別優選的是該第二密碼子編碼丙氨酸。這些密碼子以G起始，在位置+4(即芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列的第二密碼子的第一核苷酸)提供了最佳的轉譯起始位置。因此由改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的N-末端由Met-Xaa組成，其中Xaa是Ala,Val,Gly,Glu或Asp，并且優選的是Ala(更優選的是由GCC密碼子編碼的Ala)。優選的是，改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼在包括SEQIDNo2的氨基酸殘基3和90之間的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的例子是1)編碼具有SEQIDNo2的序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，其中氨基酸序列的第二氨基酸(Lys)被上文定義的Xaa所替代，和2)編碼具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。發現以非保守的方式修飾芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的N-末端對芽孢桿菌RNA酶抑制劑的特定的生物學活性沒有產生負面影響。事實上當在植物中表達時，特別是在單子葉植物(例如玉米，水稻和小麥)中表達時，這些改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA通常產生更多的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質，如通過雄蕊組織的Western印跡分析評估看到的。氈絨層細胞中產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的提高是由于芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的轉譯得到改進，而且其穩定性提高。還發現對芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列進行修飾以使該序列的％AT降低到低于40％導致產生改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，這樣可以在植物細胞中，特別是在氈絨層細胞中大大提高產生的具有芽孢桿菌RNA酶抑制劑活性的蛋白質的水平。本文中所述的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列通常被命名為“合成”的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列。優選的是合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有在大多數的植物種類中為優選的慣用的密碼子，其中例如可以在恢復系品系中使用。對于大多數N植物種類X1,X2,……XN優選的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的慣用的密碼子是指對于存在一個密碼子以上的各個氨基酸，在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中編碼該氨基酸的頻率最高的密碼子(該氨基酸的“芽孢桿菌RNA酶抑制劑密碼子”)，優選的是編碼該氨基酸的每個密碼子是在各個N/2以上的植物種類中，該密碼子具有綜合的頻率為1)至少是最少使用的密碼子的綜合頻率的兩倍和/或2)大于最多使用的密碼子的綜合頻率的一半。還優選的是對于存在多個密碼子的19個氨基酸的至少17，優選的是至少18，在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中使用頻率最高的密碼子，優選的是每個密碼子是在各個N植物種類中，該密碼子的綜合頻率為1)至少是最少使用的密碼子的綜合頻率的兩倍和/或2)大于最多使用的密碼子的綜合頻率的一半。實施例2描述了對于五個植物種類(N=5)即油菜，棉花，玉米，小麥和水稻，用最佳化的慣用密碼子設計的特定的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。為了本發明的目的，使用了由Ikemura公開的對于各個植物種類的綜合的密碼子頻率(Ikemura,1993，在“植物分子生物學Labfax”,Croy,ed.,BiosScientificPublishersLtd.，第37-48頁)。其中例如在恢復系中使用本發明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的優選的植物種類是油菜，棉花，玉米，水稻和小麥，特別是油菜，玉米和水稻，尤其是油菜和玉米。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA優選的是其進一步特征在于具有低頻率的CG二核苷酸和CNG三核苷酸，它們是在植物細胞中甲基化的靶。因此本發明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的特征為具有不超過7％的CG二核苷酸，優選的是具有不超過6％的CG二核苷酸，特別是具有5.5和6％之間的CG二核苷酸(在270-273堿基對的編碼序列中，它是約15或16的CG核苷酸)，和/或，不超過9.5％的CNG三核苷酸(其中N是任何核苷酸)，優選的是具有不超過9％的CNG三核苷酸，特別是具有8.5％和9％之間的CNG三核苷酸(在270-273堿基對的編碼序列中，它是約23-25的CNG三核苷酸)。優選的本發明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA進一步的特征在于具有不超過7，優選的是不超過5，特別是不超過3個的由僅一個種類的核苷酸組成的四核苷酸(即AAAA,CCCC,GGGG,TTTT)和具有不超過2，優選的是不超過1個的由僅一個種類的核苷酸組成的五核苷酸(即AAAAA,CCCCC,GGGGG,TTTTT)。本發明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA包括編碼野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑(SEQIDNo2)的那些序列，例如具有由ATG引導的SEQIDNo3的位置7和273之間的核苷酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。但是，本發明的優選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列，該序列編碼具有以Met-Xaa起始的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是纈氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或甘氨酸，并且優選的是其中Xaa是丙氨酸。優選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是由ATGGNN引導，優選的是由ATGGCN引導(其中N是任何核苷酸)的SEQIDNo3的位置7和273之間的核苷酸序列的DNA。特別優選的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA是具有SEQIDNo3的核苷酸序列的DNA。優選的是，合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列和野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列編碼具有至少80％序列等同性的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。為了本發明的目的，兩個相關的核苷酸序列(例如兩個芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA)或氨基酸序列(即兩個芽孢桿菌RNA酶抑制劑)的％序列等同性是指在兩個最佳化校正序列中具有相同殘基(×100)的位置的數量除以所比較的位置的數量。存在于一個序列但是不存在于另一個序列中的殘基的排列中的位置，即空缺被認為具有非相同殘基的位置。包括本發明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復系基因可以用于在不同的植物種類中產生恢復系，但是特別適用于在谷類，尤其是在玉米，水稻和小麥中產生恢復系。因此本發明還提供了N-末端由Met-Xaa(其中Xaa如上文定義)組成的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。特別優選的改進的本發明的芽孢桿菌RNA酶抑制劑包括SEQIDNo2的殘基3和90之間的序列，并且是例如1)具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，和2)具有SEQIDNo2的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中第二氨基酸(Lys)被如上定義的Xaa所替代。此外，不用說，可以對對應于SEQIDNo2的殘基3和90之間的序列的這些優選的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑區域進行修飾，只要總的氨基酸序列與SEQIDNo2至少具有80％，優選的是至少具有85％，特別是至少具有90％的序列相似性，并且只要在標準條件下改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑能夠抑制至少50％，優選的是至少75％，特別是至少90％的分泌的芽孢桿菌RNA酶的活性。如上說明的，在芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的N-末端的修飾(即導入由Met-Xaa組成的N-末端)是非保守的修飾，但是當在植物細胞中生產它們時它對本發明的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的特定的生物學活性沒有負面的影響。這由實施例6的SEQIDNo4的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑所舉證。因此本發明還提供了可育性恢復基因，其特征在于它們含有本發明的改進的和/或合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，并且可以用于生產植物種類的改進的轉基因恢復系植物，即具有良好的恢復能力的恢復系植物。不用說，可育性恢復基因的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA與其它編碼序列融合在一起轉譯，以便作為融合蛋白的一部分進行表達。原則上，在本發明的恢復系植物中可以使用任何啟動子作為可育性恢復基因的恢復系啟動子。唯一的前提是含有可育性，恢復系基因的這樣的恢復系植物能夠恢復雄性不育品系的可育性即能夠產生恢復的植物(包括雄性不育基因和可育性恢復基因)，所述植物的表現型是正常的并且雄性可育。這要求可育性恢復基因中的恢復啟動子應該至少是在植物的雄蕊細胞中具有活性的，所述植物中相應的雄性不育基因的不育啟動子能夠指導芽孢桿菌RNA酶DNA的表達。關于這一點，優選的是不育性啟動子和恢復啟動子是相同的(例如兩個TA29啟動子或兩個CA55啟動子)。但是，不育性啟動子可以是僅在氈絨層細胞中有活性的，而恢復啟動子在其它細胞中也是有活性的。例如，不育性啟動子可以是雄蕊選擇性的(例如TA29啟動子或CA55啟動子)，而恢復啟動子是組成型啟動子例如35S-tap啟動子，它是被修飾后在氈絨層細胞中有活性的35S啟動子(vanderMeer等人，1992，植物細胞4:253-262)。當然，本發明的改進的恢復系DNA除了用于恢復植物的雄性可育，還可以用于其它目的。關于這一點，本發明的改進和/或合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA可以在任何情況下使用，可以用于中和植物細胞的芽孢桿菌RNA酶活性，例如在EP0412911,WO93/19188,WO92/21757,WO93/25695和WO95/02157中描述的。為了上述應用，可以將芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA置于更適合的其它啟動子的轉錄控制下，可以使用類似于35S啟動子和農桿菌T-DNA的煙脂堿合成酶基因的啟動子。還可以使用基本的啟動子(即基本上僅含有TATA盒沒有其它調節增強子元件的植物啟動子)，甚至可以使用本發明的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，完全沒有啟動子(例如當計劃在轉化植物細胞中在內源性啟動子控制下轉錄芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA時)。用于恢復系植物中的可育性恢復基因R優選的是還包括至少第二標記基因，它至少包括1)編碼第二標記RNA，蛋白質或多肽的第二標記DNA，當至少存在于植物的特定的組織或特定的細胞中時，使植物易于與其它植物分離，所述其它植物至少在特定的組織或特定的細胞中不含有由第二標記DNA編碼的第二標記RNA，蛋白質或多肽，和2)能夠指導第二標記DNA至少在特定的組織或特定的細胞中表達的第二標記啟動子；第二標記DNA是相同于第二標記啟動子和受其控制的轉錄單位。因此本發明的恢復系植物含有外源的“恢復系基因座”，它含有包括本發明的改進的恢復系DNA的恢復系基因R。優選的恢復系基因座在相同的遺傳基因座還包括至少一個第二標記基因。優選的本發明的恢復系植物是單子葉恢復系植物，優選的是玉米，水稻或小麥植物，它們從其離體的花朵(例如水稻和小麥的圓錐花序，玉米的穗狀花序-參見實施例4)提取的每毫克總蛋白平均產生至少10納克，優選的是至少20納克，特剮是至少40納克(且至多100至200納克)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。尤其優選的本發明的恢復系植物將產生本發明的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，特別是具有SEQIDNo4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。可以用于本發明的第一和第二標記基因的第一和第二標記DNA和第一和第二標記啟動子也是熟知的(EP0344029；EP0412911)。關于這一點，優選的是第一和第二標記DNA是不同的，盡管第一和第二標記啟動子可以是相同的。優選的是提供的外源DNA例如可育性恢復系基因，雄性不育基因，或第一或第二標記基因在它們的編碼序列的下游(即3’)具有合適的3’轉錄調節序列和聚腺苷酸化信號，即分別是可育性恢復系DNA，雄性不育DNA，或第一或第二標記DNA。關于這一點，可以使用適用于獲得嵌合基因的表達的外源轉錄3’末端的形成和聚腺苷酸化信號。例如，可以使用基因例如基因7(Velten和Schell(1985)核酸研究13:6998)，章魚堿合成酶基因(DeGreve等人，1982,J.Mol.Appl.Genet.1:499；Gielen等人(1983)EMBOJ.3:835；Ingelbrecht等人，1989，植物細胞1:671)和根癌農桿菌Ti質粒的T-DNA區域的煙脂堿合成酶基因(DePicker等人，1982,J.Mol.APPl.Genet.1:561)，或苯基苯乙烯酮合成酶基因(Sommer和Saedler,1986,Mol.Gen.Genet.202:429-434),或CaMV19S/35S轉錄單位(Mogen等人，1990，植物細胞2:1261-1272)的外源的3’未轉譯末端。可育性恢復系基因，雄性不育基因，或本發明的第一或第二標記基因通常是外源DNA，優選的是外源嵌合DNA。關于這一點對于這樣的DNA的“外源”和“嵌合”具有相同于EP0344029和EP0412911描述的含義。利用去臂的并且由農桿菌攜帶的Ti質粒可以轉化植物細胞，特別是能夠被農桿菌感染的植物例如大多數雙子葉植物(例如歐洲油菜)和一些單子葉植物，所述載體含有雄性不育基因或可育性恢復系基因。利用在EP0116718和EP0270822中描述的程序可以實施這樣的轉化。優選的Ti質粒載體含有Ti質粒的T-DNA的邊界序列之間的外源DNA，或至少定位于右邊界序列的左邊的外源DNA。當然，利用例如直接的基因轉移(例如如EP0233247描述的)，花粉介導的轉化(例如在EP0270356,PCT專利公開“WO”85/01856，和美國專利4684611中描述的)，植物RNA病毒介導的轉化(例如在EP0067553和美國專利4407956中描述的)和脂質體介導的轉化(例如在美國專利4536475中描述的)，可以使用其它類型的載體以轉化植物細胞。利用由此獲得的能夠形成堅實的成胚愈傷組織(例如玉米的未成熟的胚)或成胚愈傷組織(例如玉米的I型愈傷組織)的受傷的或酶降解的完整組織，可以轉化(例如通過電穿孔)單子葉植物的細胞例如大多數谷類包括玉米，水稻，小麥，燕麥和大麥，例如在WO92/09696中描述的。如果待轉化的植物是玉米，還可以使用其它近年來研制的方法，例如由Fromm等人，1990，生物/技術8:833；Gordon-Kamm等人，1990，生物/技術2:603和GoHld等人，1991，植物生理學95:426描述的對于某些玉米的品系的方法。如果待轉化的植物是水稻，還可以使用其它近年來研制的方法，例如由Shimamoto等人，1989，自然學338:274；Datta等人，1990，生物/技術8:736和Hayashimoto等人，1990，植物生理學93:857描述的對于某些水稻品系的方法。將待轉化的細胞再生為成熟的植物，可以將獲得的轉化植物用于常規的育種計劃以產生多種具有相同特征的轉化植物或在相同的相關的植物種類的其它品種中導入雄性不育基因，或可育性恢復系基因。從轉化的植物獲得的種子含有作為穩定的基因組插入物的本發明嵌合基因。因此，當導入到植物種類的特定的品系或品種時，通過回交總是可以將本發明的雄性不育基因或可育性恢復系基因導入到任何其它品系或品種。當然當使該編碼DNA的慣常密碼子對于一系列的植物種類最佳化時，如用于制備本發明的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA，上面描述的用于降低編碼DNA的AT含量的方法也可以應用到在許多植物種類中需要其最佳表達的任何編碼序列。關于這一點，例如該方法可用于編碼殺蟲蛋白的蘇云金芽孢桿菌的基因，例如全長的和截斷的Crylab和Cry9C基因(EP0193259；EP0654075)。除非另有說明，通過在Sambrook等人，1989，“分子克隆實驗手冊”，冷泉港實驗室，和Ausubel等人，1994，“當前的分子生物學方案”，JohnWiley&amp;Sons描述的標準的程序實施操作重組DNA的所有實驗程序。將聚合酶鏈反應(“PCR”)用于克隆和/或擴增DNA片段。使用具有重疊延伸的PCR以構建嵌合基因(Horton等人，1989，基因77:61-68；Ho等人，1989，基因77:51-59)。使用的PCR反應都是在常規條件下，利用VentTM聚合酶完成的(Cat.No.254L-BiolabsNewEngland,Beverley,MA01915，美國)，所述聚合酶是從Thermococcuslitoralis分離到的(Neuner等人，1990,Arch.Microbiol.153:205-207)。根據已知的由Kramer和Fritz概括的規則設計寡核苷酸(1987，酶學方法154:350)，在AppliedBiosystems380ADNA合成儀(AppliedBiosystemsB.V.,Maarssen,Netherlands)上采用phosphoramidite方法(Beaucage和Caruthers,1981,TetrahedronLetters22:1859)合成。在說明書和下面的實施例中，參照下面的序列表和附圖序列表SEQIDNo1野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNASEQIDNo2野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑SEQIDNo3合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNASEQIDNo4改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑SEQIDNo5質粒pMV71SEQIDNo6質粒pLH43的相關部分SEQIDNo7質粒pTTS24的T-DNASEQIDNo8寡核苷酸CASOLX1SEQIDNo9寡核苷酸CASOLX2SEQIDNo10質粒pLH48在參照這些核苷酸和氨基酸序列時，應該注意到位置X和Y之間的序列(或另一種可選的方法從位置X到位置Y的序列)是包括在位置X和Y的殘基的序列。利用在序列表中使用的縮寫命名功能性DNA元件。實施例實施例1改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的制備通過位點特異性誘變在野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑的第一密碼子(ATG)和第二密碼子(AAA)之間插入丙氨酸密碼子GCC而制備改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。因此改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，當與野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑比較時，改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑具有改變的N-末端，它由Met-Ala-Lys組成(而不是野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑中的Met-Lys)。N-末端的非保守修飾不會影響植物細胞中改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的生物學活性(參見實施例6)。實施例2合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的合成和制備根據下列標準設計編碼實施例1的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA-在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑中A和T核苷酸的百分數應該低于40％(野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有51.6的％AT)。AT豐富的基因具有包括聚腺苷酸化信號和內含子識別序列的較高的可能性，它能阻止或降低特別是長編碼序列(例如Bt編碼序列)在植物細胞中的表達。-盡管C和G核苷酸的增加，CG二核苷酸和CNG三核苷酸的量應該盡可能低。這是因為CG二核苷酸和CNG三核苷酸是甲基化的靶，它可以在植物細胞中使基因失活。-慣用密碼子應該盡可能地在許多種類的植物中最佳化，特別是在油菜，棉花，玉米，水稻和小麥中。因此，對于各個氨基酸，選擇在芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中優選使用的一個密碼子(或幾個密碼子)，在大多數植物種類中，所述密碼子具有的頻率至少是最少使用的密碼子的頻率的兩倍以上和/或至少是最多使用的密碼子的頻率的一半以上。因此，對于各個植物種類和對于各個氨基酸，制作一個密碼子表，其中具有的頻率至少是在所述植物種類中最少使用的密碼子的頻率的兩倍以上和/或至少是在所述植物種類中最多使用的密碼子的頻率的一半以上(將符合該標準的密碼子命名為所述植物種類的最佳密碼子)。在大多數植物種類中是最佳密碼子的密碼子稱作為在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中所述氨基酸的優勢密碼子，優選的是唯一的密碼子。方便的是，在該分析中使用的密碼子的頻率是所列出的那些(上文)。-避免大于4個相同核苷酸以上的延伸。因此獲得了具有SEQIDNo.3的核苷酸序列的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。這種合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有38.4的％AT，不過僅含有16CG二核苷酸和24CNG三核苷酸。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA不含有潛在的植物聚腺苷酸化信號或內含子拼接位點。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的慣用密碼子似乎適合于在至少油菜，棉花，玉米，水稻和小麥中表述(表1)。對于其中存在多個密碼子的18個氨基酸，在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中17個氨基酸優選地被在這五個植物種類的各個中是最佳密碼子的一個密碼子所編碼。事實上，在這五個植物種類的至少三個中，所有的存在多個密碼子的氨基酸在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中優選地被一個最佳密碼子所編碼。合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA只含有1CCCCC和1GGGG延伸。為了克隆的目的，SEQIDNo.3的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑使用下面的唯一的限制性位點NcoⅠ,BspE1和Kasl。實施例3改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA在玉米細胞中的表達用包被了質粒pLH43或質粒pMV71的微彈(金顆粒)，用Bio-RadPDS-1000/HE顆粒槍(Bio-Rad實驗室，Hercules，加里福尼亞，美國)轟擊培養的BlackMexicanSweet(BMS)玉米細胞，如下所述。將BMS懸浮細胞置于合適的濾膜，并且用常規程序進行轟擊(Kirihara.1994，“玉米手冊”，Freeling和Walbot,SpringerVerlag，第690-694頁)，所述程序進行了包括滲透壓預處理的修飾(Russel等人，1992，體外28:97-105)。利用由供應商手冊描述的程序，用含有5∶1比例的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA和質粒pAct1-D的合適的質粒DNA的混合物包被金顆粒(McElroy等人，1990，植物細胞2:163-171)。pAct1-D是含有gus基因(編碼β-葡糖苷酸酶)的質粒，所述基因處于水稻肌動蛋白基因的啟動子的控制下，所述基因基本上具有描述于SEQIDNo.5的位置1999到3400之間的序列。對于各個質粒，轟擊2-3個濾膜。轟擊以后24小時，收集來自于各個濾膜的細胞，通過在液氮中研磨捕獲。將各個濾膜的捕獲的細胞分為二等份，一份用于芽孢桿菌RNA酶抑制劑檢測，另一份用于GUS檢測。來自于各個轟擊的濾膜的被捕獲細胞的一半，在提取緩沖液(50mMTris/HClpH7.5,5％甘油，100mMKCl,1mMbenzamidin.HCl,5mMe-氨基-n-已酸，10mMEDTA,10mMEGTA,1微克/毫升抗蛋白酶，1微克/毫升亮抑蛋白酶肽，14mMβ-巰基乙醇，1.5％聚乙烯基聚吡咯烷酮，1mMPMSF)中提取總可溶性細胞蛋白質。采用Bio-RadBradford檢測試驗測定蛋白質的濃度。每個樣品的50微克的蛋白質裝載于18％SDS-聚丙烯酰胺凝膠并且通過電泳進行分離。將0.1,0.5,2.5，和5納克的純化的芽孢桿菌RNA酶抑制劑裝載于凝膠上作為陽性對照。然后利用TGM-緩沖液(25mMTrispH8.3,192mM甘氨酸，20％v/v甲醇)，以60V進行2小時，將蛋白質電吸印到HybondC。然后將濾膜在0.5％PBS-吐溫20中首先保溫2小時，然后在一級抗體的溶液(在PBS-0.5％吐溫20中1/1000稀釋的多克隆兔IgG抗-芽孢桿菌RNA酶抑制劑抗體)中保溫過夜。然后將濾膜在PBS中洗滌4次，每次5分鐘，然后在驢抗兔IgG，辣根過氧化物酶連接(Amersham,Buckinghamshire，英國)的在PBS-0.5％吐溫20中1/1000稀釋的溶液中保溫1小時。然后再將濾膜在PBS中洗滌4次，每次5分鐘，然后利用ECL檢測系統(Amersham)檢測蛋白質。通過放射自顯影的密度計掃描測定芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。平行試驗，采用熒光團檢測方法，檢測在從各個轟擊的濾膜獲得的另一半捕獲細胞提取的蛋白質中β-葡糖苷酸酶的活性(Jefferson,1987，植物分子生物學報道5:387-405)。通過比較每(任意的)單位GUS活性中芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量確定特定的質粒產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。pMV71是具有SEQIDNo.5的核苷酸序列的質粒，并且含有實施例1的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。將該變異體芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA可操作連接到水稻肌動蛋白啟動子和農桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶3’未轉譯末端。pLH43是具有SEQIDNo.5的核苷酸序列的質粒，其中核苷酸3399和4021之間的序列被SEQIDNo.6的核苷酸序列替代。pLH43含有可操作連接到水稻肌動蛋白啟動子和農桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶3’未轉譯末端的實施例2的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo.3)。pTS410是具有SEQIDNo.5的核苷酸序列的質粒，其中核苷酸3404到3406(即pMV71的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的第二密碼子)已被缺失。上面實驗的結果列于表2，其中顯示來自于各個轟擊試驗的測定結果。當與在pTS410的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA導入后產生的(野生型)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質相比，易于看到pMV71和pLH43的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的導入平均導致顯著高地產生(改進的)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。另外，可以看到，當與在pMV71的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA導入后產生的(也改進的)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質相比，在玉米細胞中導入pLH43的改進的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA導致在那些細胞中顯著高地產生(改進的)芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。實施例4改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA在水稻植物中的表達利用質粒pTS172，基本上如WO92/13956描述的，獲得了四個轉基因的雄性不育水稻的栽培品種Kochihibiki品系。質粒pTS172含有下面的嵌合基因P35S-bar-3’g7和PE1-芽孢桿菌RNA酶-3’nos并且可以通過將用BstEⅡ和MscⅠ消化的pTS173的大片段連接到pJVR2-E1的小BstEⅡ-MscⅠ片段上從pTS173(見下)獲得。這些品系被命名為K104,K107,K109和K111。基本上按照WO92/13956描述的方法，利用質粒pTS173獲得7個轉基因的雄性可育的恢復系水稻植物Chiyonishiki栽培品種。所述質粒含有下面的嵌合基因P35S-bar-3’g7和PE1-野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑-3’nos。通過用35S啟動子和pTTS24的嵌合bar基因的3’未轉譯末端替代35S啟動子和pJVR3-E1的嵌合bar基因的3’未轉譯末端，可從pJVR3-E1衍生pTS173(WO92/13956)。從質粒pTTS24的T-DNA插入物(SEQIDNo.7)，利用寡核苷酸引物CASOLX1(SEQIDNo.8)，它重疊bar基因的KpnⅠ位點，和CASOLX2(SEQIDNo.9)，采用PCR擴增含有T-DNA基因7的3’末端的DNA片段。用AatⅡ和KpnⅠ切割PCR產物，并且連接到用AatⅡ和KpnⅠ切割的質粒pJVR3-E1的大片段上。從該獲得的質粒，通過由來自于pTTS24(SEQIDNo.7的位置880到2281)的相應的NcoⅠ-NotⅠ片段替代較小的NcoⅠ+NotⅠ片段(含有P35S)，導致產生pTS173。獲得的品系命名為C111,C113,C117,C118,C120,C121和C125。因此所有這些植物含有處于E1啟動子控制下的SEQIDNo.1的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(WO92/13956)。利用農桿菌介導的受傷的堅實的成胚愈傷組織(從水稻栽培品種Kochihibiki未成熟的胚獲得的)的轉化獲得32個另外的恢復系植物(WO92/09696)。用于轉化的農桿菌菌株是從其野生型Ti-質粒恢復的并且含有質粒pGV4000和pTTS24的Ach5菌株(Genetello等人，1977，自然學265:561-563)。pTTS24是中間體克隆載體，它在其必要的特性上類似pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele,1989,NAR17:19-29)，但是由于缺失β-內酰胺酶基因和含有具有SEQIDNo.7的核苷酸序列的T-DNA，其主要部分不同于pGSC1700。pGV4000是去臂的Ti-質粒，它來自于pMP90(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383-396)并且含有允許與pTTS24的相應的區域同源重組的區域。將所有含有實施例2的處于E1啟動子的控制下的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo.3)的這些植物命名為“OSC”數，如在表3中使用的。在所有恢復系品系中測定芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量。每個品系在液氮中研碎單個植物的1-2個未成熟的圓錐花序(即圓錐花序，其中大多數的小穗約為3.5-4.5毫米長)。如實施例3描述的方法提取和檢測蛋白質。結果概括于表3。可以看到含有SEQIDNo.3的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復系品系產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑明顯高于含有SEQIDNo.1的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的那些品系。芽孢桿菌RNA酶抑制劑mRNA的量直接與圓錐花序中芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量相關得到證實(數據沒有顯示)。進一步證實芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的產生有效地限制到圓錐花序的花(數據沒有顯示)。選定的恢復系品系與四個雄性不育品系雜交。觀察到恢復系品系的恢復能力與所述花中產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量相關。觀察到每毫克提取的蛋白質產生4和10納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑之間的品系能夠部分恢復微孢子的發育為雄性不育品系，在這種意義上，“恢復系植物”產生非存活的花粉(雄性不育植物完全不產生花粉)。對于所有檢測的雄性不育品系觀察到每毫克提取的蛋白質產生50納克或更多的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的恢復系品系能夠完全恢復可育性，即在自我授粉后，所有恢復的子代植物產生完全存活的和有功能的花粉，和正常的種子。選定的恢復系品系也是自我授粉的并且從轉基因子代植物收集到未成熟的圓錐花序。如由所產生的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量測定的表達水平至少等于，和在許多植物中大于在初級轉化中測定的量。通常，這些觀察結果證實芽孢桿菌RNA酶抑制劑表達水平穩定地轉移到子代植物。實施例5改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA在玉米植物中的表達基本上按照WO92/13956描述的方法，利用質粒pVE108獲得命名為MS3的轉基因雄性不育玉米品系。基本上按照WO95/34634描述的方法獲得含有處于TA29啟動子(EP344,029)或CA55啟動子(WO92/13957)控制下的SEQIDNo1的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的幾個轉基因雄性可育恢復系玉米植物。特別是，通過用質粒pCOL100和pDE110(WO92/34634)轉化玉米獲得七個恢復系品系，pDE110含有可操作連接到如SEQIDNo1描述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA上的TA29啟動子。當與MS2植物雜交時，恢復是不完全的，因為最多75％的花藥產生存活的花粉(這證明MS3品系特別難于恢復，因為用其它雄性不育品系獲得了良好的恢復程度-數據未顯示)。類似地，通過用質粒pLH48(與選自于pCOL9S或PLH52或p35S-Bperu或pCOL11(WO92/34634)的質粒一起)轉化玉米獲得了六個轉基因恢復系玉米品系。這些恢復品系都至少含有處于TA29啟動子控制下的實施例2的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo3)。六個恢復品系與MS3植物雜交，對于四個恢復品系觀察到完全恢復。將這四個恢復系品系之一命名為RZM583-0101。由轉基因品系RZM583-0101給轉基因品系MS3授粉，通過PCR篩選識別含有嵌合芽孢桿菌RNA酶基因和嵌合芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的子代植物。將那些可育性恢復的子代植物用于給MS3植物授粉。在該最后的雜交的90個子代植物中，識別出15個植物(通過定量的Southern印跡分析)為MS3的嵌合芽孢桿菌RNA酶基因的純合子。在這些中，不含有RZM583-0101的嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的植物是雄性不育的，而含有RZM583-0101的嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的那些植物是完全雄性可育的。這證實了由包括改進的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的嵌合的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因可以完全恢復在純合條件下含有嵌合的芽孢桿菌RNA酶基因的植物的可育性。因此，可以總結出，含有改進的合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復品系具有顯著好的恢復能力。基本上按照實施例3描述的方法測定子代恢復系植物的未成熟穗狀雄花(包括單核階段的微孢子)的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。觀察到在含有改進的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復系植物的穗狀雄花中芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量顯著地高于含有野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的恢復系植物的穗狀雄花中芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量。例如在含有野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的植物中，測定芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量低于20納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑/毫克總蛋白。相反，在含有改進的合成芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的兩個品系中，測定未成熟的穗狀雄花的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的量分別是210和100納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑/毫克總蛋白。實施例6在油菜的雄蕊細胞中生產時野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑和改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的活性利用農桿菌介導的轉化，用質粒pTHW118或pTTS139轉化油菜植物(栽培品種Drakkar)。質粒pTHW118含有處于TA29啟動子控制下的野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA(SEQIDNo1)。質粒pTTS139含有包括野生型的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的第一和第二密碼子之間的附加的GCC丙氨酸密碼子的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。因此，pTTS139中的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼SEQIDNo4的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。用pTHW118轉化的兩個油菜品系，分別命名為DBN366-0011和DBN366-0029，用pTTS139轉化的兩個油菜品系分別命名為DBN342-1010和DNB367-0035，選擇上述品系進行定量分析。從所述植物分離長度約為3-4毫米的油菜花芽，并且在液氮中研碎。提取蛋白質，基本上按照實施例3描述的方法，測定提取的總蛋白質的量，以及采用Western印跡可檢測的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。表4顯示了在各個品系中存在可提取的總蛋白質的量(欄4)和芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量(欄2)。基本上按照Fitzgerald和Hartley描述的方法(1993，見上文)測定芽孢桿菌RNA酶抑制劑的活性。向600微升的TE緩沖液(10mMTris/HClpH8.0；1mMEDTA)中加入-20微升的含有10微克/毫升牛血清白蛋白和0.1微克/毫升的芽孢桿菌RNA酶的0.02M乙酸銨pH8.0溶液，-“X”微升的5倍稀釋的從花芽提取的蛋白質(“X”分別是0,4,8,12,16,20)。在混合和等待約1分鐘之后，加入6微升的10倍稀釋的含有溶于TE緩沖液中的0.4微克/毫升的聚乙烯醇腺苷磷酸的原液。將最后的溶液混合并且立即轉移到透明小容器，記錄1-2分鐘內熒光的增加。以起始時熒光的增加值/分鐘相對于“X”(含有芽孢桿菌RNA酶抑制劑溶液的體積)作圖。在各種情況下，如預期的獲得了線性關系。計算X-軸的隱性品系的截距(表4，欄3)這代表“X”的體積，它含有足夠的芽孢桿菌RNA酶抑制劑以完全中和2納克的芽孢桿菌RNA酶(即含有芽孢桿菌RNA酶抑制劑的摩爾量的體積，它相當于2納克的芽孢桿菌RNA酶)。由此可以測定花芽中“活性”芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量(表4，欄5)，以及“活性”芽孢桿菌RNA酶抑制劑與由Western印跡測定的總芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的比例(表4，欄6)。根據這些比例，能夠推導出改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的活性至少相當于野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量。但是，在用pTHW118轉化的品系(表達野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑)中，平均比例是0.27(標準偏差0.08)，而在用pTTS139轉化的品系中，平均比例是0.39(標準偏差0.08)。兩個品系類型的平均比例之間的差異在統計學上是顯著的(t=-26,p＜0.005)。根據這一點，能夠總結出當在油菜花芽中產生時，與野生型芽孢桿菌RNA酶抑制劑相比，改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑通常產生較高水平的活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑。本申請中引用的所有出版物均引入本文作為參考。表1a)+表示在選定的植物中，密碼子是該植物中的最佳密碼子，即在所述植物中該密碼子的頻率至少為該植物中最低頻率的密碼子的頻率的兩倍和/或至少是該植物中最多使用的密碼子的頻率的50％。在該植物種類中密碼子的頻率是由Ikemura列出(千分之)的那些(見上文)-表示在選定的植物中，該密碼子在如上定義的植物中不是最佳密碼子b)存在多個密碼子的氨基酸(不是Trp,Met)c)在合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA中使用的編碼該氨基酸的SEQIDNo.3的密碼子d)由這種SEQIDNo.3的密碼子編碼的氨基酸的數目表2a)由Western印跡測定的50微克負載的蛋白質中芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量b)Gus活性以任意單位計c)正確的芽孢桿菌RNA酶抑制劑納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑/GUS活性單位。表3</tables>a)低于檢測限制值表41)由Western印跡測定的。2)X-截距3)從花芽提取的蛋白質的總量(對于芽孢桿菌RNA酶抑制劑活性測定稀釋了5倍)4)評估的活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑的量(約16.36納克/毫升與20納克/毫升芽孢桿菌RNA酶等摩爾)5)活性芽孢桿菌RNA酶抑制劑(參見上述4)與總芽孢桿菌RNA酶抑制劑(參見上述1))的比例序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名稱植物遺傳系統N.V.(B)街道Plateaustraat22(C)城市Ghent(E)國家比利時(F)郵編(ZIP):B-9000(G)電話3292358411(H)傳真3292231923(ⅱ)發明名稱恢復基因(ⅲ)序列數10(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC相容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQIDNO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度270個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅲ)推測不是(ⅳ)反義不是(ⅵ)原始來源(A)生物體解淀粉芽孢桿菌(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..270(D)其它資料/功能=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑”/產物=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1ATGAAAAAAGCAGTCATTAACGGGGAACAAATCAGAAGTATCAGCGAC48MetLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArgSerIleSerAsp151015CTCCACCAGACATTGAAAAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAATACTACGGT96LeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyrGly202530GAAAACCTGGACGCTTTATGGGATTGTCTGACCGGATGGGTGGAGTAC144GluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGluTyr354045CCGCTCGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAGCAGCTGACT192ProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeuThr505560GAAAATGGCGCCGAGAGTGTGCTTCAGGTTTTCCGTGAAGCGAAAGCG240GluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArgGluAlaLysAla65707580GAAGGCTGCGACATCACCATCATACTTTCT270GluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer8590(2)SEQIDNO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度90個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2MetLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArgSerIleSerAsp151015LeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyrGly202530GluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGluTyr354045ProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeuThr505560GluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArgGluAlaLysAla65707580GluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer8590(2)SEQIDNO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度273個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅲ)推測不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..273(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3ATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGC48MetAlaLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArGSerIleSer95100105GACCTCCACCAGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTAC96AspLeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyr110115120GGTGAGAACCTCGACGCCCTCTGGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAG144GlyGluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGlu125130135TACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAGTTCGAGCAGAGCAAGCAGCTC192TyrProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeu140145150ACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGGGAGGCCAAG240ThrGluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArGGluAlaLys0GCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCC273AlaGluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer175180(2)SEQIDNO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度91個氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4MetAlaLysLysAlaValIleAsnGlyGluGlnIleArgSerIleSer151015AspLeuHisGlnThrLeuLysLysGluLeuAlaLeuProGluTyrTyr202530GlyGluAsnLeuAspAlaLeuTrpAspCysLeuThrGlyTrpValGlu354045TyrProLeuValLeuGluTrpArgGlnPheGluGlnSerLysGlnLeu505560ThrGluAsnGlyAlaGluSerValLeuGlnValPheArgGluAlaLys65707580AlaGluGlyCysAspIleThrIleIleLeuSer8590(2)SEQIDNO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度4032個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“質粒pMV71”(ⅲ)推測不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置1999..3400(D)其它資料/標記=PRAC1/注解=“水稻肌動蛋白基因的啟動子區域-在引導序列中含有內含子”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置3401..3676(D)其它資料/標記=芽孢桿菌RNA酶抑制劑/注解=“芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置3677..4003(D)其它資料/標記=3’nos/注解=“含有農桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’未轉譯末端的區域”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置3399..3404(D)其它資料/標記=NcoⅠ/注解=“NcoⅠ識別位點”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置4016..4021(D)其它資料/標記=KpnⅠ/注解=“KpnⅠ識別位點”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5CAAGCTTGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTAT60TTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTC120AATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCT180TTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAG240ATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTA300AGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTC360TGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCA420TACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGG480ATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGG540CCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA600TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAA660ACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAA720CTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATA780AAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAAT840CTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGC900CCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATA960GACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTT1020ACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGA1080AGATCCTTTTTGGCTCGAGTCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACT1140GAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCG1200TAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATC1260AAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATA1320CTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTA1380CATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTC1440TTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG1500GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTAC1560AGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGG1620TAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGT1680ATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCT1740CGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG1800CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATA1860ACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCA1920GCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGC1980GTTGGCCTGATCAGAATTTCGAGGTCATTCATATGCTTGAGAAGAGAGTCGGGATAGTCC2040AAAATAAAACAAAGGTAAGATTACCTGGTCAAAAGTGAAAACATCAGTTAAAAGGTGGTA2100TAAAGTAAAATATCGGTAATAAAAGGTGGCCCAAAGTGAAATTTACTCTTTTCTACTATT2160ATAAAAATTGAGGATGTTTTTGTCGGTACTTTGATACGTCATTTTTGTATGAATTGGTTT2220TTAAGTTTATTCGCTTTTGGAAATGCATATCTGTATTTGAGTCGGGTTTTAAGTTCGTTT2280GCTTTTGTAAATACAGAGGGATTTGTATAAGAAATATCTTTAAAAAAACCCATATGCTAA2340TTTGACATAATTTTTGAGAAAAATATATATTCAGGCGAATTCTCACAATGAACAATAATA2400AGATTAAAATAGCTTTCCCCCGTTGCAGCGCATGGGTATTTTTTCTAGTAAAAATA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GATGCAATTAGTCCTGA1620ATCTTTTGACTGCATCTTTAACCTTCTTGGGAAGGTATTTGATCTCCTGGAGATTGTTAC1680TCGGGTAGATCGTCTTGATGAGACCTGCTGCGTAGGCCTCTCTAACCATCTGTGGGTCAG1740CATTCTTTCTGAAATTGAAGAGGCTAACCTTCTCATTATCAGTGGTGAACATAGTGTCGT1800CACCTTCACCTTCGAACTTCCTTCCTAGATCGTAAAGATAGAGGAAATCGTCCATTGTAA1860TCTCCGGGGCAAAGGAGATCTCTTTTGGGGCTGGATCACTGCTGGGCCTTTTGGTTCCTA1920GCGTGAGCCAGTGGGCTTTTTGCTTTGGTGGGCTTGTTAGGGCCTTAGCAAAGCTCTTGG1980GCTTGAGTTGAGCTTCTCCTTTGGGGATGAAGTTCAACCTGTCTGTTTGCTGACTTGTTG2040TGTACGCGTCAGCTGCTGCTCTTGCCTCTGTAATAGTGGCAAATTTCTTGTGTGCAACTC2100CGGGAACGCCGTTTGTTGCCGCCTTTGTACAACCCCAGTCATCGTATATACCGGCATGTG2160GACCGTTATACACAACGTAGTAGTTGATATGAGGGTGTTGAATACCCGATTCTGCTCTGA2220GAGGAGCAACTGTGCTGTTAAGCTCAGATTTTTGTGGGCCCGGGCCTAGGCTAGCGGCCG2280CAGATCCTTCTGTGTGATTGTTTTATTAAAATTTAATATTTATCTGGAATACCTACCAAT2340ATATAGTAGACTTGTCAAGCTGCAAGAACTTCCAATCGCCGACAATACCAATAGAGATCC2400AACCACCTTAATATCATAAACAATCTGATTGTTAGTCCAGAACTATATTGAGTAGTGAAC2460AACAATAGCACATTAACATTATGAGGATTATTGGCTAACTCTGCAATTCAATATTCTGAT2520GCGTCTAATCTGGTCAATTTTAGCGCTCCAGAAAGAATTGCACAATCCTTGGACAATGTT2580GGCACTGGAACTGTTGCATGTTTTTACATCTCTTATTAACGTAGCAAAGGAGTAGATTAT2640TATGTACCAGGAGAAATCTCTTCAGATCCTTTCCACATGCAATGTCGTAAAGAACAGATA2700CAGTGTACGTTAGTTTGTAATGGACGGTCAATGCCATTTCTCTGAAGGCATGTTCAGAGA2760TGATGATTTCTGGGATCCTTGGAGGGGCCCTGAAATTCGGAAACAGTTAGTTGAGTTTTA2820GTACCTAATGTCTTGCGTTATACTACGTGAAATGCCATTTCTGTAAGCTGAGTTTTCTAC2880CATCTCCACAGGAAATAAAGCTAATACCTGTCCAAGAGTGGTGCGGCATTTGACCAAATG2940AAGATCACAAGCATGGCAAGAATGGCAATCTGGCAAAGGAGCGGAATTATATTGTATTCT3000ACTACATCGAACAGGAACCATATCAATGTTGCCCCAGCAAGGACCCCCGCAGATAAGTTC3060CTGTTCTTCCACAGCAGAATATCCGCAACTGCATAGCTCCCAACAATGAAATCCAAAACC3120ACATCGGCTCAGAGAGAAGTTATGATAAAAGGCACTAATTCTGAATAATTTCCTAGAAAG3180CGAATAATAATAGCACACCTTGACCTCCACCAAGAAGCTTGTGGATCGACTTGTGCCCAT3240GAAATGGCATTCTGACATTCTGGTCACTGTCAGAATCTCTCGGAAAATGAGGAGGCATAG3300CTTCGTGTGTGTATGTGTGTGGGATATTACGCTGCTAAAACTTTGTGTTTCTGATCGATC3360TGGTTAGAGAGCATCGTCTTTATAAGCACTTAAAAATGGTAGTATAATCTCTCAAGGAGC3420CTATACTGCCAAGGAAAGGATAGCTTGGCCTGTGGGGATTGAGCCGTTGAAGGGAACAAA3480CGAATACAGTTACCTTACCAGATGTTTGCCACGACATGGGCAACGTCATTGCTAGACCAA3540GAAGGCAAGAAGCAAAGTTTAGCTGTCAAAAAAGATATGCTAGAGGCTTTCCAGAATATG3600TTCTATCTCAGCCAGACCAATGGGGGCAAAATTTACTACTATTTGCCATACATTAACCAC3660GTAAAAGTCCTACACTCAACCTAACTGTTGAACGGTCCTGTTCTGGCCAACGGTGAGAAT3720GCACCTAATGGACGGGACAACACTTCTTTCACCGTGCTACTGCTACATCCTGTAGACGGT3780GGACGCGTGAGGTGCTTTCGCCATGACCGTCCTTGGTTGTTGCAGTCACTTGCGCACGCT3840TGCACCGTGACTCACCTGCCACATTGCCCCCGCCGTCGCCGGCGCCTACAAAAGCCACAC3900ACGCACGCCGGCCACGATAACCCATCCTAGCATCCCGGTGTCCAGCAAGAGATCCATCAA3960GCCGTCGCGATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGCGAC4020CTCCACCAGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTACGGTGAGAACCTCGAC4080GCCCTCTGGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAGTACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAG4140TTCGAGCAGAGCAAGCAGCTCACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGG4200GAGGCCAAGGCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCCTGATGGATCTGGGGCCGC4260TCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGTCGGGTTGGGTTATTTTCTTATTTCCGTA4320ATAAAAAAGTGGACATGGTTACCTATTATTGTGATGTGTGCTGCATGTGAGCTATATTGG4380CGATTTCTCTCTTGTAACGCTTTGTACTTGTACCGTTTCGTTGTGATCATTGAAATAAAG4440GCCTATATAAAAATAATTTATGTTATTTGTTGGTTTATGTGTGTGTTTTTTTTTTTTTTT4500TTTAGTCAAAATATTTAAGTATTTCTATATAAATCTTTTGCAAGTTTTTTAAGTCATGGA4560GGAGATGTTATGAATTCTGTAATATAGTAAAAATATTACGTGAAAAACCAGAGGATCCGG4620GGAATTCCCAGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGA4680GAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGC4740ATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAATGATT4800TTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTTTTATA4860ATGCCAACTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCATCCGGATTCTCTGAGCCCACCGTGTTCAC4920CACCACCGTGGTGCTGTTACGTCTGGCTTTCAGCTGAATGGTGCAGTTCTGTACCGGTTT4980TCCTGTGCCGTCTTTCAGGACTCCTGAAATCTTTACTGCCATATTCACCCCACAAAAAAG5040CCCACCGGTTCCGGCGGGCTGTCATAACACTGTGTTACCTGGCTAATCAGAATTTATAAC5100CGACCCCAACGATGAATCCGTCAGTACGCCAGTCGCCACTGCCGGAGCCTTCATAAGCAA5160TATCAACAACGACGGACGCTGCCGGATTAATCTGTATACCTGCACTCCACGCCACTGAGG5220TATGCCGCATTGCACTTTCGTCCCTGGCAGTGGTCGTCTCTTTCATATACCCGACTCTAG5280AGGATCCCCCGGGTACCGAGCTCTCCCCAGATCTGCATGGAGCCATTTACAATTGAATAT5340ATCCTGCCG5349(2)SEQIDNO:8的資料(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸CASOLX1”(ⅲ)推測不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置10..15(D)其它資料/標記=KpnⅠ/注解=“KpnⅠ識別位點”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:8的資料CAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCC24(2)SEQIDNO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸CASOLX2”(ⅲ)推測不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置5..10(D)其它資料/標記=AatⅡ/注解=“AatⅡ識別位點”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置30..50(D)其它資料/標記=3’g7/注解=“含有農桿菌T-DNA的3’未轉譯末端的部分”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:9CCCCGACGTCAAGCTTGAATTCGCGATACGTACATGGTCGATAAGAAAAG50(2)(2)SEQIDNO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長度5611個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“質粒pLH48”(ⅲ)推測不是(ⅳ)反義不是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置補體(39..317)(D)其它資料/標記=3’nos/注解=“含有農桿菌T-DNA的胭脂堿合成酶基因的3’未轉譯末端的區域”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置補體(318..869)(D)其它資料/標記=bar/注解=“編碼膦蘇菌素乙酰基轉移酶的區域”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置補體(870..1702)(D)其它資料/標記=P35S/注解=“花椰菜花葉病毒的35S啟動子”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置1740..2284(D)其它資料/標記=PTA29/注解=“煙草TA29基因的啟動子”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置2285..2560(D)其它資料/標記=synb*/注解=“改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵-(B)位置2561..2892(D)其它資料/標記=3’chs/注解=“含有苯基苯乙烯酮合成酶基因的3’未轉譯末端的區域”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:10AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA60CCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAA120TGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACA180TGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGAC240CGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCTGCTTCGG300ATCCTAGACGCGTGAGATCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGC360AGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCC420GCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCG480TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGC540AGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACG600GTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATG660CCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACG720AGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTC780TCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGG840ATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGTCCATGGTTATAGAGAGAGAGATAGATTTATAGAGA900GAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAG960GGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC1020AATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGG1080GTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAATGATAGCCTTTCCTT1140TATCGCAATGATGGCATTTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTCGATGAAGT1200GACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGAAATTATCCTTTGTTGAAAAG1260TCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGACATTTTTGGAGTAGACCAGAG1320TGTCGTGCTCCACCATGTTGACGAAGATTTTCTTCTTGTCATTGAGTCGTAAAAGACTCT1380GTATGAACTGTTCGCCAGTCTTCACGGCGAGTTCTGTTAGATCCTCGATTTGAATCTTAG1440ACTCCATGCATGGCCTTAGATTCAGTAGGAACTACCTTTTTAGAGACTCCAATCTCTATT1500ACTTGCCTTGGTTTATGAAGCAAGCCTTGAATCGTCCATACTGGAATAGTACTTCTGATC1560TTGAGAAATATGTCTTTCTCTGTGTTCTTGATGCAATTAGTCCTGAATCTTTTGACTGCA1620TCTTTAACCTTCTTGGGAAGGTATTTGATCTCCTGGAGATTGTTACTCGGGTAGATCGTC1680TTGATGAGACCTGCTGCGTAGGAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCA1740TCTAGCTAAGTATAACTGGATAATTTGCATTAACAGATTGAATATAGTGCCAAACAAGAA1800GGGACAATTGACTTGTCACTTTATGAAAGATGATTCAAACATGATTTTTTATGTACTAAT1860ATATACATCCTACTCGAATTAAAGCGACATAGGCTCGAAGTATGCACATTTAGCAATGTA1920AATTAAATCAGTTTTTGAATCAAGCTAAAAGCAGACTTGCATAAGGTGGGTGGCTGGACT1980AGAATAAACATCTTCTCTAGCACAGCTTCATAATGTAATTTCCATAACTGAAATCAGGGT2040GAGACAAAATTTTGGTACTTTTTCCTCACACTAAGTCCATGTTTGCAACAAATTAATACA2100TGAAACCTTAATGTTACCCTCAGATTAGCCTGCTACTCCCCATTTTCCTCGAAATGCTCC2160AACAAAAGTTAGTTTTGCAAGTTGTTGTGTATGTCTTGTGCTCTATATATGCCCTTGTGG2220TGCAAGTGTAACAGTACAACATCATCACTCAAATCAAAGTTTTTACTTAAAGAAATTAGC2280TACCATGGCCAAGAAGGCTGTCATCAACGGGGAGCAGATCAGGAGCATCAGCGACCTCCA2340CCAGACCCTCAAGAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAGTACTACGGTGAGAACCTCGACGCCCT2400CTGGGACTGCCTCACCGGCTGGGTGGAGTACCCCCTCGTGTTGGAGTGGAGGCAGTTCGA2460GCAGAGCAAGCAGCTCACCGAGAACGGCGCCGAGAGCGTGCTCCAAGTGTTCAGGGAGGC2520CAAGGCCGAGGGCTGCGACATCACCATCATCCTCTCCTGATGGATCTGGGGCCGCTCTAG2580AACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGTCGGGTTGGGTTATTTTCTTATTTCCGTAATAAA2640AAAGTGGACATGGTTACCTATTATTGTGATGTGTGCTGCATGTGAGCTATATTGGCGATT2700TCTCTCTTGTAACGCTTTGTACTTGTACCGTTTCGTTGTGATCATTGAAATAAAGGCCTA2760TATAAAAATAATTTATGTTATTTGTTGGTTTATGTGTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAG2820TCAAAATATTTAAGTATTTCTATATAAATCTTTTGCAAGTTTTTTAAGTCATGGAGGAGA2880TGTTATGAATTCTGTAATATAGTAAAAATATTACGTGAAAAACCAGAGGATCCGGGGAAT2940TCCCAGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGC3000AGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGCATCAC3060AGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAATGATTTTATT3120TTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTTTTATAATGCC3180AACTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCATCCGGATTCTCTGAGCCCACCGTGTTCACCACCA3240CCGTGGTGCTGTTACGTCTGGCTTTCAGCTGAATGGTGCAGTTCTGTACCGGTTTTCCTG3300TGCCGTCTTTCAGGACTCCTGAAATCTTTACTGCCATATTCACCCCACAAAAAAGCCCAC3360CGGTTCCGGCGGGCTGTCATAACACTGTGTTACCTGGCTAATCAGAATTTATAACCGACC3420CCAACGATGAATCCGTCAGTACGCCAGTCGCCACTGCCGGAGCCTTCATAAGCAATATCA3480ACAACGACGGACGCTGCCGGATTAATCTGTATACCTGCACTCCACGCCACTGAGGTATGC3540CGCATTGCACTTTCGTCCCTGGCAGTGGTCGTCTCTTTCATATACCCGACTCTAGAGGAT3600CCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGATCAGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT3660ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGG3720CGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAAC3780GCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG3840TTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCA3900AGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC3960TCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTC4020CCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAG4080GTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCC4140TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCA4200GCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTG4260AAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTG4320AAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCT4380GGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA4440GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAA4500GGGATTTTGGTCATGAGACTCGAGCCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAA4560AAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA4620TGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCC4680TGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCT4740GCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCA4800GCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATT4860AATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTT4920GCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCC4980GGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGC5040TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTT5100ATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACT5160GGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGC5220CCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATT5280GGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCG5340ATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCT5400GGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAA5460TGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGT5520CTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGC5580ACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCA561權利要求1．包括編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的DNA，所述芽孢桿菌RNA酶抑制劑具有以Met-Xaa開頭的氨基酸序列，其中Xaa是選自于丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的組。2．根據權利要求1所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有選自于下列組的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑(a)SEQIDNo.2的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是賴氨酸，而是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；(b)SEQIDNo.4的氨基酸序列；和(c)SEQIDNo.4的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是丙氨酸，而是纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。3．根據權利要求2所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有低于40％的A和T核苷酸。4．根據權利要求1-3任一項所述的DNA，它具有對油菜，棉花，玉米，水稻和小麥，優選的是油菜，玉米，水稻最佳的慣用密碼子。5．根據權利要求1-4任一項所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有不高于7％CG雙核苷酸和含有不高于9.5％的CNG三核苷酸。6．根據權利要求4所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼具有SEQIDNo.4的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑。7．根據權利要求6所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。8．根據權利要求2所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有核苷酸序列ATGGCC，后面連接SEQIDNo.1的位置7和270之間的核苷酸序列。9．根據權利要求1-8任一項所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA與指導植物細胞中轉錄的啟動子可操作連接。10．根據權利要求9所述的DNA，其中所述啟動子是指導在植物的雄蕊細胞中選擇性地轉錄的啟動子。11．根據權利要求9或10所述的DNA，其中所述啟動子是指導至少在植物的氈絨層細胞中轉錄的啟動子。12．根據權利要求11所述的DNA，其中所述的啟動子是煙草的TA29基因的啟動子，玉米CA55基因的啟動子或水稻的E1,T72或T42基因的啟動子。13．根據權利要求9所述的DNA，其中所述啟動子是組成型啟動子。14．根據權利要求13所述的DNA，其中所述啟動子是35S啟動子。15．包括權利要求1-14任一項所述的DNA的植物細胞。16．根據權利要求15所述的植物細胞，它也包括芽孢桿菌RNA酶DNA。17．包括權利要求1-14任一項所述的DNA的植物。18．根據權利要求17所述的植物，它也包括芽孢桿菌RNA酶DNA。19．根據權利要求17或18所述的植物，它是油菜，棉花，玉米，水稻或小麥植物。20．根據權利要求17或18所述的植物，它是單子葉植物，優選的是玉米，水稻或小麥植物，特別是玉米或水稻植物。21．根據權利要求20所述的植物，從其花序可提取的每毫克的總蛋白質產生至少20納克芽孢桿菌RNA酶抑制劑。22．具有以Met-Xaa開頭的氨基酸序列的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，其中Xaa是選自于丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的組。23．根據權利要求22所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，具有選自于下列組的氨基酸序列(a)SEQIDNo.2的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是賴氨酸，而是丙氨酸，纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；(b)SEQIDNo.4的氨基酸序列；和(c)SEQIDNo.4的氨基酸序列，其中第二氨基酸不是丙氨酸，而是纈氨酸，甘氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。24．根據權利要求23所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑，具有SEQIDNo.4的氨基酸序列。25．包括權利要求22-24任一項所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑的植物。26．包括芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有低于40％的AT含量。27．根據權利要求26所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有對油菜，棉花，玉米，水稻和小麥，優選的是油菜，玉米，水稻最佳的慣用密碼子。28．根據權利要求26-27任一項所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA含有不高于7％CG雙核苷酸和含有不高于9.5％的CNG三核苷酸。29．根據權利要求26-28任一項所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有SEQIDNo.3的位置7和273之間的核苷酸序列，它是由ATG引導的。30．包括權利要求26-29任一項所述的DNA的植物細胞。31．包括權利要求26-29任一項所述的DNA的植物。32．權利要求1-14或權利要求26-29任一項所述的DNA的應用，用以恢復雄性不育品系的可育性。全文摘要在真核細胞中,特別是在植物細胞中,和尤其是在雄蕊細胞例如氈絨層細胞中,高產量地產生芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質的改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA,例如合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA。合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA具有低于40%的A和T核苷酸。其他改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA編碼改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質,所述蛋白質具有以Met－Xaa開頭的N－末端,其中Xaa是丙氨酸,纈氨酸,甘氨酸,天冬氨酸或谷氨酸。植物細胞和植物含有改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑DNA和/或表達改進的芽孢桿菌RNA酶抑制劑蛋白質。文檔編號C12N15/55GK1218509SQ97191341公開日1999年6月2日申請日期1997年9月1日優先權日1996年9月3日發明者F·米基爾斯,M·威廉斯申請人:植物遺傳系統公司