小麥條銹菌的定量檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體設及一種小麥條誘菌的定量檢測試劑盒及其應 用。
【背景技術】
[0002] 小麥條誘病的早期監測與定量分析一直是該病害治理的重要環節之一。特別是在 小麥苗期條誘病處于潛育階段時，建立快速、準確的測定方法，對該病害的預測預報和防 治具有重要的意義。可W在病害的潛育期盡早確定和預測病害的發生程度，并在病害未大 面積流行前，通過快速、準確的早期監測及時制定藥劑防治措施W降低初始菌源量，抑制或 減慢病害的發展。
[0003] 長期W來，現有的監測方法，如人工調查、葉片培養、遙感監測等尚不能實現對病 原菌侵染后小麥葉片處于潛育狀態時侵染程度的準確、快速的定量分析。近年來，分子生 物學技術的發展使得對病害的快速檢測成為可能，并開始應用于小麥條誘病的早期檢測。 Zhao等、Cao等設計小麥條誘菌的特異性引物，利用普通PCR方法實現了對條誘病的分子 檢測。此后，Wang等建立了PCR方法檢測侵入小麥葉片中的條誘菌的方法，Wang等進一步 發展了巢式PCR的檢測方法。Real-timePCR是近些年來發展起來的可W定量檢測植物病 原菌的方法。Winton等利用巧光Real-timePCR在一管中同時檢測到多種病原菌。另外， Gachon等、Bohm等、Mercado-Bianco等都利用相同的方法實現了對病原菌在寄主植物內動 態變化的追蹤。化aaije等利用Real-timePCR開展了小麥條誘菌的研究工作，不過引物最 低可檢測的病原菌量僅為40pg。
[0004] 目前國內外開展了一些對小麥條誘病病原菌的定性檢測研究，尚未見小麥條誘病 早期定量監測方法的報道。

【發明內容】
陽0化]本研究通過比較普通PCR和Real-timePCR方法在早期檢測小麥條誘病方面的優 缺點，建立SYBRGreenI方法，W定量測定小麥條誘病菌在潛育狀態下的侵染量，為該病害 的早期預測和防治決策提供依據。
[0006] 本發明的技術方案如下：
[0007] 用于定量檢測小麥條誘菌的試劑盒，包括巧光定量PCR擴增的常規試劑，其特征 在于，還包括檢測條誘菌的引物；所述引物的正向和反向的核巧酸序列如下：
[0008] osgQ607/osgQ608 ：
[0009] GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。
[0010] 所述巧光定量PCR擴增的常規試劑包括：2XSGPCRMasterMix和/或2XSG GreenqPCRMix,W及雙蒸水。
[0011] 一種定量檢測小麥條誘菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0012] (1)獲取標準曲線方程：
[0013] 所述標準曲線方程是W系列DM標準品的梯度拷貝數濃度為橫坐標，w采用引物 osgQ607/osgQ608對所述系列DNA標準品分別進行巧光定量PCR擴增所得的Ct值為縱坐標 繪制的標準曲線擬合得出的方程；
[0014] (2)采用引物osgQ607/osgQ608對提取自待測樣品的曲NA進行巧光定量PCR擴 增；
[0015] (3)收集待測樣品DNA的巧光定量PCR擴增的巧光信號，根據所述闊值確定待測樣 品DNA的Ct值；
[0016] (4)將待測樣品DNA的Ct值代入標準曲線獲得待測樣品DNA的拷貝數濃度；
[0017] 所述DNA標準品為條誘菌曲NA的普通PCR擴增產物；所述待測樣品為 小麥曲NA;所述引物osgQ607/osgQ608 的序列如下：GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/ TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。
[0018] 所述巧光定量PCR擴增的反應體系為：2XSG Green qPCRMix:0. 5yl/yl，所述 引物正向和反向各為：〇. 25iiM，DNA模板：0.05^1/^1，其余為雙蒸水。
[0019] 所述巧光定量PCR擴增的反應程序為：95°C預變性10分鐘；95°C變性20秒，60°C 退火延伸30秒，45個循環。 W20] 所述DNA模板為曲NA或W曲NA為模板的普通PCR擴增產物。
[0021] 所述普通PCR擴增是指W曲NA為模板，用所述引物osgQ607/osgQ608進行的普通 PCR擴增反應；所述普通PCR擴增的反應體系為：2XSGPCRMasterMix:0. 5y1/y1，所述 引物正向和反向各為：〇. 25iiM，普通PCR擴增產物：0.05^1/^1，其余為雙蒸水；反應程序 為：94°C預變性10分鐘；94°C變性20秒，60°C退火延伸30秒，40個循環。
[0022] 本研究義用"GlassandDonaldson, 1995."報道的真菌保守基因引物E5t2a/Bt2b， 其核巧酸序列為：5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3' /5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。 W小麥條誘菌、小麥葉誘菌、小麥桿誘菌等病原菌的基因組DNA為模板，進行PCR比較擴增。 擴增及測序結果顯示，該引物在小麥條誘菌的DNA中擴增出36化P長度的片段，在小麥葉誘 菌、小麥桿誘菌的DNA中擴增出的條帶都是49化P，具體見圖6, 7, 8。為了獲得能夠特異地 將條誘菌從葉誘、桿誘菌及其它類似麥類病原真菌中鑒別出來，需要進一步設計特異引物。
[0023] 本發明根據小麥條誘菌（Pucciniastrii化rmis)的特異性片段362bp大小的 基因序列設計對該病原菌種具有特異性的引物0SgQ607/〇SgQ608，并分別在普通PCR和 Real-timePCR擴增時對該引物的特異性和靈敏性進行了測定。結果表明該引物對小麥條 誘菌特異性高，可穩定擴增出82bp的目標條帶。應用此特異性引物，建立了Real-timePCR 測定系統，定量測定了條誘菌在小麥葉片接種后組織內的DM隨時間的變化。利用本發明 所述試劑盒中的所述引物，普通PCR和Real-timePCR擴增的最低檢出限分別為lOpg和 Ifg。Real-timePCR的靈敏度為普通PCR的100倍。本發明還建立了Real-timePCR標準 曲線，用于定量測定侵染在小麥葉片內條誘病病原菌的DNA。本發明基于AB口500巧光定量 擴增儀，優化Real-TimePCR反應體系，成功地建立SYBRGreenI巧光染料法定量PCR檢 測體系。
[0024] 本發明所設計的引物與目前應用于條誘病分子檢測的其他引物相比，更適用于 Real-timePCR的檢測。本發明中目標菌在Real-timePCR的溶解曲線中顯示為單一產物 峰，無引物二聚體等非特異性帶干擾。在設計篩選引物的過程中發現，擴增片段過長的引物 雖然在普通PCR檢測中表現特異性，擴增產物為單一片段，但在Real-timePCR檢測上可能 并不表現為單一產物；而本發明所選擇的引物，消除了其他引物在Real-time檢測上的缺 點。
[00巧]本發明提供的試劑盒和方法能相對準確地定量測定小麥條誘菌在潛育狀態下的 侵染量，具有檢出限低、靈敏度好、特異性強、擴增效率高等特點，為早期預測和防治小麥條 誘病提供了一種可靠的檢測手段。
【附圖說明】
[0026] 圖1是W梯度濃度的條誘菌曲NA的普通PCR擴增產物作為系列DNA標準品為模 板，采用本發明所述試劑盒進行巧光定量PCR擴增獲得的擴增曲線圖及闊值。
[0027] 圖2是W梯度濃度的條誘菌曲NA的普通PCR擴增的產物作為系列DNA標準品為 模板，采用本發明所述試劑盒進行巧光定量PCR擴增獲得的烙解曲線圖。
[0028] 圖3是W梯度濃度的條誘菌曲NA的普通PCR擴增的產物作為系列DNA標準品為 模板，采用本發明所述試劑盒進行巧光定量PCR擴增獲得的標準曲線。
[0029] 圖4是采用本發明所述試劑盒對小麥樣品進行巧光定量PCR擴增獲得的擴增曲線 圖。
[0030] 圖5是采用本發明所述試劑盒對小麥樣品進行巧光定量PCR擴增獲得的烙解曲線 圖。
[0031] 圖6小麥條誘菌、葉誘菌和桿誘菌的曲NA的PCR比較擴增結果，
[0032] 其中，點樣孔中的樣品從左至右依次為2個條誘、2個葉誘、2個桿誘；Marker條帶 大小從下往上依次為lOObp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。
[003引圖7小麥桿誘菌與葉誘菌的特異性DM片段比對結果， 陽034]其中，6-1片段為小麥桿誘菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉誘菌的特異性DNA片段，其同源性為100%。
[003引圖8小麥條誘菌與葉誘菌的特異性DNA片段比對結果，
[0036] 其中，1-5片段為小麥條誘菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉誘菌的特異性 DNA片段，其同源性為31. 23%。
[0037] 圖9普通per驗證本發明特異性引物的特異性：
[0038] 其中，泳道 1-5 :小麥條誘菌CY33,CY32,CY17,CY18,CY19 ;
[0039] 6-8,小麥葉誘菌PHT，THT，T皿；
[0040] 9-11，小麥桿誘菌 34C1,MFM;
[0041] 12-13,小麥白粉菌 1、10 ;
[0042] 14-15,小麥赤霉菌PH-1,PH-2 ;
[0043] 16-17,TCK;18,T化；19;TCT;20 ;d地20;Marker為肥B的LowMWDNALadder。
【具體實施方式】
[0044] 下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明，但并不限制本發明的范 圍。如無特殊說明，下述實施例中使用的操作均為常規方法，所采用的試劑均可W商購獲 得。
[0045]牛物材料的夾源巧巧裁m化
[0046] 條誘菌CY33作為已知菌株可W商購獲得；
[0047] 本發明采用的小麥受試材料為已知品種明賢169,由中國農科院植物保護研究所 麥類病害組保存，自申請日起二十年內可向公眾發放用于實驗研究。
[0048] 小麥病原真菌菌種及來源：小麥誘菌菌種CY33、CY32、CY17、CY18、CY19;小麥葉誘 菌菌種PHT、THT、T皿；小麥桿誘菌菌種34CUMFM;小麥白粉菌1、10 ;小麥赤霉菌菌種PH-1、 PH-2;小麥矮腥黑穗病菌TCK;光腥黑粉菌菌種T化；網腥黑粉菌菌種TCT，均為公眾已知菌 種，中國農業科學院植物保護研究所有保存，承諾自申請日起二十年內可向公眾發放用于 實驗研究。
[0049]豐要試劑 陽化0] 2XSG PCR Master Mix購自SinoGene，產品型號為#33-10201) ;2XSG Green qPCR Mix (with RO訝購自SinoGene，產品型號為#22-10102 ;質粒DM提取試劑盒；植物基 因組DM提取試劑盒；雙蒸水。 W引]豐要化器巧備
[0052]分光光度計度io地otometer，Elppendorf);定量PCR儀（StepOnePLUS，Applied Biosystems)。
[0053] 實施例1、采用真菌保守基因引物分析小麥誘菌
[0054] 參照"Glass and Donaldson,1995."報道的化2a/Bt2b其核巧酸序列為： 陽化5] Bt2a :5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3,（SeqIDNo.1)， 陽化6] Bt2b:5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'(SeqIDNo. 2)。
[0057] 對小麥條誘菌、葉誘菌和桿誘菌曲NA的進行PCR分析，分析均在MJ Research,Inc.的PTC2220 型PC