專利名稱：棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物病原菌的酶聯免疫檢測領域。具體涉及一種棉花黃萎菌酶聯免疫 檢測試劑盒，以及利用此檢測試劑盒在檢測棉花黃萎菌上的用途。
背景技術：
棉花黃萎病造成棉花蕾、鈴脫落和葉片枯死，嚴重影響棉花的產量和質量，是一種 危害嚴重的棉花病害。棉花黃萎病主要由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起，傳播 途徑廣泛，棉籽、莖、葉、根和土壤、肥料、流水以及農田管理工具等均能傳播棉花黃萎菌。控 制棉花黃萎病，減少其帶來的經濟損失，需要方便快捷、準確有效的檢測方法。檢測棉花黃萎病的方法包括傳統的形態學方法、分子生物學技術如PCR、RFLP、 RAPD和免疫鑒定技術(馬存.中國農學通報，1994，10 (3) :33_35)。傳統的借助于病原微 生物形態學及病害癥狀進行檢測的方法，存在時間長、難以準確判斷的弊端。分子生物學檢 測方法存在化學試劑和儀器設備昂貴，同時操作技術必需專業等問題。與之相比，酶聯免疫 法在檢測和診斷植物病害方面具有特異性強、靈敏度高、應用范圍廣、儀器簡單、自動化程 度高、成本低、方便、快速、準確等優點(孫偉等.化學研究與應用，2002，14(5) 510-514 ； 王重慶.分子免疫學基礎.北京大學出版社，1997 216-240)。目前，已有棉花黃萎病菌酶聯免疫檢測方法的相關報道，如利用間接ELISA方 法檢測棉花黃萎病菌毒素(徐冬青等.南京農業大學學報，2000，23(1) 105-108)；利用 間接ELISA方法對于棉子攜帶黃萎病菌的快速檢測(林玲等.棉花學報，2006，28 (6) 327-331)；利用A蛋白雙抗體夾心ELISA方法特異性檢測棉花黃萎病菌毒素(劉鳳權等.棉 花學報，2003，15(1) :47-50)。但是上述方法都是用棉花黃萎菌毒素蛋白作為抗原免疫動物 得到抗血清，存在難度大，周期長等問題。

發明內容
本發明目的在于提供一種棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒。該檢測試劑盒可為棉 花黃萎菌的檢測及早期診斷提供簡便、快速、準確的技術手段。本發明另一目的在于提供利用上述酶聯免疫檢測試劑盒在檢測棉花黃萎菌上的 應用。為實現上述目的，本發明的技術方案如下本發明棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒，包括棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體和 生物素標記抗體；所述的生物素標記抗體為N-羥基琥珀酰亞胺生物素標記的棉花黃萎菌 菌絲蛋白多克隆抗體。所述的檢測試劑盒，還包括酶標板、陽性對照、陰性對照、緩沖液、封閉液、洗滌液、 親和素、顯色劑和終止液。所述的棉花黃萎菌主要是指大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)，如V97、T9等， 均可公開獲得。
所述的陽性對照為棉花黃萎菌菌絲蛋白溶液。所述的陰性對照為不含棉花黃萎菌的棉花組織蛋白提取液或蒸餾水等。所述的緩沖液為含有體積百分含量為0. 05%的TWeen-20(吐溫-20)和質量百分 含量為0. 2%的PVP-40T(聚乙烯吡咯烷酮)的磷酸鹽緩沖液(PBS)。所述的封閉液為含有質量百分含量為0. 2%的牛血清白蛋白的碳酸鹽緩沖液。所 述的碳酸鹽緩沖液的組成成分及其質量百分含量為Na2C03 0. 159%, NaHC030 . 29 3%，其余 為蒸餾水，PH9.6。所述的洗滌液為洗滌液A和洗滌液B。所述的洗滌液A (簡寫為PBS_T)為含有體積百分含量為0. 05%的Tween-20 (吐 溫-20)的磷酸鹽緩沖液。所述的洗滌液B(簡寫為Tris-HCl-T)為含有體積百分含量為0. 05 %的 Tween-20(吐溫-20)的 1M Tris-HCl, pH9. 0。所述的親和素為辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。所述的顯色劑，按照如下方法配制預先將四甲基聯苯二胺(TMB)溶于二甲基亞 砜，配制成lmg/mL的TMB溶液。使用前，將TMB溶液加入底物緩沖液(其組成成分及其質 量百分含量為:Na2H3P04 1. 46%, C6H807 H20 0. 94%，其余為蒸餾水，pH4. 75)，使得TMB的 最終濃度為0. lmg/mL ；然后加入體積百分含量為0. 3%的H202。所述的終止液為2M的硫酸溶液。所述的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體，按照如下方法進行制備(a)將棉花黃萎菌接種于查彼克(Czapek)培養基(其組成成分及其質量百分含 量為NaN030. 2%, K2HP04 0.1%, KC1 0. 05%, MgS04 0 . 05%, FeS04 0 . 001%，蔗糖 3. 0%， 其余為蒸餾水)中，在25°C、110rpm條件下培養7d，在室溫、5000rpm下離心lOmin，收集沉 淀，得病原菌菌絲；然后加入蛋白提取緩沖液(其組成為含有體積百分含量為0. 05%的 Tween-20和質量百分含量為0. 2%的PVP-40T的磷酸鹽緩沖液)，超聲波破碎菌絲體，鏡檢， 直到菌絲完全破碎；4°C、8000rpm條件下離心20min，棄沉淀；將上清液在4°C、12000rpm條 件下離心60min，棄沉淀，將上清液冷凍、干燥、濃縮，得到粉狀的棉花黃萎菌菌絲蛋白，用作 免疫抗原和陽性對照。(b)將上述棉花黃萎菌菌絲蛋白與完全弗氏左劑(FCA)混合配制成菌絲蛋白lmg/ mL的溶液，對健康家兔進行背部皮下和腿部肌肉多點注射，并設一只不注射免疫抗原(棉 花黃萎菌菌絲蛋白)的家兔做對照；每隔15d進行一次免疫，注射的抗原溶液為將上述棉 花黃萎菌菌絲蛋白與不完全弗氏左劑(FICA)配制成的lmg/mL溶液，對首次免疫的家兔進 行背部皮下和腿部肌肉多點注射；每次免疫前進行皮下取血，檢測抗體的產生程度；免疫5 次后耳靜脈采血，分別得到棉花黃萎菌抗血清和陰性血清對照。(c)將采集的棉花黃萎菌抗血清和陰性血清對照，25°C靜置4h，然后4°C靜置過 夜，讓血清充分析出；在4°C、5000rpm條件下離心30min，棄沉淀；將所得上層血清在4°C、 15000rpm條件下再離心lOmin，棄沉淀，獲得更純的抗血清；將所得抗血清_20°C保存。(d)將上述所得的lmL抗血清溶于9mL超純水中，加入10mL飽和硫酸銨溶液 (3. 9M)，冰浴1 2h ；在lOOOOrpm條件下離心lOmin，棄上清液；將所得沉淀溶解于磷酸鹽 緩沖液(PBS)中，4°C透析過夜；將透析過的溶液通過protien-A柱，在280nm獲得兩個吸收峰，第一個吸收峰為未被protien-A特異吸附的雜蛋白，第二個吸收峰所對應的蛋白為 protien-A特異吸附的多克隆抗體蛋白；收集第二個吸收峰，即為純化的棉花黃萎菌菌絲 蛋白多克隆抗體。所述的生物素標記抗體，按照如下方法進行制備將N-羥基琥珀酰亞胺脂生物素lmg溶于lmL 二甲基亞砜(DMS0)中；lmL純化后 的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體(濃度為lmg/mL)在碳酸鹽緩沖液(其組成成分及其質 量百分含量為Na2C030. 159%,NaHC03,0 . 29 3%，其余為蒸餾水，pH9. 6)中4°C透析過夜；透 析后的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體lmL加N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液100 y L，室溫反 應30min ；加入濃度為1M的Tris_HCl (pH7. 4) 100 u L終止反應；在質量百分含量為0. 85% 的NaCl溶液中4°C透析過夜，得到生物素標記抗體；然后將生物素標記抗體與甘油按照體 積比為1 1的比例混合，-20°C保存。利用上述棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒檢測棉花黃萎菌的方法，包括如下步 驟(1)樣品前處理。將待測棉花組織(如根、莖或葉等)加入液氮研磨粉碎，并加入 5倍體積的蛋白提取液(其組成成分及其比例為含有體積百分含量為0. 05%的Tween-20 和質量百分含量為0.2%的PVP-40T的磷酸鹽緩沖液(PBS))，4°C浸提12h，然后在4°C、 8000rpm條件下離心20min，收集上清液；再在4°C、12000rpm條件下離心lh，收集上清液， 即為待測樣品；(2)包被在96孔酶標板每孔中加入包被液100 u L，4°C過夜；棄包被液，洗滌液A 洗板3次，每次靜置3min，甩干；所述的包被液為以碳酸鹽緩沖液為溶劑的棉花黃萎菌菌絲 蛋白多克隆抗體溶液；(3)封閉每孔加入封閉液200 u L，37°C孵育lh ；棄封閉液，洗滌液A洗板3次，每 次靜置3min，甩干；(4)加樣將步驟(1)所得上清液和陽性對照、陰性對照各100 u L分別加入酶標 板的不同點樣孔中；37°C孵育lh ；洗滌液A洗板3次，每次靜置3min，甩干；(5)加生物素標記抗體和酶標抗體每孔加生物素標記抗體100 u L，37°C下孵育 lh，洗滌液A(PBS-T)洗板3次，每次靜置3min，甩干；然后每孔加入辣根過氧化物酶標記鏈 霉親和素(SA-HRP) 100 u L，37°C下孵育30min，用洗滌液B (Tris-HCl-T)洗板3次，每次靜 置3min,甩干；(6)每孔加顯色液100iiL，37°C下孵育10 15min ；然后向各孔中加入終止液 100 u L終止反應，于酶標儀上在450nm波長下測定吸光度(0D45Q)值，以P/N彡2. 1作為陽 性判斷標準(其中P代表待測樣品在450nm波長下測定吸光度(0D45CI)值；N代表陰性對照 在450nm波長下測定吸光度(0D45CI)值)，即含有棉花黃萎菌。同時，根據黃萎菌菌絲蛋白含 量和吸光度值的標準曲線換算出待測樣品中的黃萎菌菌絲蛋白含量。與現有技術相比，本發明雙抗體夾心法棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒，具有如 下優點(1)靈敏度高，可以檢測到樣品中ng級水平的棉花黃萎菌；(2)操作簡便，普通工 作人員經過簡單培訓就可以完成；(3)重復性好，檢測結果穩定可靠；(4)對儀器要求低，僅 需普通恒溫水浴箱，酶標儀等。如只需定性檢測，則可通過目測，不需酶標儀；(5)本發明 使用棉花黃萎菌菌絲蛋白作為免疫原制備抗血清，方便簡潔，成本低，適于進行大規模的檢測；(6)本發明為棉花黃萎病的早期診斷和防治以及棉花雜交育種后代的早期選擇提供了 有效的技術手段。


圖1應用本發明酶聯免疫檢測試劑盒檢測不同棉株根、莖、葉內棉花黃萎菌含量 柱形圖。圖2感病品種鄂荊1號葉、根、莖的棉花黃萎菌含量檢測柱形圖。圖3耐病品種中棉所12號葉、根、莖的棉花黃萎菌含量檢測柱形圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明做進一步的說明，但是不構成對本發明的保護范圍構成 任何限制。實施例1棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體的制備(1)抗原的制備將棉花黃萎病菌(大麗輪枝菌(VerticiIlium dahliae)V97)接種 于Czapek(查彼克)培養基(其組成成分及其質量百分含量為NaN030.2%，K2HP04 0. 1%, KC1 0. 05%,MgS04 0 . 05%,FeS04 0 . 001 %，蔗糖 3. 0%，其余為蒸餾水)中，在 25°C、llOrpm 條件下培養7d，在室溫、5000rpm條件下離心lOmin，收集沉淀，獲得棉花黃萎菌菌絲；然 后加入蛋白提取液(蛋白提取液的組成成分及其比例為含有體積百分含量為0. 05%的 Tween-20和質量百分含量為0. 2%的PVP-40T的磷酸鹽緩沖液)，超聲波破碎菌絲體，鏡 檢，直到菌絲完全破碎；在4°C、8000rpm條件下離心20min，棄沉淀；將所得上清液在4°C、 12000rpm條件下離心60min，棄沉淀，將上清液冷凍、干燥、濃縮，得到粉狀的棉花黃萎菌菌 絲蛋白，用作免疫抗原和陽性對照。(2)免疫將步驟(1)所得的棉花黃萎病菌絲蛋白與完全弗氏左劑(FCA)混合配制 成濃度為lmg/mL的抗原溶液，對健康家兔進行背部皮下和腿部肌肉多點注射；并設一只不 注射免疫抗原(棉花黃萎菌菌絲蛋白)的家兔做對照；然后每隔15d進行免疫1次，免疫抗 原溶液為步驟(1)所得的棉花黃萎病菌絲蛋白與不完全弗氏左劑(FICA)混合配制的濃度 為lmg/mL的抗原溶液，對首次免疫的家兔進行背部皮下和腿部肌肉多點注射；每次免疫前 進行皮下取血，檢測抗體的產生程度。(3)抗血清的分離免疫5次后耳靜脈采血，得到含有抗血清蛋白的新鮮血液；將采 集的新鮮血液25°C靜置4h，然后4°C靜置過夜，讓血清充分析出；在4°C、5000rpm條件下離 心30min，棄沉淀；將所得上層血清在4°C、15000rpm條件下再離心lOmin，棄沉淀，獲得更純 的抗血清；將所得抗血清-20°C保存。(4)棉花黃萎菌多克隆抗體的分離將上述所得的抗血清lmL溶于9mL超純水中， 然后加入10mL飽和硫酸銨溶液(3. 9M)，冰浴1 2h，再在lOOOOrpm條件下離心lOmin， 棄上清液；將所得沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，4°C透析過夜；將透析過的溶液通過 protien-A柱，在280nm獲得兩個吸收峰，第一個吸收峰為未被protien-A特異吸附的雜蛋 白，第二個吸收峰所對應的蛋白為protien-A特異吸附的多克隆抗體蛋白；收集第二個吸 收峰，即為純化的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體。實施例2棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒的制備
按照如下方法進行(1)生物素標記抗體的制備將N-羥基琥珀酰亞胺酯生物素lmg溶于lmL 二甲基 亞砜(DMS0)中；將實施例1中所得棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體lmL(濃度為lmg/mL)在 碳酸鹽緩沖液(其組成成分及其重量百分含量為Na2C030. 159%, NaHC03,0 . 29 3%，其余為 蒸餾水，pH9. 6)中4°C透析過夜；透析后的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體lmL加上N-羥 基琥珀酰亞胺酯溶液100 u L，室溫反應30min ；加入濃度為1M的Tris-HCl (pH7. 4) 100 u L 終止反應；在質量百分含量為0. 85%的NaCl溶液中4°C透析過夜，得到生物素標記抗體； 然后將生物素標記抗體與甘油按照體積比為1 1的比例混合，-20°C保存。(2)棉花黃萎病菌菌絲蛋白多克隆抗體預包被條的制備A.包被用碳酸鹽緩沖液(組成成分同上)將實施例1所得棉花黃萎菌菌絲蛋白 多克隆抗體稀釋500倍，100 u L/孔包被于酶標板上，4°C過夜。B.封閉每孔加入200 PL封閉液(含質量百分含量為0.2%的牛血清白蛋白的碳 酸鹽緩沖液)，37°C孵育lh。C.干燥37°C下盡量干燥。(3)底物緩沖液的配制Na2H3P040. 73g, C6H807. H20 0. 47g,定容至 50mL, pH4. 75。(4)其他試劑的配制洗滌液A 含體積百分含量為0. 05 %的吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS-T) (pH7. 4)，其組成成分為稱取 KH2P040. 2g，Na2HP04. 12H20 2. 9g，NaCl 8. Og, KC1 0. 2g，吐 溫-20500 u L，超純水lOOOmL，混合均勻。洗滌液B 含有體積百分含量為0. 05 %的吐溫-20的1M的Tri s_HCl緩沖液 (pH9. 0)(Tris-HCl-T)。蛋白提取液含體積百分含量為0.05%的吐溫-20和質量百分含量為0.2%的 PVP-40T (聚乙烯吡咯烷酮)的磷酸鹽緩沖液。生物素標記抗體稀釋液含體積百分含量為0. 05%的吐溫-20和質量百分含量為 0. 2 %的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。HRP稀釋液含有質量百分含量為0. 牛血清白蛋白的0. 5M的Tris_HCl。顯色液預先將四甲基聯苯二胺(TMB)溶于二甲基亞砜，配制成lmg/mL的TMB 溶液。使用前，將TMB溶液加入底物緩沖液(其組成成分及其質量百分含量為Na2H3P04 1.46%, C6H807 H20 0. 94%,其余為蒸餾水，pH4. 75)，使得TMB的最終濃度為0. lmg/mL ；然 后加入體積百分含量為0. 3%的H202。 終止液2M的H2S04溶液。陰性對照不含棉花黃萎病菌的棉花組織蛋白提取液或蒸餾水等。陽性對照棉花黃萎病菌菌絲蛋白提取液。利用上述棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒檢測棉花黃萎菌的方法(a)樣品處理將0. 2g棉花新鮮葉片組織，加入液氮研磨粉碎，至離心管中，加入5 倍體積的蛋白提取液，在4°C、8000rpm條件下離心20min，收集上清液；再將所得上清液在 4°CU2000rpm條件下離心lh，收集上清液。(b)包被在96孔酶標板每孔中加入包被液(用碳酸鹽緩沖液溶解的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體)100 u L，4°C過夜；棄包被液，洗滌液A洗板3次，每次靜置3min，甩 干；(c)封閉每孔加入200 PL封閉液(含質量百分含量為0.2%的牛血清白蛋白的 碳酸鹽緩沖液)，37°C孵育lh。棄封閉液，洗滌液A洗板3次，每次靜置3min，甩干；(d)加樣將(a)所得樣品的上清液和陽性對照、陰性對照各lOOiiL分別加入酶 標板上的不同點樣孔中；37°C溫浴lh ；洗滌液A(PBS-T)洗板3次，每次靜置3min，甩干。(e)加生物素標記抗體各孔加生物素標記抗體100 u L，37°C下孵育lh，洗滌液A 洗酶標板板3次。(f)加酶標親和素所有孔均加入HRP液稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素 (SA-HRP) 100 u L，37°C下孵育30min，用洗滌液B洗板3次。(g)顯色每孔加入顯色液lOOii L，37°C下避光孵育10 15min。(h)終止每孔分別加入終止液100 u L終止反應。(i)檢測在450nm波長下測定吸光度(0D45Q)值。結果判斷根據測定所得吸光度值，以P/N ^ 2. 1作為陽性判斷標準(其中P代表 待測樣品在450nm波長下測定吸光度(0D45CI)值；N代表陰性對照在450nm波長下測定吸光 度(0D45CI)值)，即含有棉花黃萎菌。同時，根據黃萎菌菌絲蛋白含量和吸光度值的標準曲線 換算出待測樣品中的黃萎菌菌絲蛋白含量。實施例3棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒的檢測試驗按照如下方法進行在河北省高陽縣北于八村實驗田選取棉花耐黃萎病品種冀棉151的黃萎病病株 和健株，分別稱取根、莖、葉各lg，進行液氮研磨并加入5倍的棉花黃萎菌菌絲蛋白提取液 (含體積百分含量為0. 05 %的Tween-20和質量百分含量為0. 2 %的聚乙烯吡咯烷酮的磷酸 鹽緩沖溶液(PBS))，4°C浸提12h，在4°C、8000rpm條件下離心20min，棄沉淀；將所得上清 液在4°C、12000rpm條件下離心lh，棄沉淀；將所得上清液以100 u L/孔加入酶標板的點樣 孔中，同時取實施例1中所配制的陽性對照液和陰性對照液各100 y L，分別加入另外的點 樣孔中；37°C孵育lh ；用洗滌液A洗板3次，每次靜置3min，甩干。向各孔中加100 u L生物 素標記抗體稀釋液(含有質量百分含量為0. 2%牛血清白蛋白的PBS-T)稀釋后的生物素標 記抗體，37°C下孵育lh，用洗滌液A洗板3次，每次靜置3min，甩干；向各孔中加入HRP稀釋 液稀釋后的辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素(SA-HRP) lOOii L，37°C下孵育30min，用洗滌 液B洗板3次每次靜置3min，甩干。每孔加顯色液100 y L，37°C下避光孵育10 15min。 加終止液100 U L終止反應，于酶標儀上在450nm波長下測定吸光度(0D45C1)值。結果(見 圖1)在三株病株和健康株體內都檢測到棉花黃萎菌，根、莖、葉三個部位相比，葉部含菌量 最高。表明本發明棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒可以在具有棉花黃萎病典型癥狀的成株 根、莖、葉檢測出病原菌存在，在不顯癥的植株上也能夠檢測出大麗輪枝菌。說明本發明檢 測試劑盒可以為田間早期防治棉花黃萎病或者棉花育種后代的選擇提供依據。實施例4本發明棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒的檢測試驗按照如下方法進行選擇棉花感黃萎病品種鄂荊1號和耐黃萎病品種中棉所12號，采用切根蘸孢子法 人工接種棉花黃萎菌V97，然后在接種后第3、7、14、21、28d時分別取兩個品種的根、莖、葉各lg，采用和實施例3同樣的方法進行檢測，設不接種棉苗為對照。結果(見圖2和圖3) 不論是鄂荊1號還是中棉所12號，接種的早期階段只能夠在棉花的根部檢測出病原菌，后 期階段能夠檢測到根、莖、葉中均含有病原菌。兩個品種中根部棉花黃萎菌的含量都要高于 莖和葉部，隨時間的推移黃萎菌含量不斷增高。接種初期(第3和第7d)中棉所12號的黃 萎菌含量較高，接種后期(從14d起)鄂荊1號的所有部位中黃萎菌含量急劇增加；而中棉 所12號即使根部黃萎菌含量較高，但是葉和莖的黃萎菌含量卻遠比根部低得多(第21和 第28d)，表明耐病品種中棉12號阻斷了棉花黃萎菌在植株體內向上的傳播。表明本發明棉 花黃萎病菌酶聯免疫檢測試劑盒可用于對棉花品種的抗棉花黃萎菌的早期檢測，為棉花黃 萎病的早期診斷和防治，以及對棉花育種的雜交后代選擇提供依據，從而節約大量人力、物 力。
權利要求
棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于包括棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體和生物素標記抗體，所述的生物素標記抗體為N 羥基琥珀酰亞胺酯生物素標記的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體。
2.按照權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于還包括酶標板、陽性對照、陰性對 照、緩沖液、封閉液、洗滌液、親和素、顯色劑和終止液。
3.按照權利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性對照為棉花黃萎菌 菌絲蛋白溶液；所述的陰性對照為不含棉花黃萎菌的棉花組織蛋白提取液或蒸餾水。
4.按照權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的緩沖液為含有體積百分含量 為0. 05%的Tween-20和質量百分含量為0. 2%的PVP-40T的磷酸鹽緩沖液；所述的封閉液 為含有質量百分含量為0. 2%的牛血清白蛋白的碳酸鹽緩沖液；其中所述的碳酸鹽緩沖液 的組成成分及其質量百分含量為Na2C030. 159%,NaHC030 . 29 3%，其余為蒸餾水。
5.按照權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為洗滌液A和洗滌液 B ；所述的洗滌液A為含有體積百分含量為0. 05%的Tween-20的磷酸鹽緩沖液；所述的洗 滌液B為含有體積百分含量為0. 05%的Tween-20的lMTris_HCl。
6.按照權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的親和素為辣根過氧化物酶標 記的鏈霉親和素；所述的終止液為2M的硫酸溶液。
7.按照權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的顯色劑，按照如下方法配制 將TMB溶于二甲基亞砜，配制成lmg/mL的TMB溶液；使用前，將TMB溶液加入底物緩沖液， 使得TMB的最終濃度為0. lmg/mL ；然后加入體積百分含量為0. 3%的過氧化氫；其中所述 的底物緩沖液的組成成分及其質量百分含量為Na2H3P04l. 46%, C6H807 H20 0. 94%，其余 為蒸餾水。
8.利用權利要求1 7任一所述的檢測試劑盒檢測棉花黃萎菌的方法，包括如下步驟(1)將待測棉花組織加入液氮研磨粉碎，并加入5倍體積的蛋白提取液，4°C浸提12h， 然后在4°C、8000rpm條件下離心20min，收集上清液；再在4°C、12000rpm條件下離心lh，收 集上清液，即為待測樣品；其中所述的蛋白提取液的組成成分及其比例為含有體積百分 含量為0. 05%的Tween-20和質量百分含量為0. 2%的PVP-40T的磷酸鹽緩沖液；(2)在96孔酶標板每孔中加入包被液100u L，4°C過夜；棄包被液，洗滌液A洗板3次， 每次靜置3min，甩干；所述的包被液為以碳酸鹽緩沖液為溶劑的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克 隆抗體溶液；(3)每孔加入封閉液200u L，37°C孵育lh ；棄封閉液，洗滌液A洗板3次，每次靜置 3min,甩干；(4)將步驟(1)所得上清液和陽性對照、陰性對照各100yL分別加入酶標板的不同點 樣孔中；37°C孵育lh ；洗滌液A洗板3次，每次靜置3min，甩干；其中所述的陽性對照為棉 花黃萎菌菌絲蛋白溶液；所述的陰性對照為不含棉花黃萎菌的棉花組織蛋白提取液或蒸餾 水；(5)每孔加生物素標記抗體100i!L，37°C下孵育lh，洗滌液A(PBS-T)洗板3次，每次 靜置3min，甩干；然后所有孔均加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素100y L，37°C下孵育 30min,用洗滌液B洗板3次，每次靜置3min，甩干；(6)每孔加顯色液100yL，37°C下孵育10 15min ；然后向各孔中加入終止液100 u L 終止反應，于酶標儀上在450nm波長下測定吸光度OD450值，以P/N彡`2. 1作為陽性判斷標 準；其中P代表待測樣品在450nm波長下測定吸光度OD450值；N代表陰性對照在450nm波 長下測定吸光度0D45(I值，即含有棉花黃萎菌；同時，根據黃萎菌菌絲蛋白含量和吸光度值 的標準曲線換算出待測樣品中的黃萎菌菌絲蛋白含量。
9.按照權利要求8所述的檢測棉花黃萎菌的方法，其特征在于所述的棉花黃萎菌菌絲 蛋白多克隆抗體，按照如下方法進行制備(a)將棉花黃萎菌接種于查彼克培養基中，在25°C、110rpm條件下培養7d，在室溫、 5000rpm下離心lOmin，收集沉淀，得病原菌菌絲；然后加入菌絲蛋白提取液(其組成為 含有體積百分含量為0. 05%的Tween-20和質量百分含量為0. 2%的PVP-40T的磷酸鹽緩 沖液)，超聲波破碎菌絲體，鏡檢，直到菌絲完全破碎；4°C、8000rpm條件下離心20min，棄 去沉淀；將上清液在4°C、12000rpm條件下離心60min，棄沉淀，將上清液冷凍、干燥、濃縮， 得到粉狀的棉花黃萎菌菌絲蛋白，用作免疫抗原和陽性對照；其中所述的查彼克培養基的 組成成分及其質量百分含量為NaN03 0. 2%, K2HP04 0. 1%, KC1 0.05%, MgS04 0 . 05%, FeS040 . 001%，蔗糖3.0%，其余為蒸餾水；所述的蛋白提取液的組成成分及其比例為含有 體積百分含量為0. 05%的Tween-20和質量百分含量為0. 2%的PVP-40T的磷酸鹽緩沖液；(b)將步驟(a)所得的棉花黃萎菌菌絲蛋白與完全弗氏左劑混合配制成菌絲蛋白濃度 為lmg/mL的溶液，對健康家兔進行背部皮下和腿部肌肉多點注射，并設一只不注射免疫抗 原的家兔做對照；每隔15d進行一次免疫，注射的抗原溶液為將上述棉花黃萎菌菌絲蛋白 與不完全弗氏左劑配制成的濃度為lmg/mL的抗原溶液，對首次免疫的家兔進行背部皮下 和腿部肌肉多點注射；每次免疫前進行皮下取血，檢測抗體的產生程度；免疫5次后耳靜脈 采血，分別得到棉花黃萎菌抗血清和陰性血清對照；(c)將采集的棉花黃萎菌抗血清和陰性血清對照，25°C靜置4h，然后4°C靜置過夜， 讓血清充分析出；在4°C、5000rpm條件下離心30min，棄沉淀；將所得上層血清在4°C、 15000rpm條件下再離心lOmin，棄沉淀，獲得更純的抗血清；(d)將步驟(c)所得的抗血清lmL溶于9mL超純水中，加入飽和硫酸銨溶液10mL，冰浴 1 2h ；在lOOOOrpm條件下離心lOmin，棄上清液；將所得沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液中，4°C 透析過夜；將透析過的溶液通過protien-A柱，在280nm獲得兩個吸收峰，第一個吸收峰為 未被protien-A特異吸附的雜蛋白，第二個吸收峰所對應的蛋白為protien-A特異吸附的 多克隆抗體蛋白；收集第二個吸收峰，即為純化的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體。
10.按照權利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述的生物素標記抗體，按照如下方 法進行制備將N-羥基琥珀酰亞胺酯生物素lmg溶于lmL 二甲基亞砜(DMS0)中；將濃度 為lmg/mL的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體lmL在碳酸鹽緩沖液中4°C透析過夜；透析 后的棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體lmL加N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液lOOyL，室溫反應 30min ；再加入濃度為1M的Tris_HC1100 u L終止反應；在質量百分含量為0. 85%的NaCl 溶液中4°C透析過夜，得到生物素標記抗體。
全文摘要
本發明公開了一種棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒，包括棉花黃萎菌菌絲蛋白多克隆抗體和生物素標記抗體，以及酶標板、陽性對照、陰性對照、緩沖液、封閉液、洗滌液、親和素、顯色劑和終止液等。本發明還公開了利用所述棉花黃萎菌酶聯免疫檢測試劑盒檢測棉花黃萎菌的方法。本發明具有靈敏度高、操作簡便、重復性好、檢測結果穩定可靠、對儀器要求低等優點，尤其本發明使用棉花黃萎菌菌絲蛋白作為免疫原制備抗血清，方便簡潔，成本低，適于進行大規模的檢測，本發明為棉花黃萎病的早期診斷和防治以及棉花雜交育種后代的早期選擇提供了有效的技術手段。
文檔編號G01N33/569GK101975858SQ20101050826
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀云 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所