專利名稱：來自米曲霉的羧肽酶和編碼該酶的核酸的制作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及具有羧肽酶活性的多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列。本發明也涉及包含該核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞以及產生所說多肽的方法。本發明還涉及獲得作為香味改良劑有用的蛋白質水解產物的方法。相關技術的描述各種食品(例如，湯、調味料和調味品)包含由蛋白質物質水解獲得的調味劑。這種水解通常利用強鹽酸，接著用氫氧化鈉中和完成。然而，這類化學水解導致水解期間所獲得的氨基酸的嚴重降解，也導致在這一化學反應過程中形成危險的副產物。對利用由化學水解獲得的調味劑的日益關注已導致酶促水解方法的發展。
酶促水解方法旨在獲得高水解度(DH)，這通常利用非特異性作用的蛋白水解酶復合物(例如非特異性作用的內和外肽酶)達到。例如，WO 94/25580描述了通過利用得自米曲霉的非特異性作用的酶制劑水解蛋白質的方法。特異性作用的蛋白水解酶還沒有用于這一目的，因為這類酶僅導致不完全水解。
酸性羧肽酶(EC 3.4.16)是絲氨酸外肽酶，該酶催化從肽、寡肽或蛋白質的C末端除去氨基酸。這些羧肽酶通常具有窄的底物特異性，即，它們僅可切割較少的氨基酸。
米曲霉的酸性羧肽酶以前已報道了。例如，Nakadai，Nasuno和Iguchi，1972，農業和生物化學361343-1352，公開了分子量為120kDa(凝膠過濾)并在pH為3.0至4.0范圍有最大活性的羧肽酶I。Nakadai，Nasuno和Iguchi，1972，農業和生物化學361473-1480，公開了分子量為105kDa(凝膠過濾)并在pH為3.0有最大活性的羧肽酶II。Nakadai，Nasuno和Iguchi，1972，農業和生物化學361481-1488，公開了分子量為61kDa(凝膠過濾)和3.0的pH為最佳值的羧肽酶III。Nakadai，Nasuno和Iguchi，1972，農業和生物化學371237-1251公開了分子量為43kDa(凝膠過濾)并在pH為3.0有最大活性的羧肽酶IV。Tekeuchi和Ichishima，1986，農業和生物化學50633-638公開了分子量為73kDa(SDS-PAGE)的羧肽酶O。Tekeuchi，Ushijima和Ichishima，1982，現代微生物學719-23公開了分子量都為63kDa(凝膠過濾)并在pH為3.7至4.0范圍有最大活性的羧肽酶O-1和羧肽酶O-2。Ichishima等，1972，生物化學雜志721045-1048公開了幾種曲霉屬酸性羧肽酶的酶促性質的比較。Azarenkova等，1976，Biokhimiva 4120-27公開了來自米曲霉的分子量為37kDa(SDS-PAGE)并具有4至5的pH最佳值的一種酸性羧肽酶的分離物。
具有理想的感官特性和高水解度的蛋白質水解產物的產生一般需要混合利用肽酶活性。理想的是提供一種單一組分的肽酶，該酶具有利于改進單獨或與其它酶結合用于食品的蛋白質水解產物的感官特性和水解度的活性。
本發明的目的是提供具有羧肽酶活性的改良的多肽以及獲得具有理想的感官特性和高水解度的蛋白質水解產物的方法。
發明概述本發明涉及具有羧肽酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組(a)包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％等同性的氨基酸序列的多肽；(b)由核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在中等嚴格條件下，與(i)SEQID NO1的核酸序列，(ii)它的互補鏈，(iii)其子序列雜交；(c)一種多肽，其(i)在25℃下，約pH3.0-約pH7.5的范圍有最大活性；(ii)在pH 4，約55℃-約60℃的范圍有最大活性；(iii)在pH4.0和60℃30分鐘后，有至少約65.5％的剩余活性；(iv)具有水解N-CBZ-Ala-X的X的能力，其中N-CBZ是N-芐酯基，X是任何氨基酸；(d)(a)或(b)的等位基因變體；(e)(a)、(b)或(d)的片段，其中該片段保持羧肽酶活性。
本發明也涉及編碼所說多肽的分離的核酸序列和包含核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞以及產生多肽的方法。
本發明也涉及從蛋白質底物獲得水解產物的方法，該方法包括使蛋白質物質受到只具有羧肽酶活性或既具有羧肽酶活性又具有內肽酶活性的多肽的作用，本發明也涉及由此法獲得的水解產物。
本發明也涉及從蛋白質底物獲得富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的水解產物的方法，該方法包括使底物經歷脫酰胺過程和使底物受到具有羧肽酶活性的多肽的作用。
本發明還涉及包含具有羧肽酶活性的多肽的香味改良組合物。該組合物還可包含附加的酶促活性。
最后一個方面，本發明的方法可用于與食品相關的應用以改良香味，如烘烤。另外，食品的香味改良可以通過添加用本發明的方法所獲得的水解產物達到。
附圖的簡要描述

圖1顯示米曲霉ATCC 20386羧肽酶I活性對pH的依賴性。
圖2顯示米曲霉ATCC 20386羧肽酶I活性對溫度的依賴性。
圖3顯示米曲霉ATCC 20386羧肽酶I的核酸序列和推定的氨基酸序列(SEQ ID NOS1和2)。
圖4顯示米曲霉ATCC 20386羧肽酶I的序列和其它已知的羧肽酶序列的比較。
發明詳述具有羧肽酶活性的多肽術語“羧肽酶活性”本文定義為肽酶活性，該肽酶活性催化除去肽、寡肽或蛋白質的C-末端氨基酸。以通常的方式定義的羧肽酶活性能夠從肽、多肽或蛋白質的C-末端切割氨基酸X，其中X代表選自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val組成的組的任何氨基酸殘基。可以理解的是具有本發明的羧肽酶活性的分離的多肽對切割肽、多肽或蛋白質的氨基酸序列是非特異性的。
在第一實施方案中，本發明涉及具有某種氨基酸序列的分離的多肽，所說的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約50％的等同程度，優選地至少約60％，優選地至少約70％，更優選地至少約80％，甚至更優選地至少約90％，最優選地至少約95％，甚至最優選地至少約97％，此多肽保持羧肽酶活性(下文的“同源多肽”)。在一個優選的實施方案中，同源多肽具有的氨基酸序列有五個氨基酸，優選地四個氨基酸，更優選地三個氨基酸，更優選地兩個氨基酸，最優選地一個氨基酸不同于SEQ ID NO2的氨基酸序列。對于本發明的目的，兩種氨基酸序列的等同程度通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)以等同性表(一個缺口罰10，一個缺口長度罰10)測定。
優選地，本發明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或等位基因變體及其片段，其中片段保持羧肽酶活性。在更為優選的實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一個更為優選的實施方案中，本發明的多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段，其中片段保持羧肽酶活性。在最優選的實施方案中，多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
優選地，所說片段包含至少300個氨基酸殘基，更優選地至少400個氨基酸殘基，最優選地至少500個氨基酸殘基。
等位基因變體表明占據相同染色體基因座的任意兩種或多種其它基因形式。等位基因變異通過突變天然產生，并可導致群體內表型的多態性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽沒有變化)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術語等位基因變體也用來表明由基因的等位基因變體編碼的蛋白質。
同源多肽的氨基酸序列由于一個或多個氨基酸殘基的插入或缺失和/或一個或多個氨基酸殘基由不同的氨基酸殘基取代而不同于SEQ ID NO2的氨基酸序列。優選地，氨基酸變化是較小的，即這是不會明顯地影響蛋白質的折疊和/或活性的保守氨基酸的取代、小的缺失，典型地為1個至約30個氨基酸的缺失、小的氨基或羧基末端延長，如氨基末端甲硫氨酸殘基、達約20-25殘基的小接頭肽或通過改變凈電荷或其它功能利于純化的小延長(如多組氨酸段、抗原表位或結合區)。
保守取代的例子在堿性氨基酸(如精氨酸，賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組中。氨基酸取代一般不改變特異性活性在本領域已知并且已描述，例如，由H.Neurath和R.L.Hill，1979，在蛋白質，紐約學院出版社中。存在的最普通的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及它們的逆轉。
在第二個實施方案中，本發明涉及由核酸序列編碼的具有羧肽酶活性的分離的多肽或該多肽的等位基因變體和片段，其中所說的核酸序列在低嚴格條件，更優選地在中等嚴格條件，最優選地在高嚴格條件下與在相同條件下和SEQ ID NO1的核酸序列或它的互補鏈雜交的寡核苷酸探針雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約)。
雜交表明核酸序列和對應于SEQ ID NO1顯示的核酸序列的多肽編碼部分的寡核苷酸探針在由低到高的嚴格條件下雜交(即，42℃下在5XSSPE，0.3％SDS，200mg/ml剪切和變性的鮭精DNA和25、35或50％甲酰胺中分別在低、中和高嚴格下預雜交和雜交)，是按照標準Southern印跡方法進行的。
SEQ ID NO2的氨基酸序列或其部分氨基酸序列可用于設計寡核苷酸探針，或者編碼本發明多肽的核酸序列，如SEQ ID NO1的核酸序列或其子序列可用于從不同屬或種的菌株按照本領域眾所周知的方法鑒定和克隆編碼具有羧肽酶活性的多肽的DNA。尤其是，這類探針可用于與興趣屬或種的基因組或cDNA雜交，按照標準Southern印跡方法進行，以鑒定和分離其中對應的基因。這類探針可以比整個序列短得多，但長度應該至少為15，優選地至少25，更優選地至少40個核苷酸。更長的探針也可以利用。DNA和RNA探針都可以利用。典型地，探針是為檢測對應的基因標記的(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。
因此，為獲得可與上述的探針雜交且編碼有羧肽酶活性的多肽的DNA，可篩選從這類其它有機體制備的基因組、cDNA或組合的化學文庫。這類其它有機體的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術分離。文庫的DNA或分離的DNA可轉移到并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體物質上。為鑒定與SEQ ID NO1同源的克隆或DNA，載體物質用于Southern印跡，其中載體物質每次用2×SSC、0.2％SDS在至少50℃，更優選地至少55℃，更優選地至少60℃，更優選地至少65℃，更優選地至少70℃，最優選地至少75℃的溫度最后洗滌三次，達30分鐘。在這些條件下，與寡核苷酸探針雜交的分子利用X-射線膠片檢測。
在第三個實施方案中，本發明涉及一些分離的多肽它們(i)在25℃下約pH3.0至約pH7.5范圍有最大活性；(ii)在pH 4約55℃至約60℃范圍有最大活性；(iii)在pH 4.0和60℃下30分鐘后，至少有約65.5％的殘余活性；(iv)具有水解N-CBZ-Ala-X的能力，其中X是任何氨基酸。優選地，多肽在大約4.0至大約6.0的pH范圍和25℃下，最優選地在大約4.0至大約5.0的pH范圍下具有最佳活性。多肽也優選具有通過SDS-PAGE的約66kDa-約70kDa的分子量范圍。此外，優選地多肽具有至少約60％，最優選地至少65％的剩余活性，最優選地，在pH4.0和60℃下10分鐘后，剩余活性在50-85％的范圍。優選地，本發明的多肽也有至少約70％，最優選地至少75％的剩余活性，最優選地，在pH4.0和55℃下30分鐘后，剩余活性在65-90％的范圍。優選地，多肽能夠水解N-CBZ-Ala-X，其中X是Ile、Glu、Lys、Arg、Asp、Asn、Phe或Tyr。
在第四個實施方案中，本發明涉及與具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽有免疫化學等同性或部分免疫化學等同性的分離的多肽。免疫化學性質由通過眾所周知的Ouchterlony雙向免疫擴散方法的免疫學交叉反應等同性試驗測定。具體地說，抗血清按照由Harboe和Ingild，在N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks編輯的定量免疫電泳手冊，Blackwell科學出版社，1973，第23章或Johnstone和Thorpe，實用免疫化學，Blackwell科學出版社，1982(更具體地在27-31頁)中描述的方法通過免疫兔(或其它嚙齒類)制備，其中抗血清含有免疫活性的或結合到具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽表位上的抗體。具有免疫化學等同性的多肽是一種以相同的方式(如利用特異性免疫化學技術，沉淀的全部融合、相同的沉淀的形態學和/或相同的電泳遷移率)與抗血清反應的多肽。免疫化學等同性的進一步解釋由Axelsen、Bock和Kroll，在N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks編輯的定量免疫電泳手冊，Blackwell科學出版社，1973，第10章中描述。有部分免疫化學等同性的多肽是以部分相同的方式(如利用特異性免疫化學技術，沉淀的部分融合、部分相同的沉淀的形態學和/或部分相同的電泳遷移率)與抗血清反應的多肽。部分的免疫化學等同性的進一步解釋由Bock和Axelsen在N.H.Axelsen，J.Kroll和B.Weeks編緝的定量免疫電泳手冊，Blackwell科學出版社，1973，第11章中描述。
由與寡核苷酸探針雜交的核酸序列編碼的多肽可從任何屬的微生物獲得，其中寡核苷酸探針可與SEQ ID NO1的核酸序列或它的互補鏈或多肽的等位基因變體和片段、同源多肽和具有相同或部分相同免疫性質的多肽雜交。
在一個更優選的實施方案中，這些多肽從細菌源獲得。例如，這些多肽可從革蘭氏陽性細菌(如芽孢桿菌菌株(例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌)或鏈霉菌屬(例如，變鉛青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌)菌株)或從革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌或假單胞菌某種)獲得。
在另一個優選的實施方案中，這些多肽從真菌源獲得。例如，多肽可獲自酵母菌株，例如，假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母、酵母屬、裂殖酵母屬或洋蓍草屬菌株。在一個優選的實施方案中，多肽獲自卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母或Saccharomyces oviformis菌株。多肽也可獲自絲狀真菌菌株。例如，多肽可獲自頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球酵母屬、Filibasidium、鐮刀菌屬、腐質霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、Talaromyces、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬菌株。在最優選的實施方案中，多肽獲自棘孢曲霉、泡盛曲霉、Aspergillus foetidus、Aspergillusjaponicus、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、檎葉槭鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、Fusariumsulphureum、Fusarium toruloseum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌、產紫青霉、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康寧木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉菌株。
此外，這類多肽可利用上述的探針從包括天然分離的微生物的其它源(例如，土壤、堆肥、水等)中鑒定和獲得。用于把微生物從天然生境分離的技術在本領域是眾所周知的。然后，核酸序列可以通過類似地篩選另一個微生物的基因組或cDNA文庫獲得。一旦把編碼多肽的核酸序列用探針檢測出來，可通過利用對本領域普通技術人員已知的技術分離或克隆序列(參見，例如，Sambrook等，1989，同上)。
優選地，本發明的多肽得自曲霉屬物種，包括但不限于棘孢曲霉、泡盛曲霉、Aspergillus foeridus、Aspergillus japonicus、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。公眾可從許多培養物保藏中心(如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和農業研究服務機構專利培養物保藏中心、北方區域研究中心(NRRL))得到這些物種的菌株。
在一個更優選的實施方案中，本發明的多肽(例如，具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽)得自米曲霉菌株，最優選地，得自米曲霉ATCC 20386或其突變菌株。
本發明的多肽也可得自微生物，此微生物與由Raper，K.D.和Fennel，D.I.，1965，曲霉屬，Wilkins公司，Baltimore定義的曲霉屬是異名的同類。曲霉是有絲分裂孢子的真菌，以具有由分生孢子菌柄組成的灑水器為特征，沒有已知的以泡囊結束的有性型狀態，此真菌反過來具有一層或兩層同時形成的不同地稱作小梗或瓶梗的特化細胞和無性生殖形成的稱作分生孢子的孢子。已知的曲霉屬的有性型包括散囊菌屬、Neosartorya和裸孢殼(Emericella)。曲霉屬及它們有性型的菌株在許多培養物保藏中心(如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau VoorSchimmelcultures(CBS)和農業研究服務機構專利培養物保藏中心、北方區域研究中心(NRRL))易為公眾得到。
對于本發明的目的，用于本文的，與一個給定的源相關的術語“得自”將意味著多肽由該源或由其中源基因已經插入的細胞產生。
如本文定義的，“分離的”多肽是實質上無其它非羧肽酶多肽，例如，如由SDS-PAGE測定的，純度至少約20％，優選地純度至少約40％，更優選地純度約60％，更優選地純度約80％，最優選地純度約90％，最優選地純度約95％。
核酸序列本發明也涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列。在一個優選的實施方案中，核酸序列編碼得自曲霉屬(例如，米曲霉)的多肽，在一個更優選的實施方案中，核酸序列得自米曲霉ATCC 20386(例如，SEQ ID NO1的核酸序列)。在另一個更優選的實施方案中，核酸序列是質粒pEJG12中所包含的序列，其中該質粒包含在大腸桿菌NRRL B-21616中。本發明也包含編碼多肽的核酸序列，其中，多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，且由于遺傳密碼的簡并性不同于SEQ ID No1。本發明也涉及編碼保持羧肽酶活性的SEQ ID NO2片段的SEQ ID No1子序列。優選地，子序列包含至少900個核苷酸，更優選地至少1200個核苷酸，最優選地至少1500個核苷酸。
如上所述，核酸序列可得自微生物，此微生物由Raper，K.D.和Fennel，D.I.，1965，同上定義為米曲霉的異名的同類或有性型。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術在本領域是已知的，且包括從基因組DNA、cDNA制劑、或它們的組合物中分離。可以影響本發明的這類基因組DNA的核酸序列的克隆，例如，通過利用眾所周知的聚合酶鏈反應(PCR)或篩選表達文庫的抗體以檢測有共用結構特征的克隆的DNA片段。參見，例如，Innis等，1990，PCR方法和應用指導，紐約學院出版社。可利用其它核酸擴增方法(如連接酶鏈反應(LCR)、連接的活化轉錄(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。核酸序列可從曲霉屬菌株或另一種或相關的有機體克隆，因此，例如，可以是核酸序列的多肽編碼區的等位基因或物種變體。
用于本文的術語“分離的核酸序列”指實質上無其它核酸序列的核酸序列，例如，如通過瓊脂糖電泳測定的，純度至少約20％，優選地純度至少約40％，更優選地純度至少約60％，更優選地純度至少約80％，最優選地純度至少約90％。例如，分離的核酸序列可通過用于基因工程的標準克隆方法獲得，以將核酸序列從它的天然位置重新定位到其將在此再生的不同位點。克隆過程包括切除和分離包含編碼多肽的核酸序列的要求的核酸片段，把片段插入載體分子，把重組載體導入宿主細胞，在其中復制核酸序列的多個拷貝或克隆。核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成來源的或它們的任何組合。
本發明也涉及編碼活性多肽的，與核酸序列SEQ ID NO1有至少約50％，優選地約60％，優選地約70％，優選地約80％，更優選地約90％，更優選地約95％，最優選地約97％的同源性的核酸序列。對于本發明的目的，兩種核酸序列之間的同源程度通過Clustal方法(Higgins，1989，同上)以等同性表(一個缺口罰10，一個缺口長度罰10)測定。
編碼本發明的多肽的核酸序列的修飾對合成實質上類似于該多肽的多肽是必要的。術語與多肽“實質上類似”指多肽的非天然存在形式。這些多肽以某些工程方法可以不同于從其天然源分離的多肽。例如，利用例如位點特異性誘變，它可對合成多肽變體是有益的，其中，變體在特異性活性、熱穩定性、最適pH或類似的方面不同。在如編碼SEQ ID NO1部分序列(例如，它的子序列)的多肽代表的核酸序列基礎上可構建類似的序列，和/或通過導入核苷酸取代構建，該取代不產生由核酸序列編碼的多肽的另一種氨基酸序列，但符合為產生酶計劃的宿主有機體的密碼子用法，或通過導入可產生不同氨基酸序列的核苷酸取代構建。對于核苷酸取代的一般描述，參見，例如，Ford等，1991，蛋白質的表達和純化295-107。
對本領域技術人員明顯的是這類取代可在對分子功能關鍵性的區域外部進行，并仍產生活性多肽。對由本發明的分離的核酸序列編碼的多肽活性必要的，因此，優選地不易被取代的氨基酸殘基可按照本領域已知的方法(如位點特異性誘變或丙氨酸掃描誘變)鑒定(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，科學2441081-1085)。在后一種技術中，在分子的每個帶正電荷殘基中導入突變，檢測產生的突變體分子的羧肽酶活性以確定對分子活性關鍵性的氨基酸殘基。底物-酶的作用位點也可以通過三維結構的分析(如核磁共振分析、晶體學或光親和標記技術)測定(參見，例如，de Vos等，1992，科學255306-312；Smith等，1992，分子生物學雜志224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 30959-64)。
本發明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在多肽或其片段的N末端或C末端融合。融合的多肽通過融合編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)到本發明的核酸序列(或其部分)上產生。產生融合多肽的技術在本領域是已知的，且包括連接編碼多肽的編碼序列使它們符合讀框，且使融合的多肽在相同的啟動子和終止子控制下表達。
本發明也涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列，該序列在低嚴格的條件，更優選地在中等嚴格條件，最優選地在高嚴格條件下與寡核苷酸探針雜交，該探針在相同條件下與SEQ ID NO1核酸序列或它的互補鏈；或其等位基因變體和子序列雜交(Sambrook等，1989，同上)。
核酸構建體本發明也涉及包含本發明可操作連接到一種或多種調控序列上的核酸序列的核酸構建體，這些調控序列在與控制序列相容的條件下，在合適的宿主細胞中指導編碼序列的表達。表述過程將理解為包括任何多肽產生中所涉及的步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構建體”本文定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，該核酸分子從天然存在的基因分離或為包含以某種天然存在的方式結合和并列的核酸片段已經修飾。當核酸構建體包含表達本發明的編碼序列所要求的所有調控序列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。本文所定義的術語“編碼序列”是置于上述的調控序列的控制下，轉錄為mRNA且翻譯為本發明的多肽的序列。一般地，編碼序列的界線由5′末端的翻譯起始密碼子ATG和3′末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
為使編碼本發明的多肽的分離的核酸序列表達多肽，可以通過各種方式操作。編碼多肽的核酸序列插入載體前的操作要求或必須依賴于表達載體。利用克隆方法修改核酸序列的技術在本領域是眾所周知的。
本文定義的術語“調控序列”包括所有對本發明的多肽表達必要或有利的組分。每一種調控序列可以是天然的或與編碼多肽的核酸序列無關。這類調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉錄終止子。最少地，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯終止信號。為引入利于調控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區連接的特異性限制位點，可以為調控序列提供接頭。術語“可操作地連接”本文定義為構型，其中調控序列適當地置于與DNA序列的編碼序列相關的位置，這樣調控序列指導多肽的產生。
調控序列可以是適合的啟動子序列，即表達核酸序列的宿主細胞可識別的核酸序列。啟動子序列包含調節多肽表達的轉錄調控序列。啟動子可以是任何核酸序列，該核酸序列在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性(包括突變的、截短的和雜合啟動子)，且可從編碼胞外或胞內任意與宿主細胞同源或異源的多肽的基因獲得。
用于指導(尤其在細菌宿主細胞中)轉錄本發明的核酸構建體的適合啟動子的實例，是得自大腸桿菌乳糖操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖生成酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因以及原核β-內酰胺酶基因的啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學院論文集753727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學院論文集8021-25)。在科學的美國人的“重組細菌的有用蛋白質”，1980，24274-94和Sambrook等，1989，同上中描述了另外的啟動子。
用于指導在絲狀真菌宿主細胞中轉錄本發明的核酸構建體的適合啟動子的實例，是得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizommucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因(如美國專利No.4,288,627中描述的，本文一并參考)和它們的突變的、截短的以及雜合啟動子。用于絲狀真菌宿主細胞中的特別優選的啟動子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(得自編碼黑曲霉的中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構酶的基因的雜合啟動子)和glaA啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子得自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。酵母宿主細胞的另一個有用的啟動子由Romanos等，1992，酵母8423-488描述。在哺乳動物宿主細胞中，有用的啟動子包括病毒啟動子(如得自猴病毒40(SV40)、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺病毒和牛乳頭瘤病毒(BPV)的病毒啟動子)。
調控序列也可以是適合的轉錄終止序列，即由宿主細胞識別的終止轉錄的序列。終止序列可操作連接到編碼多肽的核酸序列的3′末端。在選擇的宿主細胞中任何有功能的終止子都可用于本發明。
絲狀真菌宿主細胞的優選的終止子得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
酵母宿主細胞的優選的終止子得自編碼釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。酵母宿主細胞的其它有用的終止子由Romanos等描述，1992，同上。哺乳動物宿主細胞的終止子序列在本領域是眾所周知的。
調控序列也可以是適合的前導序列，即對宿主細胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區。前導序列可操作連接到編碼多肽的核酸序列的5′末端。在選擇的宿主細胞中任何有功能的前導序列都可用于本發明。
絲狀真菌宿主細胞的優選的啟動子得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構酶的基因。
酵母宿主細胞的適合啟動子得自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)。
調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，該序列可操作連接到核酸序列的3′末端，轉錄時，由宿主細胞作為信號識別以增加聚腺苷殘基至所轉錄的mRNA中。任何選擇的宿主細胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可用于本發明。
絲狀真菌宿主細胞的優選的聚腺苷酸化序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶以及黑曲霉α-糖苷酶的基因。
對酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，分子細胞生物學155983-5990描述。哺乳動物宿主細胞的聚腺苷酸化序列在本領域是眾所周知的。
調控序列也可以是信號肽編碼區，該區編碼連接到多肽氨基末端的氨基酸序列，其可以指導所編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核酸序列的編碼序列5′末端可以內在地包含信號肽編碼區，該區在翻譯讀框與編碼分泌多肽的編碼區段天然連接。另外，編碼序列的5′末端可以包含與編碼序列無關的信號肽編碼區。通常，編碼序列不包含信號肽編碼區時，可能需要外源信號肽編碼區。另外，外源信號肽編碼區只可以取代天然信號肽編碼區以獲得多肽的提高的分泌。信號肽編碼區可以得自曲霉屬物種的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、Rhizomucor物種的脂肪酶或蛋白酶基因、釀酒酵母的α-因子基因、芽孢桿菌屬物種的淀粉酶或蛋白酶基因或小牛前凝乳酶原基因。然而，指導表達的多肽進入選擇的宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區都可用于本發明。
細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是得自芽孢桿菌NCIB11837的產麥芽淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草桿菌素基因、地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢桿菌PrsA基因的信號肽編碼區。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，微生物學綜述57109-137描述。
絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是得自來曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola lanuginosa纖維素酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶基因的信號肽編碼區。
酵母宿主細胞的有用信號肽得自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因。其它有用的信號肽的編碼區由Romanos等，1992，同上描述。
調控序列也可以是前肽的編碼區，編碼定位在多肽氨基末端的氨基酸序列。產生的多肽作為前酶或前多肽(或某些情況下作為酶原)是已知的。前多肽通常是無活性的，并可從前多肽通過催化或自動催化切割前肽轉化為成熟的活性多肽。前肽的編碼區可得自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因或Myceliophthora thermophila漆酶基因(WO 95/33836)。
本發明的核酸構建體也可包含一種或多種核酸序列，該核酸序列編碼一種或多種對指導多肽表達有利的因子((例如，激活物(例如，反式作用因子)、陪伴分子以及加工蛋白酶)。任何在選擇的宿主細胞中有功能的因子都可用于本發明。編碼一種或多種這些因子的核酸與編碼多肽的核酸序列未必是一前一后的。
激活物是激活編碼多肽的核酸序列轉錄的蛋白質(Kudla等，1990，EMBO雜志91355-1364；Jarai和Buxton，1994，現代遺傳學262238-244；Verdier，1990，酵母6271-297)。編碼激活物的核酸序列可得自編碼嗜熱脂肪芽孢桿菌NprA(nprA)、釀酒酵母血紅素激活物蛋白質1(hapl)、釀酒酵母半乳糖代謝蛋白質4(gal 4)以及構巢曲霉氨調節蛋白質(areA)的基因。對于進一步的例子，參見Verdier，1990，同上和MacKenzie等，1993，普通微生物學雜志1392295-2307。
陪伴分子是協助另一種多肽適當折疊的蛋白質(Hartl等，1994，TIBS1920-25；Bergeron等，1994，TIBS 19124-128；Demolder等，1994，生物技術雜志32179-189；Craig，1993，科學2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然35533-45；Puig和Gilbert，1994，生物化學雜志2697764-7771；Wang和Tsou，1993，FASEB雜志71515-11157；Robinson等，1994，生物/技術1381-384)。編碼陪伴分子的核酸序列可得自編碼枯草芽孢桿菌GroE蛋白質、米曲霉蛋白質二硫化物異構酶、釀酒酵母鈣聯接蛋白、釀酒酵母BiP/GRP78以及釀酒酵母Hsp70的基因。進一步的實施例參見Gething和Sambrook，1992，同上和Hartl等，1994，同上。
加工蛋白酶是切割前肽以產生成熟的有生物化學活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母1067-79；Fuller等，1989，美國國家科學院論文集861434-1438；Julius等，1984，細胞371075-1089；Julius等，1983，細胞32839-852)。編碼加工蛋白酶的核酸序列可得自編碼釀酒酵母二肽基氨基肽酶、釀酒酵母Kex2和Yarrowia lipolytica二元加工內蛋白酶(xpr6)的基因。
理想的也可加入使得可相對于宿主細胞的生長調節多肽表達的調節序列。調節系統的實例是使基因表達打開或關閉以響應化學或物理刺激的調節系統，包括調節化合物的存在。原核生物系統中的調節系統將包括lac、tac和trp操縱子系統。在酵母中，可以利用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可用作調節序列。調節序列的其它實例是使得基因擴增的序列。在真核生物系統中，這些調節序列包括氨甲蝶呤存在時擴增的二氫葉酸還原酶基因和以重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調節序列可操作地連接。
表達載體本發明也涉及包含本發明的核酸序列、啟動子以及轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體。上述的各種核酸和調控序列可連接在一起以產生重組表達載體，此載體可包括一個或多個方便的限制酶切位點使得在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。另外，本發明的核酸序列可通過將核酸序列或包含該序列的核酸構建體適合表達的載體中來表達。在構建表達載體時，編碼序列定位在載體中使得編碼序列與用于表達及可能用于分泌的適合的控制序列可操作地連接。
重組表達載體可以是可便利地受重組DNA過程的作用并可引起核酸序列表達的任何載體(例如，質粒或病毒)。載體的選擇典型地取決于載體與載體將引入的宿主細胞的相容性。載體可以是線型的或閉環狀質粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如，質粒、染色體外因子、小型染色體或人工染色體。載體可以包含任何用以保證自我復制的手段。載體也可以在引入宿主細胞時整合進入基因組，并與其整合進入的染色體一起復制。載體系統可以是單個的載體或質粒或兩個或多個載體或質粒，它們共同包含將被引入宿主細胞基因組或轉座子中的全部DNA。
本發明的載體優選地包含一種或多種選擇性標記，這類標記使得轉化的細胞容易選擇。選擇性標記是一種基因，其產物具有生物殺傷劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、針對營養缺陷型的原養型及其類似的性質。細菌的可選擇標記的例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或給與抗生素抗性(如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性)的標記。常用的哺乳動物的標記是二氫葉酸還原酶基因。酵母宿主細胞的適合的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記可選自包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶、sC(硫酸腺苷轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)的組和glufosinate抗性標記以及其它物種的等價物。優選的用于曲霉屬細胞的標記是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌的bar基因。此外，選擇可以通過共轉化完成，例如，如WO 91/17243中所述的，其中選擇性標記在單獨的載體上。
本發明的載體優選地包含一種元件，此元件使得載體穩定的整合進入宿主細胞基因組，或使細胞中載體的自我復制不依賴于細胞的基因組。
當把本發明的載體引入宿主細胞時，它可以整合進入宿主細胞的基因組。對于整合，載體可依賴于編碼多肽的核酸序列或載體的用于通過同源或異源的重組把載體穩定整合進入基因組的其它元件。另外，載體可包含用于指導通過同源重組整合進入宿主細胞基因組的附加核酸序列。附加的核酸序列能使載體在染色體的精確位置整合進入宿主細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件優選地應該包含足夠數量的核酸，如100-1,500個堿基對，優選地400-1,500個堿基對，最優選地800-1,500個堿基對，且和對應的靶序列是高度同源的以提高同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞的基因組的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過異源重組整合進入宿主細胞的基因組。這些核酸序列可以是與宿主細胞基因組的靶序列同源的任何序列，此外，可以是非編碼或編碼序列。
為了自主復制，載體還可以包含使載體能夠在正討論的宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌的復制起點的例子是使得在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184，以及使得在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的例子是2微米的復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合體和ARS4和CEN6的組合體。復制起點可以是具有突變的起點，該突變使其在宿主細胞中對溫度敏感(參見，例如，Ehrlich，1978，美國國家科學院論文集751433)。
一個以上編碼本發明的多肽的核酸序列的拷貝可以插入到宿主細胞中以擴增核酸序列的表達。核酸序列的穩定擴增可以通過把至少一種附加的序列的拷貝整合進入宿主細胞基因組或通過包含具有核酸序列的可擴增的選擇性標記基因獲得，其中，在適當的選擇性試劑存在時，通過培養細胞，可選擇包含選擇性標記基因的擴增拷貝及它的核酸序列的附加拷貝的細胞。
連接上述的元件構建本發明的重組表達載體所利用的方法對本領域技術人員是眾所周知的(參見，例如，Sambrook等，1989，同上)。
宿主細胞本發明也涉及重組宿主細胞，此細胞包含本發明的核酸序列，并方便地用于多肽的重組產生。術語“宿主細胞”包含親本細胞的任何子代，由于復制過程中發生突變，子代與其親本細胞不同。
優選地細胞以包含本發明的核酸序列的載體轉化，其后載體整合進入宿主細胞的染色體中。“轉化”意味著包含本發明核酸序列的載體導入宿主細胞，因此，載體作為染色體整合體或作為自我復制的額外染色體載體保持。由于核酸序列更可能穩定地保持在細胞中，通常認為整合是有利的。進入宿主染色體的載體的整合如上所述的可通過同源或異源重組發生。
對宿主細胞的選擇很大程度上將取決于編碼多肽和其源的基因。宿主細胞可以是單細胞微生物(例如，原核生物)或多細胞微生物(例如，真核生物)。有用的單細胞是細菌細胞(如包括但不限于芽孢桿菌細胞(如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌)或鏈霉菌屬細胞(如變鉛青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌)的革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌和假單胞菌某種))。在一個優選的實施方案中，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。例如，細菌宿主細胞的轉化可通過原生質體的轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，普通分子遺傳學168111-115)、通過利用感受態細胞(參見，例如，Young and Spizizin，1961，細菌學雜志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學雜志56209-221)、通過電穿孔法(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技術6742-751)或通過綴合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，細菌學雜志1695771-5278)來實現。
宿主細胞可以是真核生物，如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。有用的哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、微型倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞或其它可供使用的任何數量的無限增殖化細胞系(如來自美國典型培養物保藏中心)。
在一個優選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。本文利用的“真菌”包括子囊菌亞門、擔子菌亞門、壺菌亞門以及接合菌亞門(如由Hawksworth等，在真菌的Ainsworth和Bisby辭典，第8版，1995，英國劍橋國際民用航空局，大學出版社)以及卵菌亞門(如在Hawksworth等，1995，同上，171頁中引用)和所有有絲分裂孢子的真菌(Hawksworth等，1995，同上)。子囊菌亞門代表類型包括例如，鏈孢霉屬、正青霉屬(＝Penicillium)、裸孢殼屬(＝Aspergillus)、散囊菌屬(＝Aspergillus)以及以下所列出的真正的酵母。擔子菌亞門的例子包括蘑菇、銹斑病和黑穗病。壺菌亞門的代表類型包括例如，異水霉屬、小芽枝霉屬、雕蝕菌屬以及水生真菌。卵菌亞門的代表類型包括例如，水霉性水生真菌(水霉菌)(如綿霉屬)。有絲分裂孢子的真菌的例子包括曲霉屬、青霉屬、念珠菌屬、和鏈格孢屬。接合菌亞門的代表類型包括例如，根霉屬和毛霉屬。
在一個優選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。本文所利用的“酵母”包括產子囊酵母(內孢霉目)、產擔子孢子酵母以及屬于半知菌類(芽酵菌綱)的酵母。產子囊酵母分為蝕精霉科和酵母科。后者包含四個亞科裂殖酵母亞科(如，裂殖酵母屬)、拿遜酵母亞科、油脂酵母亞科以及酵母菌亞科(如克魯維酵母屬、畢赤酵母屬和酵母屬)。產擔孢子酵母包括白冬孢酵母屬、紫紅孢酵母屬、鎖擲酵母屬、線擔子酵母屬以及Filobasidiella。屬于半知菌類的酵母分為兩個科擲孢酵母科(例如，Sorobolomyces和布勒擲孢酵母屬)和隱球酵母科(例如，念珠菌屬)。由于酵母的分類將來可能變化，為了本發明的目的，將如在酵母的生物學和活性中描述的(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.編輯，Soc.App.Bacteriol.專題研討會系列No.9，1989)定義酵母。酵母生物學和酵母遺傳學的操作在本領域是眾所周知的(參見，例如，酵母的生物化學和遺傳學，Bacil，M.，Horecker，B.J.和Stopani，A.O.M.編輯，第二版，1987；酵母，Rose，A.H.和Harrison，J.S.編輯，第二版，1987；和酵母屬酵母的分子生物學，Strathern等，編輯，1981)。
在一個更優選的實施方案中，酵母宿主細胞是念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母、酵母屬、或洋蓍草屬的一個種的細胞。
在最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母或Saccharomycesoviformis細胞。在另一個最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母細胞。在另一個最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是Yarrowialipolytica細胞。
在一個優選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀的真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門和卵菌門的亞門的所有絲狀形式(如由Hawksworth等，1995，同上定義)。絲狀真菌以具有由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其它復合多糖組成的菌絲體壁為特征。營養體的生長通過菌絲延長，碳分解代謝是專性需氧的。相對地，通過酵母(如釀酒酵母)的營養體生長是由于萌發了單細胞的葉狀體，碳分解代謝可以是發酵。在一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是但不限于支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬、梭孢殼屬、彎勁霉屬和木霉屬的一個種的細胞。
在一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是曲霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是支頂孢屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是鐮孢屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是腐質霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是毛霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是毀絲霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是鏈孢霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是青霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是梭孢殼屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是彎勁霉屬細胞。在另一個更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是木霉屬細胞。
在最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、Aspergillusfoetidus、Aspergillus japonicus、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、檎葉槭鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、Fusarium sulphureum、Fusarium toruloseum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum細胞。在最優選的實施方案中，絲狀真菌親本細胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicola insolens或Humicolalanuginosa細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是米黑毛霉細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Myceliophthora thermophilum細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是粗糙脈孢菌細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是產紫青霉細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Thielavia terrestris細胞。在另一個最優選的實施方案中，木霉細胞是Trichoderma harzianum、康寧木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉細胞。
真菌細胞可以通過包括以本身的已知的方式的原生質體形成、原生質體轉化以及細胞壁的再生轉化。轉化曲霉屬宿主細胞的適合的方法在EP238023和Yelton等，1984，美國國家科學院論文集811470-1474中描述。轉化鐮孢屬某種的適合的方法由Malardier等，1989，基因78147-156或在WO96/00787中描述。酵母可利用由Becker和Guarente，在Abelson中，J.N.和Simon，M.I.編輯，酵母遺傳學和分子生物學指南，酶學方法，第194卷，pp.182-187，紐約學院出版社公司；Ito等，1983，細菌學雜志153163和Hinnen等，1978，美國國家科學院論文集751920描述的方法轉化。哺乳動物的細胞可以利用Graham和Van der Eb的磷酸鈣沉淀方法(1978，病毒學52546)通過直接攝取轉化。
產生方法本發明也涉及用于產生本發明的多肽的方法，此方法包括(a)培養其野生型形式能夠產生多肽的菌株，以產生包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。優選地，該菌株是曲霉屬的。
本發明也涉及用于產生本發明的多肽的方法，此方法包括(a)在對產生多肽有益的條件下培養宿主細胞；和(b)回收多肽。
在兩種方法中，細胞在產生多肽的適合營養培養基中利用本領域已知的方法培養。例如，細胞可以通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵作用(包括連續的、分批的、補料分批或固態發酵)培養，其中發酵是在實驗室或工業發酵罐中，在適合的培養基中或在使多肽表達和/或分離的條件下進行的。利用本領域已知的方法，培養發生在包含碳和氮源以及無機鹽的適合營養培養基中(參見，例如，細菌和酵母的參考；Bennett，J.w.和LaSure，L.編輯，真菌中的更多基因操作，學院出版社，CA，1991)。適合的培養基由市售獲得或可以按照公開的組合物(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌進入營養培養基，則多肽可從培養基直接回收。如果不分泌多肽，則多肽從細胞裂解物回收。
多肽可利用本領域技術人員已知的、對多肽特異的方法檢測。這些檢測方法可包括特異性抗體的利用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定可用于測定多肽的活性。用于測定羧肽酶活性的方法在本領域是已知的，且包括，例如，根據Roth，1971，分析化學43880的方法，鄰苯二醛與二硫蘇糖醇監測酶水解下游離氨基酸的釋放。
產生的多肽可通過本領域已知的方法回收。例如，多肽可通過包括但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發或沉淀的常規方法從營養培養基回收。
本發明的多肽可通過本領域已知的各種方法純化，這些方法包括但不限于色譜(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水色譜、色譜聚焦以及大小排阻色譜)、電泳法(例如，制備性等電聚焦(IEF))、不同溶解性(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(參見，例如，蛋白質純化，J.-C.Janson和LarsRyden編輯，紐約VCH出版社，1989)。
羧肽酶活性的除去或降低本發明也涉及用于產生親本細胞的突變細胞的方法，該方法包括破壞或缺失編碼多肽的核酸序列或其調控序列，這導致突變細胞產生的多肽比親本細胞產生的多肽少。
構建已降低羧肽酶活性的菌株可通過核酸序列的修飾或滅活方便地完成，此核酸序列對細胞中有羧肽酶活性的多肽的表達是必要的。例如，要修飾或滅活的核酸序列可以是編碼對顯示羧肽酶活性必要的多肽或其部分的核酸序列，或此核酸序列可具有來自核酸序列的編碼序列的多肽表達所要求的調節功能。這類調節或調控序列的例子可以是啟動子序列或其功能部分(即，足以影響多肽表達的部分)。其它可能用于修飾的調控序列在上文已描述。
核酸序列的修飾或滅活可通過使細胞誘變并且選擇其中產生羧肽酶能力已降低的細胞進行。可以是特異性的或隨機的誘變，例如，可通過利用適合的物理或化學誘變劑、通過利用適合的寡核苷酸或通過使DNA序列受到PCR產生的誘變進行。此外，誘變可通過任意結合利用這些誘變劑進行。
用于本發明目的的適合的物理或化學誘變劑的例子包括紫外(UV)線、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯、亞硫酸氫鈉、甲酸以及核苷酸類似物。
當利用這類試劑時，典型地，誘變是通過在適合的條件下，在選擇的誘變劑存在時，培養細胞使發生誘變，并選擇顯示降低的羧肽酶活性的細胞或產物進行。
本發明的修飾或滅活多肽的產生可通過引入、取代或除去編碼多肽的核酸序列或其轉錄或翻譯所要求的調節元件中的一個或多個核苷酸完成。例如，可插入或除去核苷酸以導致引入終止密碼子、除去起始密碼子或開放讀框的變化。這類修飾或滅活可按照本領域已知的方法，通過位點特異性誘變或PCR產生的誘變完成。雖然，原則上，修飾可在活體內完成，即，直接在細胞上表達核酸序列以使修飾，但優選的是如以下舉例說明的，修飾在活體外進行。
通過選擇的宿主細胞滅活或降低產物的方便方法的例子是基于基因置換或基因中斷的技術。例如，在基因中斷方法中，對應于內源性基因或興趣基因片段的核酸序列在體外誘變以產生缺損的核酸序列，然后，把此序列轉化進入宿主細胞以產生缺損的基因。通過同源重組，缺損核酸序列取代內源性基因或基因片段。理想的是缺損基因或基因片段也編碼用于選擇轉化體的標記物，其中，該轉化體中編碼多肽的基因已修飾或破壞。
另外，編碼本發明多肽的核酸序列的修飾或滅活可利用與編碼多肽的序列互補的核苷酸序列，通過建立的反義技術進行。更具體地說，利用細胞的產生多肽可通過引入與編碼多肽的核酸序列互補的核苷酸序列降低或除去，其中，該多肽可在細胞中轉錄，并可與細胞中產生的多肽mRNA雜交。因此，在允許互補的反義核苷酸序列與多肽mRNA雜交的條件下，可降低或除去翻譯的多肽的量。
優選的是按照本發明的方法，要修飾的細胞是微生物來源的，例如，真菌菌株適合于所要求的蛋白質產物、細胞的同源物或異源物的產生。
本發明還涉及親本細胞的突變細胞，其包含編碼多肽的核酸序列或其調控序列的破壞或缺失，這導致突變細胞產生的多肽比親本細胞產生的多肽少。
這樣構建的缺乏多肽的突變細胞作為表達同源和/或異源多肽的宿主細胞是特別有用的。因此，本發明也涉及產生同源或異源多肽的方法，該方法包括(a)在有利于產生多肽的條件下，培養突變細胞；和(b)回收多肽。在本文中，術語“異源多肽”定義為不是宿主細胞的天然多肽，其中已修飾改變了天然序列的天然蛋白質或其表達由于用重組DNA技術操縱宿主細胞定量改變的天然蛋白質。
另一方面，本發明也涉及通過產生本發明的多肽以及興趣蛋白質產物的細胞發酵，產生實質上無羧肽酶活性的蛋白質產物的方法。此方法包含在發酵期間或發酵完成后向發酵肉湯加入能夠抑制羧肽酶活性的有效量的試劑，從發酵肉湯回收興趣產物以及有選擇地使回收的產物進一步純化。此方法在以下實施例中進一步說明。
另一方面，本發明涉及產生實質上無羧肽酶活性的蛋白質產物的方法，其中興趣蛋白質產物由細胞中存在的編碼本發明多肽的DNA序列編碼。此方法包括在允許產物表達的條件下培養細胞，使產生的培養肉湯受到聯合的pH和溫度處理以實質上降低羧肽酶活性并從培養肉湯回收產物。另外，聯合的pH和溫度處理可在由培養肉湯回收的酶制劑上進行。聯合的pH和溫度處理可選擇性地與以羧肽酶抑制劑的處理結合利用。
依據本發明的這方面，可能除去至少60％，優選地至少75％，更優選地至少85％，更優選地至少95％，最優選地至少99％的羧肽酶活性。人們期望通過利用這種方法，可完全除去羧肽酶活性。
優選地，聯合的pH和溫度處理以6.5-7的pH范圍和25-40℃的溫度范圍進行足夠時間以達到要求的效果，典型地，30-60分鐘是足夠的。
用于培養和純化興趣產物的方法可通過本領域已知的方法進行。
本發明的產生實質上無羧肽酶活性產物的方法在真核生物多肽，尤其真菌蛋白質(如酶)的產生中特別有利。酶可選自，例如，淀粉酶、脂酶、蛋白酶、溶纖酶、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這類酶的例子包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠溶解酶、過氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、谷氨酰胺轉移酶或木聚糖酶。缺乏羧肽酶的細胞也可用于表達有藥物作用的異源蛋白質，如激素、生長因子、受體和類似物。
要理解的是術語“真核生物多肽”不僅包括天然多肽，而且包含那些已通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這類的修飾以提高活性、耐熱性、pH耐受性和類似性質的修飾的多肽(例如，酶)。
另一方面，本發明涉及通過本發明的方法產生的實質上無羧肽酶活性的蛋白質產物。
產生蛋白質水解產物的方法本發明的多肽可用于蛋白質水解產物的產生以提高水解度和香味發展。
本發明也涉及與內肽酶結合利用本發明的多肽以使富含蛋白質物質的高度水解。此方法包括以多肽和內肽酶處理蛋白質底物。底物可用酶同時或連續處理。
通常，把本發明的多肽以蛋白質水解過程中常規利用的有效量(優選地，為每100g蛋白質約0.1-約100,000 CPDU的范圍，更優選地，為每100g蛋白質約1-約10,000 CPDU的范圍)加至蛋白質底物中。如本文所定義的，一個CPDU(羧肽酶單位)是在pH 4.5和25℃下，每分鐘從0.5mM的N-CBZ-Ala-Glu(Sigma化學公司，St.Louis MO)溶液中釋放1微摩爾谷氨酸的羧肽酶量。
內肽酶可得自芽孢桿菌屬(優選地為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌)菌株、葡萄球菌屬(優選地為金黃色葡萄球菌)菌株、鏈霉菌屬(優選地為Streptomyces thermovularis或Streptomyces griseus)菌株、放線菌屬物種的菌株、曲霉屬(優選地為棘孢曲霉、泡盛曲霉、Aspergillus foetidus、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉)菌株或鐮孢屬(優選地為Fusarium venenatum)菌株。
通常，把內肽酶以蛋白質水解過程中常規利用的有效量(優選地，為每100g蛋白質約0.05-約15AU的范圍，更優選地，為每100g蛋白質約0.1-約8AU的范圍)加至蛋白質底物中。一個AU(Anson單位)定義為標準條件(即25℃、pH 7.5和10分鐘的反應時間)下，以初始速率消化血紅蛋白，使每分鐘釋放的TCA可溶性產物的量以苯酚試劑顯示的顏色與一毫當量的酪氨酸以苯酚試劑顯示的顏色相同的酶量。分析方法AF 4/5經請求可以從NovoNordisk A/S，丹麥得到，這在本文一并參考。
酶處理(即與酶制劑溫育底物)可發生在合適的溫度(該溫度下，酶制劑不失活)，優選地，在約20℃-約70℃的范圍。依據所形成的慣例，酶制劑可通過適當地增加溫育混合物的溫度到酶失活的溫度(例如，約70℃以上)，或類似地通過降低溫育混合物的pH到酶失活的pH(例如，在約4.0以下)而失活。
此外，本發明的方法導致蛋白質底物的水解度提高。如本文所使用的，水解度(DH)是在已由蛋白酶水解的蛋白質中氨基鍵總數的百分數。
本發明的另一方面，水解產物中Leu、Gly、Ala和/或Pro的含量增加，例如，增大1.1倍。
本發明也涉及獲得富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的水解產物的方法，這一方法包括(a)使底物經歷脫酰胺過程；和(b)使具有羧肽酶活性的多肽作用于底物。
兩個步驟可同時進行或第二步驟可以在第一個步驟后進行。
本發明的這些方法產生極好香味的蛋白質水解產物，因為，不論游離的還是肽結合的谷氨酸(Glu)在蛋白質水解產物的香味和適口性中都起重要的作用。這些方法也產生官能度已提高(尤其是，提高溶解性、提高乳化性質、增加水解度及提高起沫性質)的蛋白質水解產物。
通過氨的釋放，由酰胺(谷氨酰胺或天冬酰胺)轉化為荷電酸(谷氨酸或天冬氨酸)被認為是脫酰胺作用。脫酰胺作用可作為非酶促或酶促脫酰胺作用過程發生。
在一個優選的實施方案中，脫酰胺作用作為酶促脫酰胺作用過程(例如，通過使底物受轉谷氨酰胺酶和/或肽谷氨酰胺酶作用)進行。
轉谷氨酰胺酶可是任何方便來源(包括哺乳動物(參見，例如，JP 1050382和JP 5023182)、包括活化因子XIII(參見，例如，WO 93/15234))的；或衍生自魚的轉谷氨酰胺酶(參見，例如，EP 555,649)和得自微生物的轉谷氨酰胺酶(參見，例如，EP 379,606，WO 96/06931和WO 96/22366)。在一個優選的實施方案中，轉谷氨酰胺酶得自卵菌綱(包括Phytophthora(優選地為Phytophthora cactorum)菌株或包括Pythium(優選地為Pythiumirregulare、Pythium sp.、Pythium intermedium、Pythium ultimum或Pythiumperiilum(或Pythium periplocum)菌株。在另一個優選的實施方案中，轉谷氨酰胺酶是細菌來源的，并得自芽孢桿菌菌株(優選地為枯草芽孢桿菌)、鏈霉輪枝孢屬(優選地為Streptoverticillium mobaraensis、Streptoverticilliumgriseocarneum或Streptoverticillium cinnamoneum)菌株和鏈霉菌屬(優選地為Streptomvces lydicus)菌株。
肽谷氨酰胺酶可是肽谷氨酰胺酶I(肽基谷氨酰胺酶；EC 3.5.1.43)或肽谷氨酰胺酶II(蛋白質-谷氨酰胺谷氨酰胺酶；EC 3.5.1.44)或其任意混合物。肽谷氨酰胺酶可得自曲霉屬(優選地為Aspergillus japonicus)菌株、芽孢桿菌(優選地為環狀芽孢桿菌)菌株、隱球菌屬(優選地為Cryptococcus albidus)菌株或德巴利酵母屬(優選地為克洛德巴利酵母)菌株。
通常，把轉谷氨酰胺酶以脫酰胺過程中常規利用的有效量(優選地，為酶制劑相對于底物的量約0.01-約5％(w/w)的范圍，更優選地，為約0.1-約1％(w/w)的范圍)加至蛋白質底物中。
通常，把肽谷氨酰胺酶以脫酰胺過程中常規利用的有效量(優選地，為每100g底物約0.01-約100,000PG酶單位的范圍，更優選地，為每100g底物約0.1-約10,000PG酶單位的范圍)加至蛋白質底物中。
按照Cedrangoro等的方法(1965，酶學29143)，可測定肽谷氨酰胺酶的活性。按照此方法，把0.5ml以1N NaOH調整pH到6.5的酶樣品裝入一小容器中。然后，把1ml pH為10.8的硼酸鹽緩沖液加至容器中。排出的氨由5N硫酸吸收，并通過利用Nessler試劑，使混合物形成在420nm測定的顏色。一個PG酶單位是在這些條件下每分鐘能夠產生1微摩爾氨的酶量。
另外，肽谷氨酰胺酶活性可按照US 3,857,967或以下實施例11描述的方法測定。
在本發明方法的(b)步驟中，使本發明的多肽作用于底物。通常，把本發明的多肽以蛋白質水解過程中常規利用的有效量(優選地，為每100g底物約0.001-約0.5AU的范圍，更優選地，為每100g底物約0.01-約0.1AU的范圍)加至蛋白質底物中。
在另一個實施方案中，本發明的產生富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的水解產物的方法還包括(c)使一種或多種非特異性的內和/或外肽酶作用于底物。
此步驟可與步驟(a)和(b)同時進行，或可接著步驟(a)和(b)進行。
在一個優選的實施方案中，非特異性作用的內和/或外肽酶得自曲霉屬(優選地為黑曲霉、米曲霉、或Aspergillus sojae)菌株、或芽孢桿菌屬(優選地為解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌)菌株。
通常，把非特異性作用的內和/或外肽酶以蛋白質水解過程中常規利用的有效量(優選地，為每100g底物約0.05-約15CPU的范圍，更優選地，為每100g底物約0.1-約5CPU的范圍)加至蛋白質底物中。一個CPU(酪蛋白酶單位)定義為在標準條件(即，在25℃和pH 9.5下溫育30分鐘)下，每分鐘從酪蛋白釋放1微摩爾伯氨基(通過與絲氨酸標準比較測定)的酶量。本文一并參考的分析方法AF 228/1經請求可從Novo Nordisk A/S，Bagsverd，丹麥得到。
每種酶處理可在酶制劑未失活的任意溫度(優選地，在約20℃-約70℃的范圍)進行。然后，酶制劑可通過增加溫度(例如，到約70℃之上)或降低pH(例如，在約4.0之下)滅活。
用于本發明方法的蛋白質底物可由完整的蛋白質、預先水解的蛋白質(即，肽)或其混合物組成。蛋白質底物可以是植物或動物來源的。優選地，蛋白質底物是植物來源的(例如，大豆蛋白質、谷物蛋白質(例如，小麥谷蛋白、玉米谷蛋白、大麥、黑麥、燕麥、稻米、玉米醇溶蛋白、羽扇豆屬植物、棉花種子蛋白質、油菜種子蛋白質、花生、苜蓿蛋白質、豌豆蛋白質、大豆蛋白質、芝麻種子蛋白質或向日葵)。動物來源的蛋白質底物可以是乳清蛋白質、酪蛋白、肉蛋白質、魚蛋白質、紅細胞、卵清蛋白、明膠或乳白蛋白。
本發明也涉及由這些方法產生的蛋白質水解產物。
其它用途本發明也涉及用本發明的多肽滅活酶的方法。
此外，本發明的多肽可對許多要求肽序列特異性裂解的目的是有用的。例如，一些蛋白質或肽以成熟蛋白質的N端包含許多附加氨基酸殘基的無活性前體形式合成。本發明的多肽可提供必要的翻譯后加工以激活這類前體蛋白質。
多肽組合物另一方面，本發明涉及包含本發明多肽的多肽組合物。優選地，組合物富含本發明的多肽。在本文中，術語“富含”表明多肽組合物的羧肽酶活性已增加，例如，富集因子為1.1。
多肽組合物可包含本發明的多肽作為主要的酶促組分(例如，單成分的多肽組合物)。另外，組合物可包含多種酶活性(如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。附加酶借助于屬于曲霉屬(優選地為棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉)或木霉屬、腐質霉屬(優選地為Humicola insolens)或鐮孢屬(優選地為桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、Fusarium sulphureum、Fusarium toruloseum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum)的微生物是可生產的。
在一個優選的實施方案中，本發明涉及包含具有羧肽酶活性的多肽的香味改良組合物。在另一個優選的實施方案中，香味改良組合物還包含一種或多種非特異性作用的內和/或外肽酶。在另一個優選的實施方案中，調味組合物還包含一種或多種特異性作用的內和/或外肽酶。
在一個優選的實施方案中，特異性作用的蛋白酶是一種內肽酶(如谷氨酰內肽酶(EC 3.4.21.19)、賴氨酰內肽酶(EC 3.4.21.50)、亮氨酰內肽酶(EC3.4.21.57)、甘氨酰內肽酶(EC 3.4.22.25)、脯氨酰內肽酶(EC 3.4.21.26)、胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)或胰蛋白酶樣(賴氨酸/精氨酸特異性)內肽酶或肽基-天冬氨酸金屬內肽酶(EC 3.4.24.33))。
優選地，谷氨酰內肽酶(EC 3.4.21，19)可得自芽孢桿菌屬(尤其是地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)菌株、葡萄球菌屬(尤其是金黃色葡萄球菌)菌株、鏈霉菌屬(尤其是Streptomyces thermovulgaris和Streptomyces griseus)菌株或Acrinomyces sp.菌株。
優選地，賴氨酰內肽酶(EC 3.4.21.50)可得自無色桿菌屬(尤其是Achromobacter lyticus)菌株、溶桿菌屬(尤其是產酶溶桿菌)菌株或假單胞菌屬(尤其是銅綠假單胞菌)菌株。
亮氨酰內肽酶(EC 3.4.21.57)可是植物來源的。
優選地，甘氨酰內肽酶(EC 3.4.22.25)可得自番木瓜植物(番木瓜樹)。
優選地，脯氨酰內肽酶(EC 3.4.21.26)可得自產黃菌屬菌株，或它可以是植物來源的。
優選地，胰蛋白酶樣內肽酶可得自鐮孢屬，尤其是尖鐮孢菌株，例如，如WO 89/06270或WO 94/25583中描述的。
優選地，肽基-天冬氨酸金屬內肽酶(EC 3.4.24.33)可得自假單胞菌屬菌株，尤其是Pseudomonas fragi菌株。
在另一個優選的實施方案中，特異性作用的蛋白酶是可從肽兩端作用的外肽酶。
在一個優選的實施方案中，特異性作用的蛋白酶是氨肽酶(如亮氨酰氨肽酶(EC 3.4.11.1)或三肽氨肽酶(EC 3.4.11.4)。
在另一個優選的實施方案中，特異性作用的蛋白酶是羧肽酶(如脯氨酸羧肽酶(EC 3.4.16.2)、羧肽酶A(EC 3.4.17.1)、羧肽酶B(EC 3.4.17.2)、羧肽酶C(EC 3.4.16.5)、羧肽酶D(EC 3.4.16.6)、賴氨酸(精氨酸)羧肽酶(EC3.4.17.3)、甘氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.4)、丙氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.6)、谷氨酸羧肽酶(EC 3.4.17.11)、肽基-二肽酶A(EC 3.4.15.1)或肽基-二肽酶(EC3.4.15.5)。
按照本領域已知的方法，可制備多肽組合物，且可以是液體或干燥組合物的形式。多肽可用本領域已知的方法穩定化。
本發明也涉及包含用本發明方法獲得的蛋白水解產物的食品產品(例如，烘烤產品)。這類食品產品顯示了改善的器管感覺質量(如在香味、適口性、口感、香氣和外殼顏色方面的改善)。
在本文中，術語“烘烤的產品”包括由生面團(軟或脆性的)制備的任何食品。烘烤的產品的例子，不論白的、亮或暗的類型，可由本發明便利地產生的，是面包，尤其是白的、全麥或黑麥面包，典型地，是條或卷、法國baguette型面包、pita面包、tacos、蛋糕、薄煎餅、餅干、脆面包和類似形式的面包。
通常，這類烘烤的產品從包含面粉和水，且典型地是發酵的生面團制備。生面團可以各種方法(如通過加入小蘇打或類似物或通過加入曲(發酵的生面團)發酵，但優選地，生面團通過加入適合的酵母培養物(如釀酒酵母(面包酵母)的培養物)發酵。可使用任何市售的釀酒酵母菌株。
此外，用于制備烘烤產品的生面團可是新鮮或冷凍的。冷凍生面團的制備由K.Kulp和K.Lorenz在“冷凍和冷藏的生面團和糊狀物”中描述。典型地，本發明的香味改良組合物以0.01-5％，優選地0.1-3％的范圍的量包括在生面團中。
在本發明的方法中，把本發明的多肽、內肽酶、轉谷氨酰胺酶、肽谷氨酰胺酶、一種或多種特異性和/或非特異性作用的內和/或外肽酶和/或一種或多種以上詳細說明的酶單獨或同時加至制備生面團的混合物或制備生面團的任何組分(例如，面粉)中。
本發明還涉及生面團和/或由生面團制備的烘烤產品的預混合物(例如，面粉組合物的形式)，其中預混合物包含本發明的香味改良組合物并選擇性地包含一種或多種以上詳細說明的其它酶。
在另一個實施方案中，預混合物包含由本發明的方法獲得的水解產物。
預混合物可通過把有關酶與適合的載體(如面粉、淀粉、食糖或鹽)混合制備。預混合物可包含其它生面團改良/或面包改良添加劑。
在本文中，術語“預混合物”是烘烤劑的混合物，通常包括面粉，是已制備的能在指定的條件下保存，且在生面團制備過程中為處理提供方便。這類預混合物在工業和商業烘烤面包的工廠和設施以及零售面包店可有便利的應用。
本發明也涉及由本發明的方法產生的水解產物作為食品產品(如烘烤食品)添加劑的利用以改善器管感覺的質量(如香味、適口性和香氣)。
由本發明的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的水解產物可用于各種工業應用，尤其是需要功能蛋白質的摻入時。
例如，本發明也涉及包含由本發明的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的水解產物的食品產品和本發明也涉及包含由本發明的方法獲得的富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的水解產物的動物飼料添加劑。
本發明進一步通過下列實施例描述，該實施例不應該限制本發明的范圍。
實施例材料用作緩沖液和底物的化學藥品至少是試劑級的市售產品。
實施例1FLAVOURZYMETM羧肽酶I的純化羧肽酶是從FLAVOURZYMETM肉湯(Novo Nordisk A/S，Bagsverd，丹麥)純化的。首先，把肉湯(20ml；720mg蛋白質)以180ml的20mM pH7.0磷酸鈉緩沖液稀釋，并利用裝有0.45mM過濾器的Nalgene Filterware過濾。把過濾的溶液裝載在用20mM pH7.0的磷酸鈉緩沖液預平衡的包含31ml的Q-Sepharose大珠的24×130mm柱(“Pharmacia Biotech AB”，Uppsala，瑞典)上。利用從7.0(20mM磷酸鈉緩沖液)至5.0(20mM乙酸鈉緩沖液)的pH梯度，然后利用從5.0-3.6(20mM乙酸鈉緩沖液)的pH梯度，洗脫羧肽酶。羧肽酶活性在340nm，利用1.5mM呋喃基丙烯酰丙氨酰賴氨酸作為底物在50mM pH6.0的磷酸鈉緩沖液中監測。收集、集中并利用超濾(Diaflo膜，10PK)濃縮pH4.3和3.6間的組分至25ml。
濃縮的溶液用100ml 20mM pH7.0的磷酸鈉緩沖液稀釋，然后，裝載在用20mM pH7.0的磷酸鈉緩沖液預平衡的包含MonoQ小珠的20×100mm柱(“Pharmacia Biotech AB”，Uppsala，瑞典)上。把羧肽酶在pH7.0 20mM的磷酸鈉緩沖液中以0-1M NaCI梯度洗脫。如上述，監測組分的羧肽酶活性。收集、集中并利用對20mM pH4.0乙酸鈉緩沖液的超濾濃縮0.10-0.13MNaCl的組分。
基于SDS PAGE分析，純化的制劑估測為至少95％是同源的。發現主要帶有大約68kDa(66-70kDa范圍)的分子量。
實施例2蛋白質測序和氨基酸分析的方法來自實施例1肉湯的純化的羧肽酶和羧肽酶的降解片段的N端測序在具有聯機HPLC和液相三氟醋酸(TFA)分送的應用生物系統476A蛋白質測序儀(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA)上進行。把純化的羧肽酶樣品轉印到SDS-PAGE凝膠的Novex PVDF膜(Novex，SanDiego，CA)上，并利用測序試劑從blott藥筒測序(Perkin Elmer/AppliedBiosystems Division，Foster City，CA)。苯乙內酰硫脲氨基酸的檢測通過利用水中包含3.5％四氫呋喃和15-30ml包含乙酸、乙酸鈉和己磺酸鈉的預濃縮物(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA)的緩沖液A和包含乙腈的緩沖液B的聯機HPLC完成。收集并利用應用生物系統610數據分析軟件，在Macintosh IIsi上分析數據。
純化的羧肽酶也易受溴化氰作用產生用于測序的酶的肽片段。把羧肽酶通過在70％甲酸中用幾粒溴化氰晶體重建干燥的純化羧肽酶樣品，并在暗處室溫下溫育18小時，以溴化氰消化羧肽酶。利用10-20％Novex Tricine凝膠(Novex，San Diego，CA)通過SDS-PAGE電泳分離肽片段，并如上述測序。
羧肽酶的N端測序表明已阻斷N端。降解的片段有下列氨基酸序列，其中，括號中的氨基酸殘基不是100％確定的，以？標記的殘基不能測定。劃線的氨基酸殘基與微紫青霉的羧肽酶S1 100％對應肽1？YGGHYGPAF(F)NH(F)(Y)(E)(Q)(N)E(R)(SEQ ID NO3)溴化氰片段的測序顯示下列肽片段序列與微紫青霉的羧肽酶有30-40％是同源的(Svendsen等，1993，FEBS通訊33339-43)肽2(50kDa)DAIGVNI？YTQ？NNDVYYA(SEQ ID NO4)肽3(42kDa)DAIGVNI(N)YTQSNN(D)VYYAFQQTGDFVWPNFIEDL(SEQ ID NO5)肽4(17kDa)(？C)RDNVEGP(？)YAFAGRGVYDIRHPYD(P)(D)(T)(SEQ ID NO6)實施例3純化的羧肽酶I的表征1，10-菲咯啉和苯甲基磺酰氟化物對羧肽酶的抑制作用在pH7.0 20mM磷酸鹽緩沖液(其中，水解在340nm監測)中利用呋喃基丙烯酰丙氨酰賴氨酸作為底物估測。
結果表明1，10-菲咯啉不抑制羧肽酶活性。另一方面，在pH7.0，利用呋喃基丙烯酰丙氨酰賴氨酸作為底物，苯甲基磺酰氟化物完全抑制羧肽酶活性。這些結果表明羧肽酶是絲氨酸蛋白酶。
利用N-CBZ-Ala-Ile作為底物，在50mM乙酸鈉緩沖液(pH 4-7.5)和50mM檸檬酸/KH2PO4緩沖液(pH 2.9和3.9)中，25℃下雙分子常數Kcat/Km的pH依賴性是在pH 4.0-4.5時，具有明顯最佳值的鐘形曲線(圖1)。曲線的右和左支斜率分別顯示為-1和1，這間接顯示酶活性中心包含兩個pK值為3.3和5.7的離子生成基團。
米曲霉ATCC 20386羧肽酶I的活性對溫度的依賴性，在50mM pH4的乙酸鈉緩沖液中利用N-CBZ-Ala-Ile作為底物測定。如圖2顯示的結果表明在pH為4，約55℃-約60℃的溫度范圍觀察到最佳活性。
羧肽酶的底物特異性通過在pH4.0 50mM乙酸鹽緩沖液中，測定表1中列出的底物水解來測定。按照Roth方法，M.，1971，分析化學43880，鄰苯二醛與二硫蘇糖醇一起用于監測在酶促水解條件下，游離Ile、Glu、Lys、Arg、Asp、Asn、Gly、Phe和Tyr的釋放。N-CBZ-Ala-X或N-CBZ-Glu-X水解的Kcat值是基于羧肽酶的分子量是68kD和酶制劑均勻的假設測定的。
已測定羧肽酶具有十分廣的底物特異性，沒有觀察到對芳香族、龐大脂肪族或極性羧基末端氨基酸殘基的優先選擇。羧肽酶、N-CBZ-Ala-Glu、N-CBZ-Ala-Ile、N-CBZ-Ala-Lys、N-CBZ-Ala-Arg及N-CBZ-Ala-Asn的最佳底物有十分不同的末端氨基酸殘基，但在pH4.0下，所有特異性水解的動力學參數值是類似的(表1)。
表1.羧肽酶的底物特異性底物 Km103(M) Kcatb(s-1)Kcat/Km103(M-1s-1)N-CBZ-Ala-Ile 0.11 24218N-CBZ-Ala-Glu 0.10 32320N-CBZ-Ala-Lys 0.12 32270N-CBZ-Ala-Arg 0.11 27246N-CBZ-Ala-Asp 0.27 27100N-CBZ-Ala-Asn 0.09 19216N-CBZ-Ala-Gly 0.92 5.5 6N-CBZ-Ala-Phe 0.24 1772N-CBZ-Ala-Tyr 0.09 17.5 194N-CBZ-Glu-Tyr 0.11 4.7 43羧肽酶也能夠從N-CBZ-Ala-Pro切割Pro。然而，對這種底物，酶的特異性是低的。與很高濃度(4.9×10-7M)的羧肽酶溫育2小時后，僅16％的2mM N-CBZ-Ala-Pro溶液水解。N-CBZ-Ala-Phe是羧肽酶的一種好的底物。Kcat值比來自米曲霉的酸性羧肽酶O-1和O-2至少高8.5倍(Takeuchi和Ichishima，1981，農業生物化學451033，Takeuchi等，1982，現代微生物學719)。
羧肽酶對呋喃基丙烯酰丙氨酰賴氨酸的Km值在pH 4.0，25℃下是0.4mM。
羧肽酶也具有高的熱穩定性。在pH 4.0和60℃下，在50mM乙酸鹽緩沖液中溫育酶10分鐘與來自米曲霉的37kDa羧肽酶(在這種溫度完全失活)相比導致65％的剩余活性(Azarenkova等，1976，Biokhimia 4120)。在pH 4.0和55℃下，在50mM乙酸鹽緩沖液中溫育酶10分鐘導致74％的剩余活性。
羧肽酶活性通過測定N-CBZ-Ala-Glu的特異性水解速率測定。一個羧肽酶單位(CPDU)是在pH4.5和25℃下，每分鐘從0.5mM N-CBZ-Ala-Glu溶液釋放1微摩爾谷氨酸的羧肽酶量。按照Roth，1971，同上的方法，包含鄰苯二醛的試劑與二硫蘇糖醇結合用于監測酶促水解下游離谷氨酸的釋放。鄰苯二醛試劑是0.1M四硼酸鈉中的鄰苯二醛(6mM)和二硫蘇糖醇(6.5mM)溶液。簡言之，20mM pH4.5的乙酸鹽緩沖液中的0.05ml酶溶液與1ml底物溫育。以一定的時間間隔，抽取0.3ml的小份，并與0.9ml的鄰苯二醛試劑混合，利用1cm的路徑長度，測定產物在A340的吸光度。A340與溫育時間是線性關系時，酶的特異性活性利用公式特異性活性＝斜率(每分鐘光密度)×11.35計算。按照這種方法，純化羧肽酶的特異性活性測定為每毫克蛋白質11個CPDU，它等同于每分鐘每毫克蛋白質11微摩爾谷氨酸。實施例4RNA的分離米曲霉菌株ATCC 20386在每升由7.5g土豆淀粉、10g大豆粗粉、2gKH2PO4、5g Na2HPO4.2H2O和0.1g ZnSO4.7H2O組成的培養基中，在發酵罐中培養。在30℃下生長五天后，取兩升樣品，并收集菌絲體，在液態N2中冷凍，并在-80℃保存。全部RNA從冷凍的粉末狀米曲霉ATCC 20386菌絲體通過由硫氰酸胍萃取，其后通過穿過5.7M氯化銫超速離心制備(Chirgwin等，1979，生物化學185294-5299)。按照Aviv和Leder(1972，美國國家科學院論文集691408-1412)，通過寡(dT)-纖維素親和性色譜分離聚(A)+RNA。實施例5cDNA文庫的構建除寡(dT)-NotI錨定引物替代寡(dT)12-18引物用于第一個鏈反應外，如由Gubler和Hoffman(1983，基因25263-269)和Sambrook等(1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港出版杜，冷泉港，紐約)描述的，從5μg實施例4的米曲霉ATCC 20386聚(A)+RNA合成雙鏈cDNA。合成后，把cDNA利用綠豆核酸酶(生命技術，Gaithersburg，MD)處理，以T4 DNA聚合酶鈍化末端(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，并利用約50倍摩爾過量的連接物，連接到非復發的BstXI連接物(Invitrogen，San Diego，CA)上。適應的cDNA以NotI消化，通過瓊脂糖凝膠電泳進行1.2-3.0kb的cDNA的大小分級分離，并連接進入BstXI/NotI切開的pYES2.0載體(Invitrogen，SanDiego，CA)。按照制造廠商的指導，連接混合物用于轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞(生命技術，Gaithersburg，MD)。把由1×106獨立克隆組成的文庫作為單個庫(25,000-30,000集落形成單位/庫)在-80℃下在20％甘油中保存，并作為雙鏈cDNA和連接混合物在-20℃下保存。實施例6米曲霉ATCC 20386羧肽酶I的PCR擴增基于在實施例2中描述的，米曲霉ATCC 20386羧肽酶I部分肽的氨基酸序列，按照制造廠商的指導，以應用的生物系統394型DNA/RNA合成儀，合成以下顯示的簡并寡核苷酸引物以用于PCR擴增米曲霉ATCC 20386羧肽酶I的基因片段正向引物5′-TAYGGNGGICAYTAYGGICCNG-3’(SEQ ID NO7)反向引物5′-ATRAARTTIGGCCAIACRAARTC-3’(SEQ ID NO8)(R＝A或G，Y＝C或T，N＝G或A或C或T，I＝肌苷)利用約1μg從實施例5的米曲霉ATCC 20386 cDNA文庫分離的質粒作為模板制備擴增反應物(100μl)。每種反應物含有下列組分1μg質粒、40pmol正向引物、40pmol反向引物、各200μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1×Taq聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)和2.5個單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。把反應物在Perkin-Elmer480型熱循環儀中溫育循環設計如下循環1-95℃下5分鐘，45℃下2分鐘及67℃下2分鐘；循環2-30-95℃下2分鐘；45℃下一分鐘及67℃下2分鐘。反應產物在1％瓊脂糖凝膠(Eastman Kodak，Rochester，NY)上分離。按照制造廠商的指導，把550bp產物帶從凝膠中切除，并利用GenElute自旋柱(Supelco，Bellefonte，PA)純化。其后，把純化的PCR產物克隆進入pCRII載體(Invitrogen，San Diego，CA)，并利用lac正向和反向引物測定DNA序列(新英格蘭BioLabs，Beverly，MA)。
由約186個密碼子組成的羧肽酶I基因節段(550bp)如圖1顯示用以上所述的羧肽酶特異性PCR引物從米曲霉ATCC 20386擴增。DNA序列分析顯示擴增的基因節段編碼部分相應的米曲酶ATCC 20386羧肽酶I基因。羧肽酶I基因節段用于探測米曲霉ATCC 20386的cDNA文庫。實施例7羧肽酶I克隆的鑒定把米曲霉ATCC 20386的cDNA文庫鋪在以50mg/ml羧芐青霉素補充的Luria瓊脂平板上。集落轉移(Maniatis等，1982，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港出版社，冷泉港，紐約)在約5,000個集落上進行，把DNA利用UVStratalinker(Stratagene，La Jolla，CA)交聯到膜(Hybond N+，Amersham，Arlington Heights，IL)上。把膜在45℃下，在包含5×SSPE、0.3％SDS、50％甲酰胺以及10mg/ml變性且剪切的鯡精子DNA的雜交溶液中，浸三小時。如實施例1描述的，從米曲霉ATCC 20386分離的羧肽酶I基因片段利用隨機引物DNA標記試劑盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國)進行放射性標記，通過加入NaOH至0.1M的終濃度變性，并以每毫升雜交溶液約1×106cpm的活性，加至雜交溶液中。混合物在45℃下，以搖動水浴溫育過夜。溫育后，把膜在55℃在2×SSC中以0.2％SDS洗滌一次，接著，在2×SSC中，在相同溫度下洗滌2次。把膜在印跡紙上干燥15分鐘，以SaranWrapTM包裹，并在-70℃曝露于具有增感屏的X-射線膠卷(Kodak，Rochester，NY)。
六個集落(指定的大腸桿菌DH5a克隆EJG12、EJG12A、EJC12B、EJG12C、EJG12D以及EJG12E)與探針產生強的雜交信號。把六個集落接種到3ml的LB+50μg/ml羧芐青霉素培養基中，并在37℃下生長過夜。小量制劑DNA利用Wizard 373 DNA純化試劑盒(Promega，Madison，WI)從這些克隆的每個制備。編碼羧肽酶的質粒通過DNA測序確證。實施例8米曲霉ATCC 20386羧肽酶I基因的DNA序列分析實施例2中描述的羧肽酶I克隆(大腸桿菌DH5a EJG12)的DNA測序以應用生物系統373A型自動化DNA測序儀(應用生物系統公司，Foster City，CA)，利用引物步行技術，以染料終止化學(Giesecke等，1992，病毒學方法雜志3847-60)在雙鏈上進行。寡核苷酸測序引物設計為羧肽酶I基因的互補序列，并按照制造廠商的指導，在應用生物系統394型DNA/RNA合成儀上合成。
編碼米曲霉ATCC 20386羧肽酶I cDNA的基因的核苷酸序列在圖3(SEQ ID NO1)顯示。克隆的插入序列分析顯示了編碼555個氨基酸的蛋白質的1665個核苷酸的大的開放讀框(終止密碼子除外)。這種開放讀框的G+C含量是52.1％。基于van Heijne規則(van Heijne，1984，分子生物學雜志173243-251)，頭18個氨基酸可能包含分泌信號肽，此肽指導新生多肽進入內質網組織(在圖3中畫雙線)。
如圖3(SEQ ID NO2)顯示的推斷的米曲酶ATCC 20386羧肽酶I的氨基酸序列表明計算的初級翻譯產物的分子量是61.2kDa，這與基于SDS-PAGE上純化的蛋白質遷移率的估計值68kDa一致。如實施例2描述的，由純化的羧肽酶I獲得的肽的氨基酸序列在圖3中是劃線的，且與推斷的米曲酶ATCC 20386羧肽酶I cDNA的氨基酸序列中發現的一致。
利用Clustal序列對比程序(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)比較推斷的米曲酶ATCC 20386羧肽酶I的氨基酸序列與文獻中所報導的其它真菌羧肽酶的氨基酸序列，如圖4顯示，與微紫青霉羧肽酶S1相比，觀察到38.8％的等同性(Svendsen等，1993，同上)(SEQ ID NO9)，相對于微紫青霉羧肽酶S3，有13.3％的等同性(Svendsen和Day，1995，FEBS通訊3711-3)(SEQID NO10)，相對于Aspergillus phoenicis羧肽酶有16.4％等同性(Chiba等，1995，生物化學雜志308405-409)(SEQ ID NO11)，相對于黑曲霉羧肽酶有14.7％的等同性(van den Hombergh等，1994，基因15173-79)(SEQ IDNO12)。推斷的米曲霉羧肽酶I的氨基酸序列具有包含絲氨酸羧肽酶中保守的Asp-His-Ser(圖4的星標記)的催化三聯體。實施例9利用其它真菌的基因組DNA的交叉雜交研究克隆的米曲霉ATCC 20386羧肽酶基因在與各種真菌屬的基因組DNA樣品的Southern雜交實驗中用作探針。在低嚴格性(45℃下，25％甲酰胺，5×SSPE，0.3％SDS)、中等嚴格性(45℃下，35％甲酰胺，5×SSPE，0.3％SDS)和高嚴格性(45℃下，50％甲酰胺，5×SSPE，0.3％SDS)的條件下探測Southern印跡。基因組DNA樣品利用以下概述的方案從下列物種中分離黑曲霉(Bo-95)、米曲霉(A1560)、產紫青霉(A3191)、紅色青霉(CBS433.62)、灰腐質霉變種(Humicola grisea var.)themoidea(ATCC 16453)、灰葡萄孢(ATCC 11542)、Curvularia verruculosa(CBS 147.63)、立枯絲核菌(IMI 358730)、Trichoderma harzianum(CBS 819.68)、Absidiagriseola(ATCC 22618)、疣孢漆斑菌(ATCC 9095)、Myceliophthorathermophila(CBS 117.65)和變異青霉(CBS 386.48)。
把上述的每種菌株在32℃和250rpm下，在25ml的0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培養基中生長24小時。然后，通過過Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)的過濾，收集菌絲體，并以25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)緩沖液洗滌一次。由菌絲體排出過量緩沖液，其后這些菌絲體在液氮中冷凍。冷凍的菌絲體在電咖啡研磨機中磨成細粉，并把粉加至一次性塑料離心管中20ml的TE緩沖液和5ml的20％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)中。把混合物輕輕地倒轉幾次以確保混合，并以等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)提取兩次。加入乙酸鈉(3M溶液)至0.3M的終濃度，其后加入2.5體積的冰冷乙醇以沉淀核酸。然后，通過以15,000×g離心試管30分鐘，使核酸沉淀為粒狀。使顆粒重新懸浮于0.5m TE緩沖液中前，在空氣中干燥30分鐘。加入無DNA酶的核糖核酸酶A至100mg/ml的濃度，并把混合物在37℃下溫育30分鐘。然后，把蛋白酶K以200mg/ml的濃度加入，并把混合物在37℃下，再溫育1小時。最后，如前所述，在用乙酸鈉和乙醇沉淀DNA前，把混合物以苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)提取兩次。把DNA顆粒在真空下干燥，重新懸浮于TE緩沖液，在4℃下保存直到再次利用。
把每一種DNA樣品(約5μg)在1％瓊脂糖凝膠上電泳前，以BamHI和EcoRI消化。把DNA印跡到Zeta-Probe尼龍膜(BioRad實驗室，Hercules，CA)上，并以包含羧肽酶I基因的、翻譯切口的DNA探針探測。把印跡在45℃下，在2×SSC+0.2％SDS中洗滌30分鐘，并在2×SSC中(沒有SDS)洗滌30分鐘。把洗滌的濾器在-70℃下，曝露在具有增感屏的X-射線膠卷下過夜。
把來自米曲霉ATCC 20286的羧肽酶基因與幾個其它真菌物種的可探測的羧肽酶基因序列互交(表2)。在低嚴格條件下，強雜交信號在來自米曲霉A1560、黑曲霉和灰葡萄孢的DNA中是明顯的。在Curvularia verruculosa、灰腐質霉變種(Humicola grisea var.)themoidea、疣孢漆斑菌和Trichodermaharzianum中檢測到較弱的信號。在Absidia griseola、Myceliophthorathermophila、產紫青霉、紅色青霉、變異青霉或立枯絲核菌中未檢測到任何雜交。利用中等嚴格條件，僅與米曲霉A1560和灰葡萄孢雜交的強信號是可見的。觀察到與來自黑曲霉、Curvularia verruculosa、灰腐質霉變種(Humicola grisea var.)thermoidea及疣孢漆斑菌的DNA的弱雜交。在高嚴格條件下，僅米曲霉A1560的DNA與羧肽酶基因探針雜交。這些數據表明米曲霉ATCC 20286羧肽酶基因可用作探針克隆其它絲狀真菌的羧肽酶基因。
表2.來自各種真菌的基因組DNA樣品與克隆的米曲霉ATCC 20286羧肽酶基因雜交探測。A+++表示強陽性雜交信號，+表示弱信號，-表示沒有可檢測到的雜交.
實施例10由具有羧肽酶活性的多肽的蛋白質水解商品級的大豆粗粉、小麥麩質、酪蛋白及明膠用作蛋白質底物。大豆粗粉從脫脂的烘烤的去殼大豆20/80/20(Cargill BV，NL)制備；活體小麥麩質得自Crespel和Dieters，丹麥；酪蛋白作為酪蛋白酸鈉Miprodan(MD食品，丹麥)獲得；明膠作為骨明膠獲得(DGF商店，丹麥)。
底物作為2％(w/v)水溶液制備，其中蛋白質濃度用Kjeldahl方法測定。以干燥組合物形式獲得的各200mg的每種底物，溶解在9ml自來水中，并把pH調整為7.0。加入包含FLAVOURZYMETM(3LAPU)，羧肽酶(11.5CPDU)，或這兩種酶的組合的1ml酶溶液。把反應混合物在50℃下溫育18小時。然后把酶通過加熱到85℃達3分鐘滅活。
把水解產物冷卻，并利用OPA(鄰苯二醛，Sigma化學公司，St.Louis，MO)作為檢測試劑，在微滴定板上測定水解度(DH)。如Adler-Nissen(1986，食品蛋白質的酶促水解，Elsevier應用科學出版社)所述定義的DH通過上清液與OPA(鄰苯二醛，Sigma化學公司，St.Louis，MO)的反應測定。對于OPA試劑，把160mg OPA溶解在4ml乙醇中，并轉移到包含7.62g四硼酸二鈉十水合物、200mg十二烷基硫酸鈉和176mg二硫蘇糖醇溶液的200ml容量瓶中，把燒瓶用水充滿到200ml。
把25μl體積適當稀釋的上清液與200μl的OPA試劑在微滴定板孔中混合，并使得在25℃下恰好反應2分鐘。在微滴定板讀數儀上測定340nm處的吸光度，并與減少空白值(水與OPA試劑反應)后，95mM的L-絲氨酸標準溶液的吸光度對比。為測定真實的DH，在上清液中測定的絲氨酸當量以由Adler-Nissen建議的用于三硝基苯磺酸法(Adler-Nissen，1979，農業和食品化學171256)(此法與所述的OPA方法給出相同的反應)的因子校正。水解度基于水解混合物中蛋白質總量(不是基于可溶性蛋白質)計算。
以下表3總結的結果表明對于所有底物，羧肽酶單獨沒有影響，但當加入FLAVOURZYMETM時，提高了由FLAVOURZYMETM獲得的DH。
表3底物 酪蛋白 明膠大豆粗粉小麥麩質酶DH DHDH DHFLAVOURZYME 44.8 20.2 36 41羧肽酶0 0 0 0Flavourzyme+ 50.2 22.9 40 45.6羧肽酶實施例11增加的蛋白質溶解性和通過脫酰胺作用的谷氨酸的釋放小麥麩質(WG)得自Cargill(JOB 5141)，脫去酰氨基的小麥麩質(DWG)得自StaPro Consultancy B.V.，Lemdijk 32，9422 TH Smilde，NL。8％的蛋白質懸浮液通過把11g麩質與89g水混合制備。把pH以NaOH調整至6.5。把如在WO 91/13554中描述的可獲得的谷氨酸/天冬氨酸特異性蛋白酶(SP446)或如在WO 89/06270中描述的可獲得的賴氨酸/精氨酸特異性蛋白酶(SP387)加至懸浮液中。劑量是對于SP446為0.01AU/g蛋白質，對于SP387為0.006AU/g蛋白質。把FLAVOURZYMETM以20LAPU/g蛋白質的劑量加至一些水解產物中。一個LAPU(亮氨酸氨肽酶單位)是在下列條件下，每分鐘分解1微摩爾L-亮氨酸-對硝基酰基苯胺的酶量，此條件為40℃下，26mM的L-亮氨酸-對硝基酰基苯胺在pH 8.0的0.1M Tris緩沖液中反應10分鐘。當水解時，釋放對硝基酰基苯胺，使溶液變為在405nm下監測的黃色。
無須再調整pH，使水解在50℃下進行18小時。通過在85℃下加熱15分鐘使酶失活。把pH調整到5，并離心水解產物。測定上清液中蛋白質和游離谷氨酸的含量。
通過Kjeldahl分析，利用6.25的Kjeldahl因子，測定蛋白質的含量。
按照制造廠商的指導(Boehringer-Mannheim，Indianapolis IN)，通過利用谷氨酸測定試劑盒，測定游離谷氨酸的含量。此方法適用于微量滴定板中。
比較小麥麩質(WG)和脫去酰氨基的小麥麩質(DWG)，表4顯示的結果表明脫酰胺作用增加了麩質對特異性蛋白酶的敏感性，因此，更多蛋白質變得可溶。通過加入具有特異性蛋白酶的FLAVOURZYMETM，由于脫酰胺作用，谷氨酸的釋放增加了一倍。
表4
實施例12酶促脫酰胺作用和谷氨酸的釋放肽谷氨酰胺酶II通過在30℃下在搖瓶(400ml)中以270rpm使環狀芽孢桿菌菌株ATCC 21590混合生長20小時，此瓶包含200ml由l％多胨、0.5％乳糖、0.025％MgSO4·7H2O、0.005％FeSO4.7H2O、0.025％KH2PO4及17％Na2HPO4.12H2O組成的培養基(pH調整到7.2)。把細胞通過以4000rpm離心收集在1升燒瓶中。然后冷凍細胞。
來自環狀芽孢桿菌的肽谷氨酰胺酶II的純化在室溫下進行。使冷凍的環狀芽孢桿菌細胞解凍，并懸浮在裂解緩沖液(50mM Tris/HCl；25％蔗糖(w/v)；1mM EDTA，pH8.0)中，直到獲得每升裂解緩沖液100g濕細胞的均相懸浮液。把溶菌酶(10mg/ml)和DNA酶I(Sigma DN-25，10mg/ml)溶解在裂解緩沖液中。然后，以每升100ml溶菌酶溶液、10ml 1.0M的MgCl2及1mlDNA酶I溶液加至細胞懸浮液中。使得酶反應1小時。
懸浮液通過Seitz深度過濾平板過濾，并把濾液轉移到葡聚糖凝膠G25柱(Pharmacia)上pH8.0的10mM KH2PO4/NaOH緩沖液A中。把酶溶液應用于以緩沖液A平衡的SOURCE Q柱(Pharmacia)，并以緩沖液A中線性NaCl梯度(0→500mM)洗脫。如下述，分析柱上組分的肽谷氨酰胺酶II的活性，并集中有活性的組分。集中的組分在280nm的吸光度是1.78，因此，蛋白質含量估計為1.8mg/ml。
肽谷氨酰胺酶II庫中蛋白質的純度如由SDS-PAGE凝膠判斷的大約是25％。因此，制劑包含大約0.5mg/ml純化的肽谷氨酰胺酶II。
肽谷氨酰胺酶的活性通過利用Boehringer-Mannheim氨測定試劑盒(Cat.No.1112732)測定N-叔丁氧羰基-Gln-Pro(N-t-BOC-Gln-Pro；SIGMA No.B-4403)的γ-甲酰胺的水解期間形成的氨測定。在這種試劑盒中，通過測定由谷氨酸脫氫酶消耗的NADH測定氨，也應用未加入N-t-BOC-Gln-Pro的空白以減去其它NADH消耗酶的影響。
把共200mg的小麥麩質蛋白質加至9ml沸水中，冷卻后，把pH調整到7.0。然后，如上述的，把250μl的肽谷氨酰胺酶II制劑(PEP)加入。把實施例11中所述的谷氨酸/天冬氨酸特異性蛋白酶(SP446)以0.04AU/g蛋白質的量加入，實施例11中描述的FLAVOURZYMETM以20LAPU/g蛋白質的量加入。
使水解在50℃下，無須調整pH，進行18小時。未加入肽谷氨酰胺酶的對照也進行。離心水解產物，并如實施例11中描述的，測定谷氨酸。
如實施例10中描述的，測定小麥麩質蛋白質的DH。
如以下表5中顯示的結果表明以肽谷氨酰胺酶制劑的水解增加了DH以及谷氨酸的釋放。
表5
實施例13大豆水解產物的香味改良大豆水解產物利用8％的大豆粗粉蛋白質濃度(1升或0.2升)在50℃下進行18小時制備，其中，沒有以ALCALASETM2.4L(Novo Nordisk Bagsverd，丹麥)調整pH，如實施例1中所述的，制備純化的羧肽酶溶液(大約40CPDU/ml)。劑量是每升1200mg ALCALASETM或每升1200mgALCALASETM及5ml羧肽酶。
然后，使酶在93℃下滅活15分鐘，如實施例10和11中所述的，分別分析DH和谷氨酸。在125℃下成熟30分鐘前，把pH調整到5。成熟后，把所有的水解產物離心。
所產生的大豆粗粉水解產物通過一連串香味實驗對象評價。把上清液稀釋5.3倍，并以隨機順序給十一位評委獻兩次。評委在0-9的等級上估價下列香味的屬性苦味、味美、肉湯、肉、小雞、煙及MSG。
DH結果和不同的香味屬性的平均得分在表6中顯示。
表6
苦味結果顯示把羧肽酶加至ALCALASETM明顯地降低苦味。關于全部的味美性，通過加羧肽酶至ALCALASETM，看到有改善。
肉湯、小雞及可能的MSG香味也通過把羧肽酶加至ALCALASETM得以改善。肉、煙及蔬菜香味也通過加入羧肽酶改善。
生物材料的保藏下列生物材料已根據布達佩斯條約保藏在農業研究服務機構專利培養物保藏中心，北方地區研究中心，學院街1815，Peoria，伊利諾州，61604，且給出下列保藏號保藏物保藏號 保藏日期大腸桿菌DH5a pEJG12NRRL B-21616 1996年8月28日序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk Biotech公司(B)街道1445 Drew Avenue(C)城市Davis，california(D)國家美利堅合眾國(E)郵政編碼(ZIP)95616-4880(F)電話(916)757-8100(G)傳真(916)758-0317(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsverd(D)國家丹麥(E)郵政編碼(ZIP)DK-2880(F)電話+45 4444 8888(G)傳真+45 4449 3256(ii)發明名稱羧肽酶和編碼該酶的核酸(iii)序列數12(iv)通信地址(A)收信人北美Novo Nordisk公司(B)街道Lexington路405(C)城市紐約(D)州NY(E)國家美國(F)郵政編碼10174(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤
(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統DOS(D)軟件Windows FastSEQ 2.0版(vi)當前申請的數據(A)申請號待指定(B)申請日1997年10月3日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Lambiris，Elias J(B)登記號33,728(C)參考/證書號4990.204-WO(ix)電訊信息(A)電話212-867-0123(B)傳真212-878-9655(C)電傳(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1662個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型基因組DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞編碼序列(B)位置1...1662(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG CGT GGC TAC GAA TTT CTC TCA GTG CTA CCC TTG GTT GCA GCC AGT 484Met Arg Gly Tyr Glu Phe Leu Ser Val Leu Pro Leu Val Ala Ala Ser1 5 10 15TGG GCC CTT CCA GGA AGT ACA CCG GCG TCC GTC GGT AGA AGA CAG CTA 96Trp Ala Leu Pro Gly Ser Thr Pro Ala Ser Val Gly Arg Arg Gln Leu20 25 30CCC AAG AAC CCC ACC GGG GTC AAG ACT CTT ACA ACC GCA AAC AAT GTC 144Pro Lys Asn Pro Thr Gly Val Lys Thr Leu Thr Thr Ala Asn Asn Val35 40 45ACC ATC CGG TAC AAG GAA CCC GGG GCA GAG GGC GTC TGC GAG ACT ACC 192Thr Ile Arg Tyr Lys Glu Pro Gly Ala Glu Gly Val Cys Glu Thr Thr50 55 60CCG GGT GTC AAA TCC TAC TCT GGA TAT GTC GAC ACC TCT CCC GAG TCC 240Pro Gly Val Lys Ser Tyr Ser Gly Tyr Val Asp Thr 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350Asn Arg Ser Asp Val Gln Lys Ile Leu His Val Pro Pro Thr Asp Tyr355 360 365Ser Val Cys Ser Glu Thr Val Ile Phe Ala Asn Gly Asp Gly Ser Asp370 375 380Pro Ser Ser Trp Gly Pro Leu Pro Ser Val Ile Glu Arg Thr Asn Asn385 390 395 400Thr Ile Ile Gly His Gly Trp Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Leu Asn Gly405 410 415Ser Leu Ala Thr Ile Gln Asn Met Thr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Phe420 425 430Gln Ser Pro Pro Val Glu Pro Leu Phe Val Pro Tyr His Tyr Gly Leu435 440 445Ala Glu Leu Tyr Trp Gly Asp Glu Pro Asp Pro Tyr Asn Leu Asp Ala450 455 460Gly Ala Gly Tyr Leu Gly Thr Ala His Thr Glu Arg Gly Leu Thr Phe465 470 475 480Ser Ser Val Tyr Leu Ser Gly His Glu Ile Pro Gln Tyr Val Pro Gly485 490 495Ala Leu Thr Ala Ser Trp Ser Ser Cys Leu Val Glu Leu Ile Val Phe500 505 510Pro Arg Arg Gly Thr Thr Pro Leu Asn Phe Ser515 520(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度530個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Leu Phe Arg Ser Leu Leu Ser Thr Ala Val Leu Ala Val Ser Leu1 5 10 15Cys Thr Asp Asn Ala Ser Ala Ala Lys His Gly Arg Phe Gly Gln Lys20 25 30Ala Arg Asp Ala Met Asn Ile Ala Asn Gly Ser Ala Asn Ala Val Lys35 40 45His Ser Leu Lys Ile Pro Val Glu Asp Tyr Gln Phe Leu Asn Asn Lys50 55 60Thr Lys Pro Tyr Arg Val Glu Ser Leu Pro Asp Val His Phe Asp Leu65 70 75 80Gly Glu Met Tyr Ser Gly Leu Val Pro Ile Glu Lys Gly Asn Val Ser85 90 95Arg Ser Leu Phe Phe Val Phe Gln Pro Thr Ile Gly Glu Pro Val Asp100 105 110Glu Thr Thr Ile Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Glu115 120 125Ala Leu Ser Pro Gly Glu Cys Arg Phe Val Trp Gln Pro Gly Thr Tyr130 135 140Gln Pro Val Glu Asn Pro Tyr Ser Trp Val Asn Leu Thr Asn Val Leu145 150 155 160Trp Val Asp Gln Pro Val Gly Thr Gly Phe Ser Leu Gly Val Pro Thr165 170 175Ala Thr Ser Glu Glu Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Phe Phe Lys180 185 190Asn Trp Gln Gln Ile Phe Gly Ile Lys Asn Phe Lys Ile Tyr Val Thr195 200 205Gly Glu Ser Tyr Ala Gly Arg Tyr Val Pro Tyr Ile Ser Ala Ala Phe210 215 220Leu Asp Gln Asn Asp Thr Glu His Phe Asn Leu Lys Gly Ala Leu Ala225 230 235 240Tyr Asp Pro Cys Ile Gly Gln Phe Asp Tyr Val Gln Glu Glu Ala Pro245 250 255Val Val Pro Phe Val Gln Lys Asn Asn Ala Leu Phe Asn Phe Asn Ala260 265 270Ser Phe Leu Ala Glu Leu Glu Ser Ile His Glu Gln Cys Gly Tyr Lys275 280 285Asp Phe Ile Asp Gln Tyr Leu Val Phe Pro Ala Ser Gly Val Gln Pro290 295 300Pro Lys Ala Met Asn Trp Ser Asp Pro Thr Cys Asp Val Tyr Asp Ile305 310 315 320Val Asn Asn Ala Val Leu Asp Pro Asn Pro Cys Phe Asn Pro Tyr Glu325 330 335Ile Asn Glu Met Cys Pro Ile Leu Trp Asp Val Leu Gly Phe Pro Thr340 345 350Glu Val Asp Tyr Leu Pro Ala Ala Pro Ala Ser Thr Leu Thr Ala Leu355 360 365Ile Lys Arg Ala Met His Ala Pro Asn Ile Thr Trp Ser Glu Cys Ser370 375 380Val Glu Ser Val Phe Val Gly Gly Asp Gly Gly Pro Glu Gln Glu Gly385 390 395 400Asp Tyr Ser Ala Asn Pro Ile Glu His Val Leu Pro Gln Val Ile Glu405 410 415Gly Thr Asn Arg Val Leu Ile Gly Asn Gly Asp Tyr Asp Met Val Ile420 425 430Leu Thr Asn Gly Thr Leu Leu Ser Ile Gln Asn Met Thr Trp Asn Gly435 440 445Lys Leu Gly Phe Asp Thr Ala Pro Ser Thr Pro Ile Asn Ile Asp Ile450 455 460Pro Asp Leu Met Tyr Asn Glu Val Phe Ile Glu Asn Gly Tyr Asp Pro465 470 475 480Gln Gly Gly Gln Gly Val Met Gly Ile Gln His Tyr Glu Arg Gly Leu485 490 495Met Trp Ala Glu Thr Phe Gln Ser Gly His Met Gln Pro Gln Phe Gln500 505 510Pro Arg Val Ser Tyr Arg His Leu Glu Trp Leu Leu Gly Arg Arg Asp515 520 525Thr Leu530
權利要求
1.一種具有羧肽酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組(a)包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％等同性的氨基酸序列的多肽；(b)由核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在中等嚴格條件下，與(i)SEQID NO1的核酸序列，(ii)它的互補鏈，(iii)其子序列雜交；(c)一種多肽，其(i)在25℃下，約pH3.0-約pH7.5的范圍有最大活性；(ii)在pH 4，約55℃-約60℃的范圍有最大活性；(iii)在pH4.0和60℃30分鐘后，有至少約65.5％的剩余活性；(iv)具有水解N-CBZ-Ala-X的X的能力，其中N-CBZ是N-芐酯基，X是任何氨基酸；(d)(a)或(b)的等位基因變體；(e)(a)、(b)或(d)的保持羧肽酶活性的片段。
2.權利要求1的多肽，該多肽由在中等嚴格條件下，與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，(ii)它的互補鏈，(iii)其子序列雜交的核酸序列編碼。
3.權利要求2的多肽，該多肽由在高嚴格條件下，與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，(ii)它的互補鏈，(iii)其子序列雜交的核酸序列編碼。
4.權利要求3的多肽，其得自曲霉屬或其異名的同類或有性型菌株。
5.權利要求4的多肽，其得自米曲霉或其異名的同類或有性型菌株。
6.權利要求1的多肽，其(i)在25℃下，約pH3.0-約pH7.5的范圍有最大活性；(ii)在pH 4，約55℃-約60℃的范圍有最大活性；(iii)在pH4.0和60℃30分鐘后，有至少約65.5％的剩余活性；(iv)具有水解N-CBZ-Ala-X的X能力，其中N-CBZ是N-芐酯基，X是任何氨基酸。
7.權利要求6的多肽，其水解N-CBZ-Ala-X，其中，X選自由Ile、Glu、Lys、Arg、Asp、Asn、Phe及Tyr組成的組。
8.權利要求6的多肽，其得自曲霉屬或其異名的同類或有性型菌株。
9.權利要求8的多肽，其得自米曲霉或異名的同類或其有性型菌株。
10.權利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或等位基因變體或其保持羧肽酶活性的片段。
11.權利要求10的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
12.權利要求11的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成。
13.一種具有羧肽酶活性的多肽，該多肽由大腸桿菌NRRL B-21616中包含的質粒pEJG12中包含的核酸序列編碼。
14.一種編碼權利要求1多肽的分離的核酸序列。
15.一種核酸構建體，其包含可操作連接到一種或多種調控序列上的權利要求14的核酸序列，這些調控序列在適合的表達宿主中指導多肽的表達。
16.一種重組表達載體，其包含權利要求15的核酸構建體、啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。
17.一種包含權利要求15的核酸構建體的重組宿主細胞。
18.一種用于產生權利要求1的多肽的方法，該方法包括(a)培養其野生型產生多肽的菌株，以產生包含多肽的上清液；(b)回收多肽。
19.一種用于產生權利要求1的多肽的方法，該方法包括(a)培養宿主細胞，此宿主細胞包含在利于產生多肽的條件下由編碼多肽的核酸序列組成的核酸構建體；(b)回收多肽。
20.一種用于產生細胞突變體的方法，該方法包括破壞或缺失編碼權利要求1的多肽的核酸序列或其調控序列，其導致突變體產生的多肽比所說細胞產生的少。
21.由權利要求20的方法產生的突變體。
22.一種用于產生異源多肽的方法，該方法包括(a)在利于產生多肽的條件下，培養權利要求21的突變體；(b)回收多肽。
23.一種從蛋白質底物產生蛋白水解產物的方法，該方法包括使底物受權利要求1的多肽和內肽酶作用。
24.由權利要求23的方法產生的蛋白水解產物。
25.包含權利要求24的蛋白水解產物的食品。
26.一種從蛋白質底物獲得富含游離谷氨酸和/或結合肽的谷氨酸殘基的蛋白水解產物的方法，該方法包括使底物經歷脫酰胺過程，及使底物受到權利要求1的多肽作用。
27.權利要求26的方法，該方法還包括使底物經歷一種或多種非特異性作用的內和/或外肽酶作用。
28.用權利要求27的方法獲得的蛋白水解產物。
29.包含權利要求28的蛋白水解產物的食品。
全文摘要
本發明涉及具有羧肽酶活性的多肽和編碼多肽的分離的核酸序列。本發明也涉及包含所說的核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞以及產生所說的多肽的方法。本發明還涉及獲得作為香味改良劑有用的蛋白質水解產物的方法。
文檔編號C12N15/57GK1207130SQ97191622
公開日1999年2月3日 申請日期1997年10月3日 優先權日1996年10月4日
發明者A·布林科夫斯基, R·伯卡, M·雷, E·格萊特利, A·克羅茨, T·E·馬希森, C·達姆伯曼, K·布朗 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司, 諾沃挪第克公司