專利名稱：一種淡紫擬青霉孢子粉的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌孢子粉的制備方法,尤其涉及淡紫擬青霉(Paecilomyces. Iilacinus)孢子粉的制備方法，屬于淡紫擬青霉孢子粉的生產領域。
背景技術：
淡紫擬青霉(P. Iilacinus)屬于內寄生性真菌，是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能夠寄生于卵，也能侵染幼蟲和雌蟲，可明顯減輕多種作物根結線蟲、胞囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危害。
植物寄生線蟲為除真菌之外的第二大類作物病原物，其分布廣泛，可寄生并危害多種農作物。根結線蟲是一類植物專性寄生病原物，目前生產上使用的殺線劑大都為高毒化學農藥，毒性高，既影響人類身體健康，又對環境造成潛在威脅。與傳統的用化學藥劑殺滅病蟲害相比，生物防治無環境污染，無藥物殘留，對人畜安全， 有利于保護物種的多樣性和生態環境的可持續發展(T homason I. J. Challenges facing nematology:Environmental risks with nematicides and the need for new approaches. VeechjJ.A.and Dickson，D.W.Vistas on Nematology. Hyattsville:Societyof Nematologists. 1987. 469-476.)。
淡紫擬青霉生物農藥菌劑是新型純微生物活孢子制劑，其主要由淡紫擬青霉活孢子與一定的農藥輔料或載體制備而成，具有高效、廣譜、長效、安全、無污染、無殘留等特點， 可明顯刺激植物生長。試驗證明，在植物根系周圍施用淡紫擬青霉生物農藥菌劑不僅能明顯抑制線蟲侵染，而且能促進植物根系及植株營養器官的生長。
淡紫擬青霉生物農藥菌劑的質量主要以產生孢子數量為主要的考核指標，現有的淡紫擬青霉孢子粉的制備方法均不同程度的存在著回收率低、活孢子數量較低等缺陷，有待改進。發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新的淡紫擬青霉孢子粉的制備方法，該方法具有淡紫擬青霉孢子粉回收率高、孢子質量好等優點，適宜于進行規模化工業生產。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的
—種淡紫擬青霉(P. Iilacinus)孢子粉的制備方法,包括(I)制備淡紫擬青霉液體發酵液；(2)從淡紫擬青霉液體發酵液中回收分生孢子產物；(3)干燥所回收的淡紫擬青霉分生孢子產物，即得。
淡紫擬青霉液體發酵液的制備方法已在各種文獻中公開(例如周靖等.淡紫擬青霉(P. Iilacinus)培養條件的優化.微生物學雜志.2007年3月第27卷第2期.45-48 ； 毛成利等，淡紫擬青霉的研究開發.化學工程師.2004年7月.63-64.)，本領域所屬技術人員可按照文獻中所公開的各種方法制備得到淡紫擬青霉液體發酵液；例如，采用三級培養方法，即種子培養、二級液體擴大培養和液體發酵培養，制備得到淡紫擬青霉菌發酵液; 其中，在液體發酵培養時，可以采用發酵罐發酵或采用搖瓶培養的方式進行發酵培養。三級培養所用到的培養基及其培養條件均已在文獻中公開，作為參考，其中，所述的液體發酵培養基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種。所述的氮源包括但不限于硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種。
淡紫擬青霉在24°C -30°c范圍內均能生長產孢，所以在制備淡紫擬青霉液體發酵液的各個培養過程中，各個階段的培養溫度可以是24°C -30°C。
在發酵培養過程搖床轉速可以為80-250r/min，當搖床轉速為220r/min時，產孢量會達到最高。液體發酵培養基的初始pH值為3-9時均能產孢；當初始pH值為5. 0-5. 5 時，淡紫擬青霉的孢子產量相對較高；當液體發酵培養基的初始P H值是5. O時，淡紫擬青霉的產孢量達到最高。發酵罐的罐壓可以為O. 6-0. SMpa ;在用發酵罐或搖瓶進行發酵培養時，其通氧量可以是50-300L/h。
本發明所用到的淡紫擬青霉菌種可通過商業途徑購買得到。
淡紫擬青霉液體深層發酵產生的分生孢子最終加工成產品必須得到高孢粉，所以必須從液體發酵產物中回收孢子并將其進行干燥，最終得到活孢子粉。至于如何從液體發酵產物中回收孢子，可以采用諸如離心或過濾等方法從淡紫擬青霉液體發酵產物中回收孢子。在采用離心的方法從液體發酵產物中回收孢子時，離心力、離心時間以及所加入的絮凝劑的種類及用量等對于孢子的回收率及其質量高低(例如純度、存活率)等有非常顯著的影響。為了最大限度的提高孢子的回收率及其質量，本發明對離心力、離心時間以及絮凝劑的種類和用量等工藝參數進行了大量的試驗以摸索出最適宜的參數；通過大量的篩選試驗最終發現，采用下述離心條件能夠最大限度的提高孢子的回收率及其質量
相對離心力優選為2000-6000g,最優選為4000g ;離心時間優選為30-50min,最優選為30min。
此外，本發明通過實驗發現，發酵液中加入絮凝劑后可顯著提高發酵液中孢子的回收率，最高者可以達到98.8%。本發明通過進一步的實驗發現，選用KAI (SO4)2作為孢子回收中的絮凝劑，既能保證回收效果，又能有效降低成本生產。
本發明通過正交實驗和方差分析發現，離心力、離心時間以及絮凝劑三個因素對孢子回收的影響如下離心時間 > 離心力 > 絮凝劑。通過篩選試驗，本發明最終發現將離心力、離心時間以及絮凝劑三個因素按照以下參數組合在一起能夠非常顯著的提高孢子的回收率及其質量每IOOmL發酵液加入2. 5g絮凝劑，相對離心力為4000g，離心時間為30min。
本發明中所述的"干燥”方式可以是真空冷凍干燥、陰干或加熱烘干等方式；其中，采用陰干或加熱烘干的方式干燥孢子時，將待干燥的孢子液(所述的孢子液可以是直接發酵液，也可以是將發酵液濃縮后所得到的濃縮菌漿等)優選用吸附載體進行吸附，再將吸附有孢子液的吸附載體進行自然干燥(即陰干)或進行加熱烘干。
本發明考察了不同的吸附載體對于分生孢子吸附效果的影響。考察實驗結果表明，木屑的吸附量(4g/ml)最大,娃藻土的吸附量(2ml/g)大于高嶺土(〈lmg/ml)。考慮到后期需要將制備的孢子粉加工成可濕性粉劑或顆粒劑，本發明優選采用硅藻土作為載體來對孢子進行干燥。
采用“加熱烘干”這一干燥方式干燥吸附有孢子粉的吸附載體，雖然所得到的載體 (含孢子)含水量較低(明顯低于陰干干燥方式)，但是采用烘箱烘干方式對活孢子的損壞量較大，且能耗大、成本高，而采用陰干的干燥方式雖然活孢量有所增加，但需要較長的時間進行干燥，導致生產周期過長。本發明通過實驗發現，控制干燥時間使得干燥后的載體和孢子含水量處于10%的左右時，活孢量較高，可以達到IO9個/g。本發明通過篩選實驗最終確定，采用陰干干燥孢子發酵液這一種方式，尤其是將所回收的淡紫擬青霉分生孢子回收離心后得到的濃縮菌漿用吸附載體吸附后再進行陰干干燥可以得到含孢量更高的孢子混合體。通過濃縮菌漿與載體的配合比例(體積質量)以及干燥時間等因素進行綜合考察，最終發現采用下述參數對孢子液進行陰干，孢子的存活率為最高濃縮菌漿和載體硅藻土的比例為I : I (體積質量)，干燥時間為48h。
在對孢子進行加熱烘干時，加熱溫度及加熱時間對于孢子的存活率有非常顯著的影響。本發明發現，如果采用較低的溫度進行干燥，雖然活孢含量較高，但是干燥時間會明顯過長且含水量不符合標準(一般規定要含水量要低于10% );若采用較高的溫度進行干燥，孢子的存活率將顯著降低，此外，采用較高的干燥溫度并不會使孢子粉含水量有效下降。如果干燥時間過短，最終孢子產品的含水量將會過高，而含水量過高的后果是直接造成孢子質量的顯著降低；如果干燥時間過長，孢子的存活率將嚴重下降并嚴重降低生產效率。 為了提高孢子的存活率并兼顧生產效能，本發明對加熱溫度及加熱時間進行了綜合考察， 最終發現，當烘干溫度為35°c、烘干時間為15小時，所制備的孢子產物的活孢量較高且含水量較低，在有效提高孢子粉質量的同時兼顧了生產效能。
本發明對淡紫擬青霉孢子粉的制備方法中的各工藝參數進行了優化和篩選，最終篩選到最適宜的工藝參數，有效提高了淡紫擬青霉孢子的收率和產品質量。本發明制備淡紫擬青霉孢子粉的方法具有孢子回收率高、含孢量高、活孢率高、孢子粉含水量低等優點， 符合規模化工業生產的要求。


圖I不同絮凝劑對發酵產物_孢子回收的影響(P〈0. 05)。
圖230°C干燥時載體加孢子含水量變化曲線。
圖335°C干燥時載體加孢子含水量變化曲線。
圖440°C干燥時載體加孢子含水量變化曲線。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
生物材料
淡紫擬青霉(P. Iilacinus)菌株購自中國林業微生物菌種保藏管理中心,菌種商業購買編號為cfcc 86080。
實施例I淡紫擬青霉(P. Iilacinus)發酵液的制備
I、將淡紫擬青霉菌種活化后，進行搖瓶種子培養；
搖瓶種子培養培養基的組成(按質量百分比計)
葡萄糖1.5-2%硝酸鈉0.4-0.6%硫酸銨0.2-03%黃豆粉0.2-0.3%廳酸氫—鉀O 1-0 2%硫酸犠0.1-0.2%水余量
液體發酵條件500ml三角瓶中裝入種子培養基200ml，高壓滅菌后接種淡紫擬青霉孢子懸浮液，接種量為I. 5-3%，置于24-28°C，搖床150_200r/min，培養18_36h。
2、二級液體擴大培養
二級液體擴大培養的培養基組成(按質量百分比計)
葡萄糠3-5%硝酸鈉0.4-0.6%硫酸銨0.2-0.3%麓豆粉0.2-0.3%_酸氬二卿 0.1-0.2%硫_鎂 0.1-0.2%
將上述二級液體擴大培養基發酵罐中在位滅菌；
液體發酵條件發酵溫度25_28°C，罐壓O. 6-0. 8bar，其通氧量可以是100-300L/ h，轉速 150-250rpm，起始 pH 值 5. 5-6. O。
3、液體發酵培養
液體發酵培養的培養基組成(按質量百分比計)
葡萄糖10-18%硝酸鈉0.2-03%硫酸銨0.1-0.15%黃豆粉0.1-0.15%磷酸氫二鉀0.1-0.2%硫酸犠0.1-0.2%土豆浸出液(20% ) 10-30%水余量
將上述液體培養基發酵罐中在位滅菌；
液體發酵條件發酵溫度為28-30°C，其通氧量是100_300L/h，前24h，通氣量控制在 100-150L/h,后期控制在 250-300L/h ;起始 pH 5. 0-6. O ;轉速150-200r/min ;罐壓 O. 6-0. 8Mpa，發酵周期控制在6d，一般鏡檢孢子濃度達到IO9個/ml以上即可。
試驗例2從淡紫擬青霉液體發酵液中回收孢子的工藝參數優化試驗
淡紫擬青霉液體深層發酵產生的分生孢子最終加工成產品必須得到高孢粉，所以發酵產物必須沉淀干燥。本試驗采用離心方法回收淡紫擬青霉液體發酵液代謝產物，本實驗考查了影響離心沉淀的主要因素，即絮凝劑、離心力和離心時間以摸索出最適宜的參數。
I不同的絮凝劑對孢子回收的影響
在離心之前分別在淡紫擬青霉液體深層發酵得到發酵液中加入Al2 (SO4)3, KAI (SO4) 2或FeCl3等絮凝劑，加入量為O. 5g/100mL發酵液，設定相對離心力為3000g，離心時間為30min。通過測定發酵液，離心沉淀和離心后上清液中的孢子含量來計算孢子回收率。
由圖I可以看出，發酵液中加入絮凝劑后，可以提高發酵液中孢子的回收率，高者可以達到98.8%。通過方差分析表明(表I)，絮凝劑對淡紫擬青霉孢子回收的影響是極顯著(P〈0. 01)。本發明通過綜合考慮回收效果及生產成本等多種因素，最終確定KAI (SO4)2作為離心時的絮凝劑最適宜，既能保證回收效果，又能有效降低成本生產。
表I絮凝劑ANOVA分析表
權利要求
1.一種淡紫擬青霉(Paecilomyces. Iilacinus)孢子粉的制備方法,包括(I)制備淡紫擬青霉液體發酵液；(2)從淡紫擬青霉液體發酵液中回收分生孢子產物；(3)干燥所回收的淡紫擬青霉分生孢子產物，即得。
2.按照權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中采用離心或過濾的方法從淡紫擬青霉液體發酵液中回收分生孢子產物。
3.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述離心在相對離心力為2000-6000g的條件下進行離心；優選的，所述離心在相對離心力為4000g的條件下進行離心。
4.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述離心時間為30-50min;優選的，所述離心時間為30min。
5.按照權利要求1-4任何一項所述的制備方法，其特征在于在離心時向發酵液中加入絮凝劑；優選的，所述的絮凝劑是KAl (S04)2。
6.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述絮凝劑的加入量是每100毫升發酵液中加入2. Og絮凝劑。
7.按照權利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的干燥方式是冷凍干燥、陰干或烘干。
8.按照權利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的陰干干燥是將回收分生孢子產物用吸附載體吸附后進行自然干燥；優選的，將所回收的分生孢子產物濃縮后得到發酵濃縮菌漿，將發酵濃縮菌漿用吸附載體吸附后進行自然干燥。
9.按照權利要求8所述的制備方法，其特征在于按體積質量比計，濃縮后的分生孢子產物與吸附載體的比例是I : I ;所述陰干干燥的時間為48h;所述的載體是硅藻土。
10.按照權利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的烘干干燥是將回收孢子產物用載體吸附后進行加熱干燥；優選的，所述的加熱干燥的溫度為35°C、干燥時間為15小時。
全文摘要
本發明公開了一種淡紫擬青霉孢子粉的制備方法，包括以下步驟(1)制備淡紫擬青霉(Paecilomyces.lilacinus)液體發酵液；(2)從淡紫擬青霉液體發酵液中回收分生孢子；(3)干燥所回收的淡紫擬青霉分生孢子，即得。本發明對制備淡紫擬青霉孢子粉的各工藝參數進行了篩選和優化，獲得最適宜的制備工藝參數，有效提高了淡紫擬青霉孢子的收率和產品質量。本發明淡紫擬青霉孢子粉的制備方法具有回收率高、含孢量高、活孢率高和含水量低等優點，符合規模化工業生產的要求。
文檔編號C12R1/79GK102925405SQ20121042598
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月30日 優先權日2012年5月29日
發明者汪來發, 王曦茁, 郭志斌, 林彩麗, 田國忠, 馬建偉 申請人:中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所