專利名稱：粒狀淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物殺線蟲劑的制備方法，特別是淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的制備方法，屬于淡紫擬青霉生物殺線蟲劑制備領域。
背景技術：
在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生線蟲的危害超過細菌和病毒，僅次于真菌病害。植物寄生線蟲每年造成世界農業生產的損失約1000億美元，其中根結線蟲(Meloidogyne spp.)是危害最大的一類植物寄生線蟲，每年僅對世界上重要的經濟作 物造成的經濟損失就高達數百億美元。在根結線蟲屬(Meloidogyne)內，以南方根結線蟲(M. incognita)、花生根結線蟲(M. arenaria)、爪睡根結線蟲(M. javanica)和北方根結線蟲(M. hapla)四個種的根結線蟲病害發生最為普遍，對大多數的糧食作物、油料作物、纖維作物、煙草、茶葉、果樹、蔬菜、藥材和花卉等均可造成嚴重損失。在控制該類病害的方法中，由于根結線蟲通常存活于土壤中和植物根內，所以一般化學農藥難以控制其危害，劇毒農藥又對農產品生產的安全性構成嚴重威脅，而化學殺線蟲劑只能在短期內控制線蟲數量，同時還存在成本高、持效短和抗藥性等問題。此外，一些傳統的防治方法，如輪作、種植抗病品種等雖可起到一定的防治作用，但在實際生產中能夠輪作的作物并不多，對根結線蟲具有抗性的作物品種十分有限。因此，傳統控制方法并不能解決該類病害。殺線蟲生物農藥由于其安全和高效而逐漸引起關注，具有非常廣闊的應用價值和市場前景。其中，淡紫擬青霉(P. Iilacinus)是目前防治植物寄生線蟲的最有前途的天敵真菌之一，具有廣泛的研究和開發價值。淡紫擬青霉屬真菌門半知菌綱叢梗孢目，可寄生許多植物病原線蟲的卵及雌蟲，包括危害最為嚴重的根結線蟲(Meloidogyne spp.)和胞囊線蟲(Heterodera spp.),國際馬鈴薯中心昆蟲系Jatala博士 1979年首次報道,淡紫擬青霉對南方根結線蟲的卵寄生率高達60%-70%。淡紫擬青霉菌株可在作物根際定殖，抵抗根際有害線蟲侵染，對作物根際土壤微生物菌群產生一定影響，利于植物生長發育。雖然淡紫擬青霉的培養方法已經有較多研究，如中國專利CN101845398A中公開了一種淡紫擬青霉的培養方法，中國專利CN102286421A中公開了一種淡紫擬青霉的液體發酵培養方法，中國專利CN101671210A中公開了一種淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，CN101165016A中公開了一種防治線蟲危害的生物有機肥制備方法，CN1756482A中公開了一種粒狀殺線蟲劑的制造方法。但這些方法限于少量生產制備，規模化生產則受到限制。

發明內容
本發明為克服現有技術的不足，通過對淡紫擬青霉生物殺線蟲劑制備方法中各種工藝條件的選擇，提供一種可大規模生產淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的方法，獲得的淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的袍子產量高、生產成本低。本發明通過如下技術方案實現
一種粒狀淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的制備方法，其包括如下步驟準備菌株、制備菌種、第一次發酵、第二次發酵和造粒，其特征在于，所述制備菌種中采用的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸餾水；所述第一次發酵中的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgS04、KCl、ZnS04 · 7H20和蒸餾水；所述第二次發酵中的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnS04 · 7H20 和蒸餾水。如上所述制備方法，所述制備菌種中采用搖瓶培養，其搖瓶裝量< 150ml/500ml瓶、搖床轉速為150rpm、培養溫度為29 30° C、時間為72h。如上所述制備方法，所述第一次發酵中的發酵罐的接種量為4%體積比，發酵罐的裝罐系數為O. 6-0. 7、溫度為27-29° C、攪拌速度為200-300rpm，發酵周期為45-54小時。如上所述制備方法，所述第二次發酵中的發酵罐的接種量為4%體積比，發酵罐的裝罐系數為O. 6-0. 7、溫度為27-29° C、攪拌速度為200-300rpm，發酵周期為42-50小時。
如上所述制備方法，所述制備菌種中的培養基的組成為蔗糖15g，酵母6. 12g，MgSO4 O. 5g，KCl O. 5g，ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸餾水 1000ml。所述培養基的 pH 優選為 6. 5。如上所述制備方法，所述第一次發酵中的培養基的組成為蔗糖15g，酵母6. 12g，MgSO4 O. 5g，KCl O. 5g，ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸餾水 1000ml。所述培養基的 pH 優選為 6. 5。如上所述制備方法，所述第二次發酵中的培養基就的組成為蔗糖15g，酵母
6.12g，MgSO4O. 5g，KCl O. 5g，ZnSO4 ·7Η20 IOmg 和蒸餾水 1000ml。所述培養基的 pH 優選為6. 5o本發明的有益效果本發明的方法每批次可獲得殺線蟲劑(微球制劑)250kg以上，每克微球制劑中有效成分含量> 107CFU/g制劑菌落數，微球制劑顆粒大小范圍為4±lmm，千粒微球重量范圍為10-15克，且生產成本低，可以大規模的生產粒狀淡紫擬青霉生物殺線蟲劑。
具體實施例方式根據本發明的制備方法，其中菌株為淡紫擬青霉菌株，是可以購買得到的，也可以通過以下方法培養得到采用馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)，通過本領域技術人員已知的方法獲得，所述培養中具體的參數選擇如下菌株生長的溫度范圍為8-38° C，最佳為25-30° C ;菌株生長的pH為2-11，優選pH值為5-9。所述培養基的制備方法為馬鈴薯去皮后切成塊，200g煮沸20min，紗布過濾后，向濾液中加葡萄糖20g，瓊脂粉15g，用蒸餾水定容至1000ml，分裝，高壓蒸汽滅菌20分鐘后備用。所述菌株可通過以下方法保存將上述獲得的菌株采用普通試管PDA培養基塊法，即切取生長在PDA培養基上生長良好的菌塊放置在I毫升無菌離心管中，低溫下(4° C)至少保存I年。根據本發明的制備方法，所述菌種的制備方法包括(I)菌種活化將低溫保存的菌種轉接至PDA培養基斜面上，28 30° C條件下培養3 4天，實現菌種的充分活化。活化培養后的菌種可接種搖瓶進行種子培養。(2)制備搖瓶菌種
采用液體培養基，其組成為蔗糖、酵母、MgS04、KCl、ZnS04 · 7H20和蒸餾水。所述培養基可以使用如下的配方蔗糖15g，酵母6. 12g，MgS04 O. 5g,KCl O. 5g，ZnSO4 ·7Η20 IOmg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。搖瓶培養的參數如下搖瓶裝量< 150ml/500ml瓶，搖床轉速為150rpm，培養溫度為29 30° C，時間為約72h。接種時采用培養基塊直接接種搖瓶即可，具體而言，接入直徑O. 5mm培養基塊4塊到一個搖瓶即可。所得的菌種在PDA培養基上顏色正常，鏡檢無其他雜菌孢子存在，無細菌菌膿等雜質，無酸性氣味存在。
根據本發明的制備方法，所述第一次發酵(也稱為種子罐發酵)具體為采用液體培養基，其組成為蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸餾水。所述培養基具體可以采用以下配方蔗糖15g，酵母6. 12g，MgSO4 O. 5g，KCl O. 5g，ZnSO4 · 7H20IOmg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。第一次發酵即種子罐發酵，其種子罐滅菌、接種量和接種溫度具體為121° C滅菌30min，此時pH范圍在6. O 6. 5 ;發酵液按一級種子罐裝量的4%體積比接種，接種溫度為30。C以下。發酵控制及發酵時間具體為裝罐系數0.6-0.7，28±1° C，攪拌速度為200-300rpm，取樣間隔時間為4小時；發酵時間為18-24小時。發酵周期45 54小時。所得種子液(即菌液)呈土黃色至深褐色，較為粘稠，孢子含量達到SXlOVml以上。根據本發明的制備方法，所述第二次發酵(也稱為生產罐發酵)具體為采用液體培養基，其組成為蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸餾水。所述培養基具體可以采用以下配方蔗糖15g，酵母6. 12g，MgSO4 O. 5g，KCl O. 5g，ZnSO4 · 7H20IOmg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。第二次發酵即生產罐發酵，其生產罐滅菌、接種量和接種溫度具體為培養液經121° C滅菌30min，接種量4%體積比，接種溫度為30° C以下。發酵控制及發酵時間具體為裝罐系數0.6-0.7，發酵溫度28±1° C，攪拌速度為200-300rpm，不需調節pH值；取樣間隔時間為3小時；發酵周期為42 50小時。所得菌液呈土黃色至深褐色，較為粘稠，發酵液中液生孢子含量在4X 108/ml以上，菌體干重在1.5%以上。根據本發明的制備方法，所述造粒具體為淡紫擬青霉菌在上述生產罐發酵完成后，在發酵罐中經過充分攪拌，分散菌絲以及孢子，制備成菌懸液備用。將已經充分溶解好的海藻酸鈉溶液與罐內菌懸液按照1:1比例在攪拌罐中徹底攪拌混勻，隨即加入無菌娃藻土，混合均勻成為礦土溶液。將該礦土溶液加入準備好的微球發生器內，液滴自小孔滴出，形成海藻酸鈉微球。微球用無菌水沖洗，室溫條件下陰干，干燥至微球制劑含水量降至2 %以下后包裝使用。每克微球制劑中有效成分含量> 107CFU/g制劑菌落數，微球制劑顆粒大小范圍為4± 1mm，千粒微球重量范圍為10-15克。根據本發明的制備方法，所述制劑通過以下步驟包裝、儲存
采用塑料袋抽真空保存，本制劑在室溫條件下存放6個月后，制劑有效成分仍然保持活力。本發明的有益效果本發明的方法每批次可獲得殺線蟲劑(微球制劑)250kg以上，優選在280-360kg，每克微球制劑中有效成分含量>107CFU/g制劑菌落數，微球制劑顆粒大小范圍為4± Imm,千粒微球重量范圍為10-15克,且生產成本低,可以大規模的生產粒狀淡紫擬青霉生物殺線蟲劑。下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍并不限于實施例。一、培養基及其配方I、馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)馬鈴薯去皮后切成塊，200g煮沸20min，紗布過濾后，向濾液中加葡萄糖20g，瓊脂 粉15g，用蒸餾水定容至1000ml，分裝，高壓蒸汽滅菌20分鐘后備用。2、液體培養基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg,蒸懼水 1000ml,pH=6. 5。二、菌株的培養和保存I、馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)馬鈴薯去皮后切成塊，200g煮沸20min，紗布過濾后，向濾液中加葡萄糖20g，瓊脂粉15g，用蒸餾水定容至1000ml，分裝，高壓蒸汽滅菌20分鐘后備用。2、菌株培養該菌株生長的溫度范圍為8-38° C，最佳為25-30° C。該菌株在pH 2_11之間均可以生長，適宜pH值為5-9。(I)在上述馬鈴薯瓊脂培養基中，菌株的具體培養條件為溫度25° C，pH=6. 5，所得菌株編號為Al。(2)在上述馬鈴薯瓊脂培養基中，菌株的具體培養條件為溫度30° C，pH=7，所得菌株編號為A2。(3)在上述馬鈴薯瓊脂培養基中，菌株的具體培養條件為溫度28° C，pH=9，所得菌株編號為A3。3、菌種保存將上述獲得的菌株采用普通試管PDA培養基塊法(切取生長在PDA培養基上生長良好的菌塊放置在I毫升無菌離心管中)，低溫下(4° C)保存。三、制備菌種I、活化菌種(I)將上述低溫保存的菌株Al轉接至PDA培養基斜面上，28°C條件下培養3天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為All)。(2)將上述低溫保存的菌株Al轉接至PDA培養基斜面上，28°C條件下培養4天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A12)。(3)將上述低溫保存的菌株Al轉接至PDA培養基斜面上，30°C條件下培養3天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A13)。(4)將上述低溫保存的菌株A2轉接至PDA培養基斜面上，28 °C條件下培養3天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A21)。(5)將上述低溫保存的菌株A2轉接至PDA培養基斜面上，28 °C條件下培養4天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A22)。(6)將上述低溫保存的菌株A2轉接至PDA培養基斜面上，30°C條件下培養3天，可用于接種搖瓶進行 種子培養(記為A23)。(7)將上述低溫保存的菌株A3轉接至PDA培養基斜面上，28 °C條件下培養3天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A31)。(8)將上述低溫保存的菌株A3轉接至PDA培養基斜面上，28 °C條件下培養4天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A32)。(9)將上述低溫保存的菌株A3轉接至PDA培養基斜面上，30°C條件下培養3天，可用于接種搖瓶進行種子培養(記為A33)。2、制備搖瓶菌種(I)搖瓶培養基液體培養基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H2010mg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。(2)搖瓶培養控制搖瓶裝量彡150ml/500ml瓶，搖床轉速為150rpm，培養溫度29 30° C，時間為約72h。(3)接種采用培養基塊直接接種搖瓶即可，由于該菌可以產生大量分生孢子，因此接入直徑O. 5mm培養基塊4塊到一個搖瓶即可。(4)獲得菌種以上獲得的菌種在PDA培養基上顏色正常，鏡檢無其他雜菌孢子存在，無細菌菌膿等雜質，無酸性氣味存在。四、第一次發酵(種子罐發酵)I、種子罐培養基液體培養基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H2010mg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。2、種子罐滅菌、接種量和接種溫度121° C滅菌30min，此時pH范圍在6. O 6. 5。發酵液按一級種子罐裝量的4%體積比接種，接種溫度為30° C以下。3、發酵控制及發酵時間裝罐系數0.6-0.7，28±1° C，攪拌速度為200_300rpm，取樣間隔時間為4小時。發酵時間為18-24小時。發酵周期45 54小時。4、獲得種子液獲得的種子液(即菌液)呈土黃色至深褐色，較為粘稠，孢子含量達到8XlOVml以上。五、第二次發酵(生產罐發酵)I、生產罐培養基
液體培養基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H2010mg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。2、生產罐滅菌、接種量和接種溫度培養液經121° C滅菌30min，接種量4%體積比，接種溫度為30° C以下。3、發酵控制及發酵時間裝罐系數O. 6-0. 7，溫度28 ±1° C，攪拌速度為200 300rpm，不需調節pH值。取樣間隔時間為3小時，發酵周期為42 50小時。
4、獲得菌液獲得的菌液呈土黃色至深褐色，較為粘稠，發酵液中液生孢子含量在4X 108/ml以上，菌體干重在1.5%以上。六、制劑及儲存I、發酵液的后處理經生產罐發酵后的淡紫擬青霉菌在發酵罐中經過充分攪拌，分散菌絲以及孢子，制備成菌懸液備用。2、混合物料將已經充分溶解好的海藻酸鈉溶液與罐內菌懸液按照I :1比例在攪拌罐中徹底攪拌混勻，隨即加入無菌娃藻土，混合均勻成為礦土溶液。將該礦土溶液加入準備好的微球發生器內，液滴自小孔滴出，形成海藻酸鈉微球。3、制備成品微球用無菌水沖洗，室溫條件下陰干，干燥至微球制劑含水量降至2%以下后包裝使用。4、成品的質量所得微球中，每克微球制劑中有效成分含量> 107CFU/g制劑菌落數，微球制劑顆粒大小范圍為4± 1mm，千粒微球重量范圍為10-15克。5、產品的儲存采用塑料袋抽真空保存，本制劑在室溫條件下存放6個月后，制劑有效成分仍然保持活力。具體的操作參數及產品參數見表I。表I操作參數及產品參數
權利要求
1.一種粒狀淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的制備方法，其包括如下步驟準備菌株、制備菌種、第一次發酵、第二次發酵和造粒，其特征在于，所述制備菌種中采用的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸餾水；所述第一次發酵中的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgS04、KCl、ZnS04 · 7H20和蒸餾水；所述第二次發酵中的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnS04 · 7H20 和蒸餾水。
2.如權利要求I所述制備方法，所述制備菌種中采用搖瓶培養，其搖瓶裝量(150ml/500ml瓶、搖床轉速為150rpm、培養溫度為29 30°C、時間為72h。
3.如權利要求I或2所述制備方法，所述第一次發酵中的發酵罐的接種量為4%體積t匕，發酵罐的裝罐系數為O. 6-0. 7、溫度為27-29° C、攪拌速度為200_300rpm，發酵周期為45-54小時。
4.如權利要求I至3之一所述制備方法，所述第二次發酵中的發酵罐的接種量為4%體積比，發酵罐的裝罐系數為O. 6-0. 7、溫度為27-29° C、攪拌速度為200_300rpm，發酵周期為42-50小時。
5.如權利要求I至4之一所述制備方法，所述制備菌種中的培養基的組成為蔗糖15g，酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸餾水 1000ml ；pH=6. 5。
6.如權利要求I至5之一所述制備方法，所述第一次發酵中的培養基的組成為蔗糖15g，酵母 6. 12g, MgSO4O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸餾水 1000ml ；pH=6. 5。
7.如權利要求I至6之一所述制備方法，所述第二次發酵中的培養基的組成為蔗糖15g，酵母 6. 12g, MgSO4O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸餾水 1000ml ；pH=6. 5。
全文摘要
本發明提供一種粒狀淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的制備方法，其包括如下步驟準備菌株、制備菌種、第一次發酵、第二次發酵和造粒，所述方法中采用的培養基的組成為蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸餾水。通過對淡紫擬青霉生物殺線蟲劑制備方法中各種工藝條件的選擇，提供一種可大規模生產淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的方法，獲得的淡紫擬青霉生物殺線蟲劑的袍子產量高、生產成本低。
文檔編號A01N63/04GK102960369SQ20121048011
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者梁洪柱, 田會鵬, 陳倩, 李學燕 申請人:北京市西山試驗林場