專利名稱：淡紫擬青霉m-14菌株的特異性分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及淡紫擬青霉M-14菌株的特異性分子標記及其應用，屬生物技術領域。
背景技術：
大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)是植物寄生線蟲的重要類群之一，在我國，線蟲主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經濟作物，成為發展這些作物的重要限制因子。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲每年造成的損失達8億元之多。更嚴重的是由于線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴重發生。據不完全統計，線蟲病害每年造成各種作物產量平均損失達10～15％。長期以來線蟲依賴于化學農藥防治，隨著科學技術發展，發現化學殺線蟲劑不僅存在殘毒影響人體健康，更重要的是因其主要防治目標線蟲生長于地下。而土壤生態環境復雜，必須大劑量施用才可能有效。而大劑量使用對地下水造成嚴重污染。因此相當多的化學殺線蟲劑的使用均不同程度受到限制，有的已經被禁用。市場呼喚高效低毒化學及生物殺線蟲劑。
在線蟲生物防治中，目前所有研究開發的線蟲生防制劑均不同程度的存在防效不穩定的問題。由中國農科院生防所劉杏忠研究員與黑龍江農墾科學院聯合，利用淡紫擬青霉M-14開發的大豆胞囊線蟲抑制劑在推廣過程中，同樣存在防效不穩定的問題。究其原因，主要是缺乏對生防菌生態學研究。由于土壤是一個復雜的生態環境，要進行生防菌田間生態學研究首先必須解決生防菌田間快速檢測問題。盡管許多學者對如何檢測進行了不懈的努力，針對不同的菌株研究開發了許多方法，但仍未解決問題。主要是對生防菌檢測靈敏度和準確性不高，不能準確客觀地反映生防菌在自然環境中的定殖、存活及消長規律。因此，開發一種有效的線蟲生防菌分子標記及檢測方法已經是線蟲生防領域中急待解決的問題。
隨著分子生物學技術的快速發展，特別是分子標記和基因標記技術的建立與成熟，為解決上述問題提供了有效手段。將通過分子標記和基因標記的生防菌釋放到自然環境后，可以根據生防菌攜帶的標記基因或特定分子標記進行快速檢測及生態學研究，準確掌握生防菌在自然環境中的定殖、生長及繁殖等活動規律，為生防制劑的開發利用提供理論依據，并最終發揮生物防治在病蟲害綜合治理中的重要作用。

發明內容
本發明的目的在于通過大豆胞囊線蟲生防菌M-14菌株的特異性分子標記及其檢測，提供一種快速鑒別和檢測生防菌M-14菌株的方法。
本發明采用的真菌是淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus M-14，由該菌株生產的大豆胞囊線蟲抑制劑已獲國家發明專利“防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑”，專利號95121114。該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC NO.0241。
本發明是這樣實現的通過隨機擴增DNA多態性(RAPD)PCR擴增技術對M-14菌株和用為對照的同種不同菌株及土壤中常見真菌進行分子指紋分析。對M-14菌株和對照菌株的分子指紋進行分析比較，獲得M-14菌株的RAPD特異性DNA片段P850和P1400，將該DNA片段進行回收、純化，克隆和測序。具體特征為通過引物OPC-11(5′-AAA GCT GCG G-3′)擴增出一條大小約為P850bp的M-14菌株特有的DNA片段，該片段命名為P850；通過引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)擴增出一條大小約為P1400bp的M-14菌株特有的DNA片段，該片段命名為P1400。特異性DNA片段P850堿基序列長度為853bp(附圖1)，特異性DNA片段P1400堿基序列長度為1429bp(附圖2)。擴增DNA片段P850的特異性引物及堿基序列為FP850(5′→3′)AAA GCT GCG GGT CGT TGG TRP850(5′→3′)AAA GCT GCG GAC CAC GGC CA擴增DNA片段P1400的特異性引物及堿基序列為FP1400(5′→3′)TGA GCG GAC AGG AAC AGG CRP1400(5′→3′)TGA GCG GAC ACC AAT CTC TC根據該特異性DNA片段序列設計特異性SCAR-PCR引物，對施用M-14菌株的自然環境土壤提取的DNA進行PCR擴增，特異性檢測M-14菌株在自然環境土壤中的存在與否及其種群數量。同時將擴增出的M-14菌株特異性DNA片段P850和P1400進行地高辛標記制成雜交探針，利用標記探針對施用M-14菌株的自然環境土壤提取的DNA進行斑點雜交，特異性檢測M-14菌株在自然環境土壤中的存在與否及其種群數量。
本發明具有能對DNA分子進行快速鑒別和檢測的功能，為該菌株的生態學研究提供科學、高效研究手段。此外，當該菌株被非法使用和生產時，可利用該特異性引物進行準確鑒別，成為解決法律糾紛的有力證據。


圖1為特異性DNA片段P850的測序堿基序列。
圖2為特異性DNA片段P1400的測序堿基序列。
圖3為特異性引物FP850和RP850對M-14菌株的PCR檢測結果。
圖4為特異性引物FP1400和RP1400對M-14菌株的PCR檢測結果。
圖5為特異性DNA片段P850標記探針對M-14菌株斑點雜交檢測結果。
圖6為特異性DNA片段P1400標記探針對M-14菌株斑點雜交檢測結果。
具體實施例方式下面用實例來進一步詳述本發明，但本發明的內容并不局限于此。
1、特異性DNA片段的獲得通過培養M-14菌株和對照菌株純培養物菌絲體，分別提取其基因組DNA，用通用引物進行PCR擴增，篩選出對所有供試菌株具有DNA多態性的引物。對擴增出的DNA多態性進行比較，其中引物OPC-11(5′-AAA GCT GCG G 3′)擴增出一條大小約為P850bp的M-14菌株特有的DNA片段，該片段命名為P850；引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)擴增出一條大小約為P1400bp的M-14菌株特有的DNA片段，該片段命名為P1400。
2、特異性DNA片段序列測定在紫外觀察儀下分別切取電泳后瓊脂糖凝膠上特異性DNA片段P850和P1400，用QIAquick Gel Extraction Kit回收純化該DNA片段。將該片段分別用pGEM-T-EasyVector Systems試劑盒進行克隆，通過藍白斑平板篩選重組克隆菌落，并制備重組克隆質粒DNA，電泳檢測其分子量大小，確定特異性DNA片段單拷貝插入的重組質粒后，將該重組質粒送商業測序公司測序。測序結果表明，特異性DNA片段P850堿基序列長度為853bp(附圖1)，特異性DNA片段P1400堿基序列長度為1429bp(附圖2)。
3、特異性引物設計根據SCAR-PCR技術原理，分別以特異性DNA片段P850和P1400的兩端堿基序列作為特異性引物的上游引物和下游引物。
擴增DNA片段P850的特異性引物及堿基序列為FP850(5′→3′)AAA GCT GCG GGT CGT TGG TRP850(5′→3′)AAA GCT GCG GAC CAC GGC CA擴增DNA片段P1400的特異性引物及堿基序列為FP1400(5′→3′)TGA GCG GAC AGG AAC AGG CRP1400(5′→3′)TGA GCG GAC ACC AAT CTC TC4、M-14菌株的特異性PCR檢測提取施用M-14菌株土壤DNA，以未施用M-14菌株土壤DNA為對照，分別用特異性引物FP850/RP850和FP1400/RP1400進行PCR擴增。擴增結果表明，施用M-14菌株的土樣能分別擴增出特異性DNA片段P850和P1400，而未施用M-14菌株的土壤DNA無任何擴增產物(附圖3和附圖4)。
5、M-14菌株的核酸探針檢測將特異性引物擴增的DNA片段分別用地高辛標記成探針，用提取施用M-14菌株的土壤DNA作為模板進行斑點雜交，以未施用M-14菌株土壤DNA為對照。雜交結果表明，施用M-14菌株的土樣DNA出現雜交信號，而未施用M-14菌株的土壤DNA無任何雜交信號(附圖5和附圖6)。
根據以上研究結果，由M-14菌株特異性DNA片段P850和P1400的堿基序列設計的特異性引物FP850/RP850和FP1400/RP1400可以對該菌株進行特異性快速PCR檢測和斑點雜交檢測。同時還可以利用該引物進行PCR擴增確定M-14菌株在土壤環境中的種群數量。
權利要求
1.淡紫擬青霉M-14菌株的特異性分子標記，包括特異性DNA片段的獲得、特異性DNA片段序列測定、特異性引物設計、地高辛標記制成雜交探針，其特征在于1.1采用真菌淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus M-14菌株為培養物菌絲體；1.2引物OPC-11(5′-AAA GCT GCG G-3′)擴增出一條大小約為850bp的M-14菌株特有的DNA片段，該片段命名為P850；引物OPD-05(5′-TGA GCGGAC A-3′)擴增出一條大小約為1400bp的M-14菌株特有的DNA片段，該片段命名為P1400；1.3特異性DNA片段P850堿基序列長度為853bp，特異性DNA片段P1400堿基序列長度為1429bp；1.4擴增DNA片段P850的特異性引物及堿基序列為FP850(5′→3′)AAA GCT GCG GGT CGT TGG TRP850(5′→3′)AAA GCT GCG GAC CAC GGC CA；1.5擴增DNA片段P1400的特異性引物及堿基序列為FP1400(5′→3′)TGA GCG GAC AGG AAC AGG CRP1400(5′→3′)TGA GCG GAC ACC AAT CTC TC。
2.淡紫擬青霉M-14菌株的特異性分子標記的應用，其特征在于該特異性分子標記標記可作為分子鑒別和檢測的應用。
全文摘要
本發明涉及淡紫擬青霉M－14菌株的特異性分子標記及其應用，屬生物技術領域。本發明通過隨機擴增DNA多態性技術對M－14菌株和作為對照的土壤中常見真菌進行分子指紋分析，獲得M－14菌株的RAPD特異性DNA片段P850和P1400，將該DNA片段進行回收、純化，克隆和測序。根據該特異性DNA片段序列設計特異性SCAR－PCR引物，對施用M－14菌株的自然環境土壤提取的DNA進行PCR擴增，同時將擴增出的M－14菌株特異性DNA片段P850和P1400進行地高辛標記制成雜交探針，利用標記探針對施用M－14菌株的自然環境土壤提取的DNA進行斑點雜交，特異性檢測M－14菌株在自然環境土壤中的存在與否及其種群數量。本發明可對M－14菌株DNA分子進行快速鑒別和檢測，為該菌株的生態學研究提供高效、科學研究手段。
文檔編號C12Q1/68GK1514007SQ0313531
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月27日 優先權日2003年6月27日
發明者祝明亮, 夏振遠, 張克勤, 劉杏忠 申請人:云南煙草科學研究院