專利名稱：：一種淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法
技術領域：
：本發明涉及肥藥兩用的土壤微生物肥藥，更具體涉及一種淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法。
背景技術：
：在傳統農業生產中，為了增產增收，農戶往往大量使用化肥和生產激素等產品促進作物生長，同時使用農藥控制病蟲害，但由于這些化肥、農藥和生產激素等幾乎都是同一時期使用，其中的二甲苯等輔助添加劑等多次殘留，使許多地方的土壤結構、土地肥力和植物生態失衡、發生退化和異變，造成農作物特別是蔬菜、果樹等出現頑固性病害，而治理這些病害所用的化學農藥又增加了土地和農產品的污染。在這種情況下，一些廠家開始研發同時具有藥效和肥效的制劑，以減少化肥和農藥的施用量，達到的節約成本、減少工時、降低土地污染的目的。這些制劑又可分為以藥的方式使用并兼具肥效的肥藥以及以肥的形式使用并兼具藥效的藥肥，通常是簡單地將農藥和肥料按一定的比例配方相混合，并通過一定的工藝而生產的農藥與肥料的復合劑，兩者各自單獨發揮其效用，但之間并無相互作用。植物線蟲病是腔腸動物線蟲引起的一類根部病害，嚴重影響作物產量。目前，植物線蟲病發生日益嚴重，幾乎所有的作物都有線蟲危害。寄生線蟲成為植物侵染性病害的重要病原物之一，對全世界農業生產有很大影響。據估計，全世界每年因線蟲危害給糧食和纖維作物造成的損失大約為12.3%，造成約1000億美元的損失。我國農作物種植業每年因線蟲造成的危害損失近233億元。線蟲的防治中應用最廣泛是采用殺線蟲劑進行化學防治，但殺線蟲劑通常毒性較高，會增加環境的污染，越來越多的學者認識到控制寄生性線蟲必須采取綜合措施或采用以生物生態防治為核心的可持續治理系統。真菌是線蟲生物防治中研究較多的天敵生物，也是最為重要的生防因子之一。其中最為著名、也是最重要的一個機會真菌淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus(Thorn)Samson)廣泛分布于世界各地，容易從土壤中，真菌菌核，線蟲和昆蟲上分離得到，且易培養。國內外學者對該菌進行了大量的研究，多年的實踐證明淡紫擬青霉效果顯著，且具有持效性；對多種線蟲有防治效能，是防治寄生線蟲最有前途的生防制劑。同時，該菌對目前使用的殺肥藥具有相當的耐藥性，可和殺肥藥混用，提高防效。菲律賓已將此菌商品化，商品名加iocon。研究表明，在淡紫擬青霉的生長過程中，特別是在深層發酵培養過程中，該菌能產生豐富的衍生物，其一是類似吲哚乙酸產物，它最顯著的生理功效是在低濃度時促進植物根系與植株的生長，此外還能產生類似生長素和細胞分裂素的作用。因此在根系施用淡紫擬青霉不僅能明顯抑制線蟲侵染，而且能促進植株營養器官的生長，同時對種子的萌發與生長也有促進作用。淡紫擬青霉對多種植物病原菌具有拮抗活性，有研究表明淡紫擬青霉菌株36-l對8種植物病原菌有顯著拮抗活性，它們是玉米小斑病、小麥赤霉病、棉花枯萎病、水稻惡菌病、水稻紋枯病、柑桔青霉病菌、柑桔綠霉菌、黃瓜炭疽病菌，Abdul(2000)利用淡紫擬青霉控制棉花細菌性枯萎病與棉花病毒病，結果表明擬青霉菌能明顯降低棉花(NIAB-18、C頂-240品種)的病毒性病害，并有效抑制細菌性枯萎病，還從溫室中篩選出高拮抗力菌株，噴灑在小麥葉片上，用以控制小麥葉斑病。相關研究還證實淡紫擬青霉能顯著降低向日葵和納豆根癌病的發病率，并且能抑制由鐮孢菌屬引起的蕃茄根腐病。研究發現，淡紫擬青霉能促進難溶磷酸鹽的溶解，經實驗室試驗淡紫擬青霉菌對辛硫磷的校正降解率在94左右。同類研究還表明，擬青霉還能促進許多化學聚合物(如有機磷農藥，制革廢水等)的分解。綜上所述，淡紫擬青霉不僅可以開發成為優秀的殺線蟲生物農藥，并且能同時防治多種植物病害，還可作為高效的生物肥料使用，降低化學農藥和化學肥料的殘留，促進無公害農產品的生產。
發明內容本發明的目的是提供一種淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，解決現有技術中如只將藥物和肥料簡單混合，藥用和肥用效果均不佳，污染環境等等的一系列問題，制備過程簡單易行，培養的淡紫擬青霉生物肥藥中菌活性好，固體發酵培養時直接以肥料作為培養基，并以微生物作為藥用成分，使本發明的肥藥具有藥用和肥用的有機結合，肥效藥效均非常顯著，而且對環境無污染，具有顯著的經濟效益和環境保護效益。本發明的技術內容淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，步驟包括(1)生產用液體菌種制備以淡紫擬青霉為菌種制作二級液體菌種，并以査氏液體培養基或PDA液體培養基為生產用液體菌種用培養基，在發酵罐接種二級液體菌種，培養生產用液體菌種；(2)配置固體發酵培養基，接種步驟(1)所得的生產用液體菌種，轉入固體發酵池，厚層通風發酵制備淡紫擬青霉固體發酵培養物；(3)將步驟(2)的淡紫擬青霉固體發酵培養物，508(TC烘干，粉碎，即得淡紫擬青霉肥藥。本發明的優良效果在于選用高效線蟲生防菌淡紫擬青霉為生產菌株，不僅對植物寄生性線蟲具有高毒力，而且對多種植物病原菌具有拮抗活性，同時還能產生類生長激素物質，促進植物生長，進一步提高產品的肥效作用；作為淡紫擬青霉固體發酵的基礎培養基，養殖場腐熟發酵床墊料本身即是優良的有機肥來源，為作物提供肥力的同時也能為菌株在土壤中更好的定殖提供條件。盆栽和田間試驗結果表明，對作物根結線蟲病害防治效果顯著，同時有良好的抗病促長效果；制備過程簡單易行，培養的淡紫擬青霉生物肥藥中生防菌產孢率高、活性好；固體發酵培養直接以有機肥作為基礎培養基，以高效線蟲生防菌淡紫擬青霉作為藥用成分，使本發明的肥藥具有藥效和肥效的有機結合，以肥養藥，以藥增肥，兩者相互促進，肥效藥效均非常顯著，可減少化學農藥和化肥的使用量，對環境無污染，具有顯著的經濟效益和環境保護效益。具體實施例方式本發明以福建隆科君農業科技有限公司銷售的淡紫擬青霉為生產菌株，制備淡紫擬青霉生物肥藥，各步驟具體說明如下菌種制備二級液體菌種培養該步驟可以按淡紫擬青霉二級液體菌種常規技術培養，也可以按照以下具體步驟培養A.固體斜面菌種培養配置査氏固體培養基或PDA固體培養基，滅菌，劃線接種淡紫擬青霉，置于恒溫培養箱內253(TC下培養79天；所述固體斜面菌種培養中用的査氏培養基NaN033g、K2HP04lg、KC10.5g、MgS047H200.5g、FeS040.Olg、蔗糖30g、瓊月旨1520g、H20lOOOmL，pH自然;所述固體斜面菌種培養中用的PDA固體培養基稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1000mL煮沸半小時或高壓蒸煮20分鐘，紗布過濾，再加1020g葡萄糖和1720g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾。B.二級液體菌種培養二級液體菌種培養基配方與所述固體斜面菌種培養基配方中除不加瓊脂外其余成分或制備方法相同，將二級液體菌種培養基按250mL/瓶的量分裝于lL的分裝于三角瓶中，滅菌冷卻后，在無菌操作臺上，用接種環從固體斜面培養基保存的淡紫擬青霉中勾取分生孢子一環，接種至三角瓶內液體培養基中，搖床110150rpm、253(TC培養45天。將所述培養生產用液體菌種中用的査氏液體培養基或PDA液體培養基于氣升式發酵罐中裝罐、滅菌后，按培養基lwt。/。的量接種二級液體菌種，控制通氣量l:1、溫度253(TC，發酵培養78天，得到淡紫擬青霉的生產用液體菌種。生產用液體菌種用培養基査氏液體培養基配方為NaN033g、K2HP04lg、KC10.5g、MgS047H200.5g、FeS040.01g、蔗糖30g、H201000mL，pH自然;PDA液體培養基為稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1000mL煮沸半小時或高壓蒸煮20分鐘，紗布過濾，再加1020g葡萄糖，充分溶解后趁熱紗布過濾。(2)厚層通風發酵制備淡紫擬青霉固體發酵培養物基礎培養基6080重量份，輔助碳源2040重量份，攪拌均勻后加水，調整含水率為3050wt%，接種步驟(1)的生產用液體菌種1015重量份，轉入固體發酵池中，通風，在253(TC下發酵，2430小時翻動一次，發酵79天，即得到淡紫擬青霉的固體發酵培養物基礎培養基為腐熟或半腐熟的養殖場發酵床有機墊料；輔助碳源為米糠、麩皮、玉米淀粉或秸粉的一種或幾種。該淡紫擬青霉的固體發酵培養物，孢子數可達到5億/g干品。(3)將步驟(2)得到的淡紫擬青霉固體發酵培養物經508(TC干燥后，粉碎、質檢、包裝成品。下面結合具體的實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，或按制造廠商所建議的條件。在未作特別注明的前提下，所涉及到的所有份數均為質量份數，所有百分比均為質量百分比。實施例l(1)淡紫擬青霉的二級液體菌種的制備，具體操作步驟如下A.斜面菌種(固體)稱取20份馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水100份煮沸半個小時或高壓蒸煮20分鐘，紗布過濾，再加2份葡萄糖和2份瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，15磅蒸氣(121°C)滅菌20分鐘后取出試管擺斜面，冷卻后劃線接種淡紫擬青霉NH-PL-03菌株，置于恒溫箱內28'C培養8天。B.二級菌種(液體)培養基配方同斜面但不加瓊脂，分裝于三角瓶中，滅菌冷卻后，在無菌操作臺上，用接種環從固體斜面培養基保存的淡紫擬青霉中勾取分生孢子一環，接種至液體培養基中，搖床110rpm、28。C培養4天。生產用液體菌種的制備培養基査氏液體培養基，NaN033份、K2HP04l份、KC10.5份、MgS047H200.5份、FeS04O.Ol份、蔗糖30份、H20IOOO份，pH自然。氣升式發酵罐裝罐、滅菌后，接種二級液體菌種50份，控制通氣量l:1、溫度28'C，發酵培養8天，得到淡紫擬青霉的生產用液體菌種。(2)厚層通風發酵制備淡紫擬青霉固體發酵培養物半腐熟的養殖場發酵床墊料80份，麩皮20份，攪拌均勻后加水，調整含水率為40%，接種步驟(1)的生產用液體菌種10份(以上均為重量份)，轉入固體發酵池中，通風，在28"C下發酵，24小時翻動一次，發酵8天，即得到淡紫擬青霉的固體發酵培養物。該淡紫擬青霉的固體發酵培養物，孢子數可達到5億/g干品。(3)將步驟(2)的淡紫擬青霉固體發酵培養物，508(TC烘干，粉碎，即得淡紫擬青霉肥藥。實施例2:淡紫擬青霉肥藥的制備與實施例l不同的步驟如下，其余未說明的步驟同實施例l:步驟(2)厚層通風發酵制備淡紫擬青霉固體發酵培養物腐熟的養殖場發酵床墊料70份，米糠15份，玉米淀粉15份，攪拌均勻后加水，調整含水率為40%，接種步驟(1)的生產用液體菌種8份(以上均為重量份)，轉入固體發酵池中，通風，在27。C下發酵，2430小時翻動一次，發酵9天，即得到淡紫擬青霉的固體發酵培養本發明制備的淡紫擬青霉肥藥的效果試驗煙草根結線蟲盆栽防治試驗l供試線蟲采集和繁殖供試線蟲從受線蟲侵染的根圍獲得。受害根結在顯微鏡下檢査并經掃描電鏡觀察鑒定，確認為爪哇根結線蟲(Meloidogymejavanica)后，采用卵囊接種法，將線蟲接種于煙苗根部進行擴大繁殖。2試驗處理在栽培缽中先加入經日曬消毒并經分離證實無線蟲的健土，作以下4種處理l.肥藥處理每缽各加入100g經接種繁殖帶根結的根際病土和50g肥藥；2.殺線蟲劑處理每缽各加入100g帶根結的病土和2g殺線蟲劑(3%呋喃丹顆粒劑)，隔15d后在施l次殺線蟲劑(每缽2g);3.日曬消毒土壤每缽加入100g經日光消毒的土壤，不接線蟲，不施藥。對照(CK):每缽加入100g帶根結的病土，不防治。每處理組均植入長勢均勻的三葉齡煙苗，每處理20缽，試驗重復2次。盆栽試驗用菌量為50g/每株。定植后，觀察植株的生長情況。煙苗生長2個月后，拔出煙苗，用清水沖洗去根系土壤，逐一量出植株高度、葉長，用普通天平稱出每株地上部和根系鮮重。按以下標準進行根結嚴重度分級O級為所有根系均未被線蟲侵染，無根結；11級為根結占總根系的26%-50%;III級為根結數占總根系的51%-75%;1￥級為根結數占總根系的76%-100%。病情指數二各級株數X嚴重度級數/調査總株數X最高病級數按以上公式算出各處理組中的病情指數。每缽取根系土樣l份，按處理組混勻，稱取50g，在顯微鏡下觀察，統計出根圍土壤中的2齡線蟲群體水平。3防治效果3.l藥效煙草根結線蟲在煙草根部為害產生根結，導致地上部生長不良。試驗結果表明，施用肥藥和殺線蟲劑均能有效地抑制根結線蟲的繁殖和減輕為害。殺線蟲劑作用最強，煙草根結線蟲病病情指數比對照下降39.5%，二齡線蟲數減少79.2%，其次是施用肥藥，植株病情指數比對照下降了34.0%，二齡線蟲數減少了76.3%(表l)表l病情指數和土壤中的二齡線蟲數(50g根圍土壤中)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.2肥效試驗結果表明，淡紫擬青霉肥藥不僅對線蟲起抑制作用而且能促進煙草植株生長。雖然與殺線蟲劑相比，根結病情指數稍高，但植株生長卻比呋喃丹處理組健壯。從植株長勢看，加入肥藥的煙株葉色濃綠，長勢良好；加入3%呋喃丹顆粒劑的煙草的植株葉莖短縮，葉色偏黃，株高明顯低于加肥藥的煙株；而僅加病土的對照則明顯矮小，長勢差；使用日曬消毒土壤種植的煙株生長健壯。煙株生長性狀測定結果表明，經處理的煙草植株和根系平均鮮重、株高、葉長均明顯高于未處理的植株。施用肥藥的植株地上部平均鮮重比對照增加96.25%，根系增加153.85%，株高和葉長分別增加75.89%和38.89%，以根系增重最為顯著。此外，施用肥藥的煙株其地上部及根系的平均鮮重、株高和葉長均明顯高于施用殺線蟲劑的煙。將施用肥藥組和使用日曬消毒健土處理組進行比較，肥藥組的地上部和根系鮮重2、7周后調査發現土壤中2齡線蟲減少76.3%，根結指數下降43.6%，煙株根生長量增加153.7%，地上部分鮮重增加44.4%茄子根結線蟲田間小區防治試驗1根結線蟲卵體的制備室內培養的根結(帶根結線蟲)剪切后，用雙層紗布過濾，在解剖鏡下計算根結線蟲卵數。2實驗處理試驗于2003年在福建省福州市永泰葛嶺福建農科院生物技術中心實驗基地進行，共設三個肥藥處理，每處理穿插一個對照，田間每畦種植36株，每處理為三畦分為兩排，即每處理各108株。茄子長二片真葉時，三個處理分別以淡紫擬青霉肥藥兌清水澆灌。澆菌一周后用根結線蟲卵體接種，500株茄子苗共接4000個卵(懸浮液濃度^10個/mL)，二周后重復上次接卵處理。茄苗移栽大田后，分別在生長期、花期各澆灌肥藥一次(孢子濃度^1.2Xl(/個/mL)，CK用清水澆灌。跟蹤調査根結線蟲的數量以及植株生長情況，評價肥藥的效果。3防治效果3.l藥效表l.田間茄子根圍根結線蟲蟲口密度抽樣調査(單位條/50g土)調査時間淡紫擬青霉肥藥處理小區平均蟲口減退率IIIIII施藥后一周20418610852.02<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>調査結果見表l，施藥后一周，淡紫擬青霉/巴藥處理小區根結線蟲蟲口減退率分別下降了58.02%，20.51%，66.04%，花期前與結果期平均蟲口減退率達到88.44和95.96%。田間自然蟲口減退率也達到47.50%，說明田間土壤中還存在其它根結線蟲的生防因子。3.2肥效藥后一周取樣觀察，三種處理茄子根系有受根結線蟲不同程度侵染，且總體水平較低，相比淡紫擬青霉肥藥處理，CK根瘤明顯大些。取結果期植株觀察(圖2)，淡紫擬青霉劑處理在植株生長性狀表現較良好；在根部為害狀上，淡紫擬青霉肥藥處理的茄子植株根部線蟲發育緩慢、根瘤細小、根系發達，須根較多，而對照株表現為根脹大明顯、根瘤較大，根系也不大發達。田間各處理小區的產量見表2，施用淡紫擬青霉的小區增產率在24.32%-29.56%之間，平均增產率達到26.60%，表2田間各處理總產量對比及增產率項目各小區產量(kg)均值IIIIII肥藥處理125.91123.20102.40117.17CK100.3494.9382.3792.55增產率％25.4729.5624.3226.60權利要求1.一種淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述制備方法的步驟包括(1)生產用液體菌種制備以淡紫擬青霉為菌種制作二級液體菌種，并以查氏液體培養基或PDA液體培養基為生產用液體菌種用培養基，在發酵罐接種二級液體菌種，培養生產用液體菌種；(2)配置固體發酵培養基，接種步驟(1)所得的生產用液體菌種，轉入固體發酵池，厚層通風發酵制備淡紫擬青霉固體發酵培養物；(3)將步驟(2)的淡紫擬青霉固體發酵培養物，50～80℃烘干，粉碎，即得淡紫擬青霉肥藥。2.根據權利要求l所述的淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)的固體發酵培養物制備具體如下基礎培養基6080重量份，輔助碳源2040重量份，攪拌均勻后加水，調整含水率為3050wt%，接種步驟(1)的生產用液體菌種1015重量份，轉入固體發酵池中，通風，在253(TC下發酵，2430小時翻動一次，發酵79天，即得到淡紫擬青霉的固體發酵培養物3.根據權利要求2所述的淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述的基礎培養基為腐熟或半腐熟的養殖場發酵床有機墊料。4.根據權利要求2所述的淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述的輔助碳源為米糠、麩皮、玉米淀粉或秸粉的一種或幾種。5.根據權利要求l所述的淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中二級液體菌種具體步驟為A.固體斜面菌種培養配置査氏固體培養基或PDA固體培養基，滅菌，劃線接種淡紫擬青霉，置于恒溫培養箱內253(TC下培養79天；所述固體斜面菌種培養中用的査氏固體培養基配方3g、^4lg、KC1MgS〇47H20FeS〇4`0.5g、0.5g、O.Olg、蔗糖30g、瓊脂1520g、水1000mL，pH自然；所述固體斜面菌種培養中用的PDA固體培養基為稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1000mL煮沸半小時或高壓蒸煮20分鐘，紗布過濾，再加1020g葡萄糖和1720g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾；B.二級液體菌種培養二級液體菌種培養基配方與所述固體斜面菌種培養基配方中除不加瓊脂外其余成分或制備方法相同，將二級液體菌種培養基按250mL/瓶的量分裝于lL的三角瓶中，滅菌冷卻后，在無菌操作臺上，用接種環從固體斜面培養基保存的淡紫擬青霉中勾取分生孢子一環，接種至三角瓶內液體培養基中，搖床110150rpm、253(TC培養45天6.根據權利要求l所述的淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中生產用液體菌種制備步驟中將所述培養生產用液體菌種中用的査氏液體培養基或PDA液體培養基于氣升式發酵罐中裝罐、滅菌后，按培養基lwt。/。的量接種二級液體菌種，控制通氣量`l:1、溫度253(TC，發酵培養78天，得到淡紫擬青霉的生產用液體菌種。7.根據權利要求1或6所述的淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的生產用液體菌種用培養基NaNO，K^HPC^MgS〇47H20査氏液體培養基配方為3g、4ig、KC10.5g、4FeS〇4`0.5g、0.Olg、蔗糖30g、水1000mL，pH自然；PDA液體培養基為稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1000mL煮沸半小時或高壓蒸煮20分鐘，紗布過濾，再加1020g葡萄糖，充分溶解后趁熱紗布過濾。全文摘要本發明提供一種淡紫擬青霉生物肥藥的制備方法，屬于農業生物
技術領域：
，解決現有技術的中存在的問題，制備方法包括以淡紫擬青霉為菌株，接種三角瓶液體菌種，以查氏培養基發酵制備生產用液體菌種；以養殖場腐熟或半腐熟的發酵床墊料為基礎培養基，配以輔助碳源和水，接種液體菌種，在固體發酵池內厚層通風發酵制備淡紫擬青霉固體發酵培養物；將淡紫擬青霉固體發酵培養物干燥、粉碎，即得。本發明以高效線蟲生防菌淡紫擬青霉為菌株，利用養殖場腐熟或半腐熟的發酵床墊料為主要原料，發酵生產淡紫擬青霉生物肥藥，作為土壤微生物肥藥，可防治寄生性線蟲及多種植物病原菌，同時，該肥藥能促進植物生長，降低土壤農藥殘留。文檔編號C05F17/00GK101671210SQ20091030904公開日2010年3月17日申請日期2009年10月29日優先權日2009年10月29日發明者波劉,懷史申請人:福建省農業科學院農業生物資源研究所