專利名稱：一種團青霉的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種絲狀真菌微生物。
三七系中國著名的傳統中藥材，民間具有活血化瘀、消腫止痛、滋補強壯等功效，是治療跌打損傷的要藥。現代醫藥、臨床證實了三七對治療人心血管系統、血液及造血系統、中樞神經系統、腦缺血、肝損傷、抗炎癥、抗腫瘤、老年病、代謝等方面的疾病，都有很好的作用。三七含有的達瑪烷型四環三帖成分不少于20個，主要屬于人參二醇或原人參三醇及其衍生物。國內外至今未發現三七含有人參皂GF1化合物。
本發明的目的是提供一種能夠使三七藥物成分類型發生變化的三七發酵微生物——團青霉。
本發明所述的團青霉命名為團青霉(Penicillium commune)，系由云南中甸土壤中采集，在實驗室分離培養獲得，該菌株已在國家知識產權局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2001年7月27日，保藏登記號為CCTCC NOM201029。
本發明所述的團青霉的培養條件一、PDA培養基28℃培養5天，菌落直徑31mm，7天48mm，11天55mm。菌落緊密細絨狀淺灰綠色，邊緣整齊，中間稍隆起淺肉紅色，具放射狀花紋，分泌棕色水珠，背面黃棕色；二、麥芽法培養基28℃培養4天，菌落直徑31mm，7天45mm，11天70mm。菌落絨狀，邊緣整齊，淺灰綠色至白色，具放射狀花紋；背面棕黃色。
三、察貝克培養基28℃培養4天，菌落直徑21mm，7天37mm，11天45mm。菌落緊密絨粉狀，黃綠色，邊緣整齊，有同心環及不規則溝紋，背面乳黃色。
形態特征一、無性世代，菌絲有隔無色，分生孢子梗從菌絲垂直生出，小梗瓶狀，項端細長，輪狀分枝或生于短側枝上或直接從菌絲生出4.0～5.6×1.6！2.4微米，分生孢子串生、圓形粗糙2.4～3.2微米。
二、有性世代，未發現。
本發明所述的三七微生物發酵，其工藝步驟為
菌種→一級種子培養→二級種子培養→發酵培養→烘干→三七發酵物→提取→總皂甙。
在此步驟中，發酵原料為有數或無數頭三七中藥材，其發酵條件參數如下1.發酵方式固體發酵；2.種子培養一級種子培養采用馬鈴薯葡萄糖固體培養基(固體PDA)。二級種子培養為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(液體PDA)；馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升煮沸30分鐘，過濾棄馬鈴薯，濾液水補足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然；3.發酵培養發酵的培養基為80～100目三七粉50％，新鮮黃豆渣50％，水份65％，PH自然；4.培養時間菌種活化培養48小時，一級種子靜止培養時間72小時，二級種子搖床培養時間72，發酵培養時間12天；5.培養溫度一級種子培養溫度28℃±1℃，二級種子搖床培養溫度28℃±2℃，發酵培養溫度為28℃±2℃；6.烘干三七發酵完畢，發酵物置60℃下烘干，供提取分離皂甙元用。
本發明所述的團青霉經PCR技術，DNA測序儀分析，該菌分子生物學特征為18SRNA全系列由501個堿基組成。
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本發明所述的團青霉，通過該菌生命代謝活動轉化中藥材三七總皂甙藥用成分，通過微生物發酵手段，有僅能使三七原藥物有效成分類型發生質的改變，而且還能不同程度地轉化三七總皂甙組分數量。本發明所述的團青霉，其所述的菌株發酵三七中藥材12天后，三七發酵物所含藥物成分各類發生變化。提取的總皂甙中，除可分離得到覺皂甙元，如三七原人參二醇皂甙nR1、Rd、Rg3、Rh2和原人參三醇型皂甙Re、Rg1、Rg2、Rh1等組分之外。最顯著的特征是通過發酵轉化生成原三七沒有的人參皂甙GF1新化合物，其含量不少于總甙的18％。本發明是三七的微生物發酵，以中藥材三七為原料，采用固體發酵方法，能使原三七藥物成分類型發生變化，轉化新化合物人參皂甙GF1。同時在原基礎上，能使三七原人參二醇型皂甙Rd含量提高30％以上；nR1含量提高10％左右；Rb1和Rc組分含量消失或降低；使人參三醇型皂甙Rh1組分含量增加15％的優良菌株YM3513。該菌株是發酵轉化三七皂甙，篩選抗人類心血管疾病或抗腫瘤新藥成分的微生物菌種。
本發明所述的團青霉已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學，分類命名Penicilium sp.YM3513。


圖1為本發明所述的團青霉菌株DNA測序圖譜。
下面結合實施例對本發明作進一步描述，但不限于實施例。
取YM3513團青霉種，在無菌條件下，用接種針挑取少許菌種，轉接于已滅菌的固體PDA培養基試管中，置培養箱內28℃±1℃活化培養48小時的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的一級種子固定PDA培養基中，在28℃±1℃下培養72小時，即為YM3513一級種子。
采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養基100毫升，15磅滅菌30分鐘備用，取YM3513一級種子，在無菌條件下，接種于裝有100毫升液體PDA培養基的100毫升玻璃三角瓶中，一級種子接種量為每支斜面接三個三角瓶，置于28℃±1℃搖床培養72小時后，作為三七發酵二級種子用。
根據發酵規模大小，發酵料按重量比率，稱取50％三七粉(80～100目)，加入50％的新鮮黃豆渣，充分拌勻，發酵料水分不低于65％。三七發酵料配制好后，裝入500毫升罐頭瓶中，牛皮紙封口，置滅菌鍋內15磅滅菌60分鐘后，取出待冷卻至30℃，接入液體二級種子，二級種子接用量為5％(v/w)。搖勻后放置28℃±2℃下，靜止發酵12天。在發酵期間，注意發酵室保溫不低于80％相對濕度，第3天分另進行搖瓶一次，每三天倒瓶一次，檢查有無染菌現象。
發酵完畢，分別掏出發酵物，裝入已滅菌紙袋內，置60℃下烘干，便得到提取人參皂甙GF1化合物，以及三七皂甙組分含量發生變化的三七發酵物。GF1化學結構式為
權利要求
1.一種團青霉，其特征在于命名為團青霉(Penicillium commune)，其保藏登記號為CCTCC NOM201029。
2.根據權利要求1所述的團青霉，其特征在于培養條件為一、PDA培養基28℃培養5天，菌落直徑31mm，7天48mm，11天55mm。菌落緊密細絨狀淺灰綠色，邊緣整齊，中間稍隆起淺肉紅色，具放射狀花紋，分泌棕色水珠，背面黃棕色；二、麥芽法培養基28℃培養4天，菌落直徑31mm，7天45mm，11天70mm。菌落絨狀，邊緣整齊，淺灰綠色至白色，具放射狀花紋；背面棕黃色；三、察貝克培養基28℃培養4天，菌落直徑21mm，7天37mm，11天45mm。菌落緊密絨粉狀，黃綠色，邊緣整齊，有同心環及不規則溝紋，背面乳黃色。
3.根據權利要求1所述的團青霉，其特征在于其形態特征為一、無性世代，菌絲有隔無色，分生孢子梗從菌絲垂直生出，小梗瓶狀，項端細長，輪狀分枝或生于短側枝上或直接從菌絲生出4.0～5.6×1.6！2.4微米，分生孢子串生、圓形粗糙2.4～3.2微米；二、有性世代，未發現。
4.根據權利要求1所述的團青霉，其特征在于經PCR技術，DNA測序儀分析，該菌分子生物學特征為18SRNA全系列由501個堿基組成1 TAAAGATTAA GCCATGCATG TCTAAGTATA AGCACTTTAT ACTGTGAAAC51 TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA101 CATGGATACC TGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC151 TTCAGGAAGG GGTGTATTTA TTAGATAAAA AACCAACGCC CTTCGGGGCT201 CCTTGGTGAA TCATAATAAC TTAACGAAATC GCATGGCCTT GCGCCGGCGA251 TGGTTCATTC AAATTTCTGC CCTATCAACT TTCGATTGGTA GGATAGTGGC301 CTACCATGGT GGCAACGGGT AACGGGGAAT TAGGGTTCGA TTCCGGGAGAG351 GGAGCCTGAG AAACGGCTAC CACATCCAAG GAAGGCAGCA GGCGCGCAAA401 TTACCCAATC CCGATACGGG GAGGTAGTGA CAATAAATAC TGATACGGGG451 CTCTTTTGGG TCTCGTAATT GGAATGAGAA CAATTTAAAT CCCTTAACGA501 GGAACAATTG GAGGGCAAGT CTGGTGCCAG
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種絲狀真菌微生物，一種團青霉，其特征在于命名為團青霉(Penicillium commune)，其保藏登記號為CCTCCNOM201029，本發明所述的團青霉，通過該菌生命代謝活動轉化中藥材三七總皂甙藥用成分，通過微生物發酵手段，有僅能使三七原藥物有效成分類型發生質的改變，而且還能不同程度地轉化三七總皂甙組分數量。
文檔編號C12N15/31GK1408846SQ01141480
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月27日 優先權日2001年9月27日
發明者陳有為, 李治瀅, 楊麗源, 李紹蘭, 周斌 申請人:云南省微生物研究所