專利名稱：淡紫擬青霉的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種淡紫擬青霉的培養方法。
背景技術：
淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus (Thom) samson 1974)是一種典型的土壤 及多種植物根系的習居菌，被認為是最有前途的防治有害線蟲的天敵真菌之一。國際馬 鈴薯中心昆蟲系Jatala博士 1979年首次報道，淡紫擬青霉能夠有效防治南方根結線蟲 (Meloidogyne incognita)禾口白色球抱囊線蟲(Heterodera schachii),對南方牛艮結線蟲的 卵寄生率高達60% -70%。淡紫擬青霉菌極少在生產上推廣應用，主要原因是缺乏廉價培養基和相應的培養 技術。目前，國內外對淡紫擬青霉仍然處于研究階段，主要目標是篩選穩定高效的生產菌 株、解決菌劑培養中的高成本低產率的技術瓶頸、研制穩定高效的實用劑型。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種用于培養淡紫擬青霉的固體培養基。本發明所提供的固體培養基，由麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫 鉀、硫酸錳和水組成。上述固體培養基中，所述麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫 酸錳和水的配比為如下1)或2)或3)或4)所示1)麩皮(20kg_35kg)玉米(6Okg-I5Okg)甘蔗渣(3Okg-6Okg)椰糠 (10kg-40kg)蔗糖(15g-20g)硫酸銨(15g-20g)磷酸二氫鉀(8g_15g)硫酸錳 (0. 7g-2g)水(20L-50L)；2)麩皮(2Okg-35Iig)玉米(6Okg-IOOkg)甘蔗渣(3Okg-5Okg)椰糠 (10kg-30kg)蔗糖(15g-20g)硫酸銨(15g-18g)磷酸二氫鉀(8g_10g)硫酸錳 (0. 7g-2g)水(20L-40L)；3)麩皮(20kg_35kg)玉米(6Okg-7Okg)甘蔗渣(3Okg-5Okg)椰糠 (10kg-15kg)蔗糖(15g-16. 5g)硫酸銨(15g-18g)磷酸二氫鉀(8g_10g)硫酸錳 (0. 7g-lg)水(20L-35L)；4)麩皮30kg 玉米IOOkg 甘蔗渣60kg 椰糠30kg 蔗糖20g 硫酸銨20g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳2g 水50L ；或，麩皮35kg 玉米150kg 甘蔗渣40kg 椰糠40kg 蔗糖20g 硫酸銨20g 磷酸二氫鉀15g 硫酸錳Ig 水40L ；或，麩皮30kg 玉米IOOkg 甘蔗渣60kg 椰糠30kg 蔗糖15g 硫酸銨15g 磷酸二氫鉀8g 硫酸錳0. 7g 水50L ；或，麩皮30kg 玉米IOOkg 甘蔗渣60kg 椰糠30kg 蔗糖20g 硫酸銨18g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳Ig 水50L ；
或，麩皮35kg 玉米150kg 甘蔗渣40kg 椰糠40kg 蔗糖20g 硫酸銨20g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳Ig 水40L ；或，麩皮20kg 玉米60kg 甘蔗渣30kg 椰糠IOkg 蔗糖15g 硫酸銨15g 磷酸二氫鉀IOg 硫酸錳Ig 水20L ；或，麩皮30kg 玉米70kg 甘蔗渣50kg 椰糠15kg 蔗糖16. 5g 硫酸銨 16. 5g 磷酸二氫鉀8. 5g 硫酸錳0. 7g 水35L。上述固體培養基中，所述麩皮為小麥的麩皮，所述玉米為玉米粉。本發明的另一個目的是提供一種培養淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法。本發明所提供的培養淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法，包括如下 步驟將淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)接種于上述任一所述固體培養基，固體培 養，將容器內的所有物質記作固體培養物質。 上述方法中，所述固體培養的條件為所述固體培養包括如下步驟在濕度為 30% -70%和溫度為24°C _26°C的條件下，培養2_3天；將所有固體培養物質搗碎，再在濕 度為50% -70%、溫度為24°C _26°C的條件下，培養3_4天；上述方法中，所述固體培養中所用的容器為培養架；所述培養架為腔內設有若干 尼龍紗網隔層的柱體；所述固體培養物質位于所述尼龍紗網隔層上。上述方法中，所述固體培養在無菌條件下進行。上述方法中，在所述固體培養前，包括如下種子培養的步驟將淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)接種于種子培養基中，進行種子培養，將種子培養產物再進行 所述固體培養；上述方法中，所述種子培養基由殼聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2PO4, MnSO4、醋 酸和水組成；所述殼聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2PO4, MnSO4、醋酸和水的配比為殼聚糖 20g 蔗糖 15g 蛋白胨 IOg 豆餅粉 15g KH2PO4 0. 5g MnSO4 0. 05g 醋酸 0. 5ml 水IL0上述方法中，所述種子培養的條件27°C _29°C搖床振蕩培養48_72小時，接種濃 度為IO5個孢子/ml。上述方法中，將種子培養產物再進行所述固體培養中，接種量為20% -30% (體積 百分含量)，具體為20%、25%或30%。上述方法中，所述淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)為淡紫擬青霉 (Paecilomyceslilacinus)E7，保藏編號為 ACCC 32494。與現有技術相比，本發明利用液體培養快速生長的大量菌絲體，轉接到固體營養 基質上產生氣生分生孢子，從而縮短菌絲生長周期，提高產率，避免前期污染；其次，本發明 框架式培養室培養，生產工藝簡單，顯著減少了培養過程中的污染機率，縮短了發酵時間， 而且不需要復雜設備，對濕度的要求降低；第三，原料主要為農副產品麩皮、玉米粉、甘蔗 渣、椰糠，來源廣泛、充足，成本低廉，易調控，成功率高；第四，在培養原料中添加部分甘蔗 渣和椰糠，不僅可以使農業廢棄物得到有效利用，而且明顯改善了培養基的粘度、空隙率和 疏松度，培養過程中不用額外通氣。因此，本發明不僅對農業廢棄物的利用、促進農業可持 續發展、保護生態環境方面意義重大，而且有著切實的經濟效益和廣闊的應用前景。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所使用的菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E7，分離自 線蟲土壤的淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)，購自于中國農業微生物菌種保藏管理 中心(ACCC)，保藏編號為ACCC 32494。實施例1、1.斜面菌種固體斜面培養基馬鈴薯200g、蔗糖20g、蛋白胨10g、KH2PO4 0. 5g、MnSO4 0. 05g、 瓊脂18g、水1L。
將淡紫擬青霉菌接種于試管斜面培養基，在28°C傳代培養、活化，至斜面長滿淡紫 色孢子。2.種子培養種子培養基組成殼聚糖20g、蔗糖15g、蛋白胨10g、豆餅粉15g、KH2PO4 0. 5g、 MnSO4 0.05g、醋酸0.5ml，水1L。殼聚糖購自浙江金殼生物化學有限公司，產品目錄號 為K071113289，脫乙酰度為95% ；蛋白胨購自海南青鳥生物科技有限公司，產品目錄號為 050170;豆餅粉購自農貿市場。每個250ml三角瓶中放入60ml種子培養基，121°C蒸汽滅菌20分鐘。從固體斜面中挑出一小塊菌苔，用種子培養基配置分生孢子懸浮液，再將分生孢 子懸浮液接入250ml三角瓶，初始濃度為IO5個/ml，一只斜面可接6_8個瓶子；在27°C搖 床振蕩培養48小時，至長成淡紫色粘稠菌絲體。3、固體培養培養架腔內具有尼龍紗網隔層的四立柱架子，長3. 5m、寬0. 6m、高2. 5m，用尼龍 紗網隔成6層結構，層間距30cm，四立柱材質是碳鋼噴塑。a.固體培養基小麥麩皮20kg，玉米粉60kg、甘蔗渣30kg、椰糠10kg、蔗糖15g、硫 酸銨15g、磷酸二氫鉀10g、硫酸錳lg、自來水20L。配制方法先用水將硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳溶解，攪拌均勻，pH自然，121°C 高壓蒸汽滅菌60分鐘。再將其與其余物質混勻。b.接種按20% (體積百分比)接種量，將種子培養的產物倒入固體培養基中，攪 拌均勻，置于培養架的尼龍紗網上，一起置于發酵室內(發酵室預先消毒)；c.培養方法在溫度24°C、發酵室內濕度30% (體積百分含量)和密閉條件下培 養2天，至長滿淡紫色菌絲；然后將培養架上的所有物質搗碎，在溫度24°C、培養室內濕度 50%的條件下繼續培養3天。從培養室中將所有物質拿出，放在陰涼通風處晾干或空調抽濕，即得到粗品。4、血球計數板計數1. 31 X IO10個孢子/克粗品；平板計數1. 31 X IO10個孢子/
克粗品。上述步驟1-3均在無菌條件下操作。實施例2
1、斜面菌種固體斜面培養基與實施例1中所述一致。將淡紫擬青霉菌接種于試管斜面培養基，在28°C傳代培養、活化，至斜面長滿淡紫 色孢子。2、種子培養種子培養基組成與實施例1中所述一致。每個IOOOml三角瓶中放入450ml培養基，121°C蒸汽滅菌20分鐘；從固體斜面中 挑出一小塊菌苔，用種子培養基配置分生孢子懸浮液，再將分生孢子懸浮液接入250ml三 角瓶，初始濃度為IO5個/ml，一只斜面可接6-8個瓶子；在28°C搖床振蕩培養64小時，至 長成白色粘稠菌絲體。3、固體培養
培養室與實施例1中所述一致。a.固體培養基小麥麩皮30kg，玉粉70kg、甘蔗渣50kg、椰糠15kg、蔗糖16. 5g、硫 酸銨16. 5g、磷酸二氫鉀8. 5g、硫酸錳0. 7g、自來水為35L。配制方法與實施例1中所述一致。b.接種按25% (體積百分比)接種量，將種子培養的產物倒入固體培養基中，攪 拌均勻，裝入發酵室的培養架(發酵室預先消毒)；c.培養方法在溫度25°C、發酵室內濕度50%和厭氧密閉條件下培養3天，至長 滿淡紫色菌絲；然后將培養架上的所有物質輕輕搗碎，在溫度25°C、發酵室內濕度60%的 條件下繼續培養4天。從培養室中將所有物質拿出，放在陰涼通風處晾干或空調抽濕，即得到粗品。4、血球計數板計數3. 24X IO10個孢子/克粗品；平板計數3. 21 X IO10個孢子/
克粗品。上述步驟1-3均在無菌條件下操作。實施例3 1、斜面菌種固體斜面培養基與實施例1中所述一致。將淡紫擬青霉菌接種于試管斜面培養基，在28°C傳代培養、活化，至斜面長滿淡紫 色孢子。2、種子培養種子培養基組成與實施例1中所述一致。每個IOOOml三角瓶中放入450ml培養基，121°C蒸汽滅菌20分鐘；從固體斜面中挑出一小塊菌苔，用種子培養基配置分生孢子懸浮液，再將分生孢 子懸浮液接入250ml三角瓶，初始濃度為IO5個/ml，一只斜面可接6_8個瓶子；在29°C搖 床振蕩培養72小時，至長成白色粘稠菌絲體。3、固體培養培養室與實施例1中所述一致。a.固體培養基如表1中3所示。配制方法與實施例1中所述一致。b.接種按30% (體積百分比)(表1中3所示)接種量，將種子培養的產物倒入固體培養基中，攪拌均勻，裝入發酵室的培養架(發酵室預先消毒)；c.培養方法在溫度26°C、發酵室內濕度70%和厭氧密閉條件下培養2天，至長 滿淡紫色菌絲；然后將培養架上的所有物質輕輕搗碎，在溫度26°C、發酵室內濕度70%的 條件下繼續培養4天。從培養室中將所有物質拿出，放在陰涼通風處晾干或空調抽濕，即得到粗品。4、血球計數板計數5. 21 X IO10個孢子/克粗品；平板計數5. 21 X IO10個孢子/
克粗品。上述步驟1-3均在無菌條件下操作。表 1 發酵周期由同類技術的12-14天縮短到6-7天，發酵水平多100億/克粗品。不 僅明顯縮短了發酵周期，而且不需要復雜設備，對濕度的要求降低。
權利要求
一種固體培養基，由麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳和水組成。
2.根據權利要求1所述的固體培養基，其特征在于所述麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗 糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳和水的配比為如下1)或2)或3)或4)所示1)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=(20kg-35kg) (60k纊 150kg) (30k^60kg) (10k^-40kg) (15纊20g) (15^-20g) (8^15g) (0.7纊 2g) (20L-50L)；2)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=(20kg-35kg) (60k纊 100kg) (30kg-50kg) (10k纊30kg) (15纊20g) (15g-18g) (8g-10g) (0.7g-2g) (20L-40L)；3)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=(20kg-35kg) (60k纊70kg) (30kg-50kg) (10k纊 15kg) (15g-16.5g) (15纊 18g) (8纊IOg) (0.7g -Ig) (20L-35L)；4)麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg IOOkg 60kg 30kg 20g 20g IOg 2g 50L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=35kg 150kg 40kg 40kg 20g 20g 15g Ig 40L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg IOOkg 60kg 30kg 15g 15g 8g 0. 7g 50L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg IOOkg 60kg 30kg 20g 18g IOg Ig 50L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=35kg 150kg 40kg 40kg 20g 20g IOg Ig 40L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=20kg 60kg 30kg IOkg 15g 15g IOg Ig 20L ；或，麩皮玉米甘蔗渣椰糠蔗糖硫酸銨磷酸二氫鉀硫酸錳水=30kg 70kg 50kg 15kg 16. 5g 16. 5g ； 8. 5g ； 0. 7g 35L0
3.根據權利要求1或2所述的固體培養基，其特征在于所述麩皮為小麥的麩皮，所述 玉米為玉米粉。
4.一種培養淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法，包括如下步驟將淡紫擬 青霉(Paecilomyces lilacinus)接種于權利要求1-3中任一所述固體培養基，固體培養， 將容器內的所有物質記作固體培養物質。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述固體培養包括如下步驟在濕度為 30% -70%和溫度為24°C _26°C的條件下，培養2_3天；將所述固體培養物質搗碎，再在濕 度為50% -70%和溫度為24°C _26°C的條件下，培養3_4天；所述濕度具體為30%、50%、 60%或70% ；所述溫度具體為24°C、25°C或26°C。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述固體培養中所用的容器為培養 架；所述培養架為腔內設有若干尼龍紗網隔層的柱體；所述固體培養物質位于所述尼龍紗 網隔層上；所述固體培養在無菌條件下進行。
7.根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述固體培養 前，包括如下種子培養的步驟將淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)接種于種子培養 基中，進行種子培養，將種子培養產物再進行所述固體培養；所述種子培養基由殼聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2P04、MnS04、醋酸和水組成；所述殼 聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆餅粉、KH2P04、MnS04、醋酸和水的配比為:20g 15g IOg 15g 0. 5g 0.05g 0. 5ml IL0
8.根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述種子培養的條件 270C -29°C振蕩培養48-72小時，接種濃度為IO5個孢子/ml。
9.根據權利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述將種子培養產物再進行所 述固體培養中，接種量為20% -30% (體積百分含量)，具體為20%、25%或30%。
10.根據權利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)E7，保藏編號為 ACCC32494。
全文摘要
本發明公開了一種淡紫擬青霉的培養方法及其專用培養基。該培養基由麩皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸錳和水組成。本發明方法生長周期短，產率高，生產工藝簡單，不需要復雜設備。因此，本發明不僅對農業廢棄物的利用、促進農業可持續發展、保護生態環境方面意義重大，而且有著切實的經濟效益和廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/79GK101845398SQ201010209110
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月17日 優先權日2010年6月17日
發明者任文彬, 楊臘英, 梁昌聰, 汪軍, 王國芬, 趙培靜, 鄧國平, 黃俊生 申請人:中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所