試劑盒及其應用
【專利摘要】本發明提供了一種檢測試劑盒及其應用，屬于生物檢測領域。所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1、2和有效量的犬副流感病毒單克隆抗體3、4，以及對抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑；單克隆抗體1、2以及單克隆抗體3、4分別能與犬瘟熱病毒、犬副流感病毒同時發生抗原抗體反應。本發明的試劑盒能有效檢測上述兩種病毒及其抗原，當使用酶反應檢測時，其敏感性與PCR相當，當使用膠體金進行檢測時，其敏感性優于商業上獲得的同類產品。本發明還提供了該試劑盒在非診斷目的方面的應用。CCTCC No: C2025 CCTCC No: C2025
【專利說明】
試劑盒及其應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物檢測領域，涉及試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 犬痕熱病毒(Canine distemper virus，Q)V)屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，是單鏈 負鏈不分節段的RNA病毒，可引起犬和其他肉食動物如狐、狼、貂、綜熊等發生犬瘟熱(俗稱 狗瘟或麻疹）。犬瘟熱于1905年首次報道，是世界范圍內廣泛發生的一種犬的急性、高接觸 性傳染病，易繼發細菌和其他病毒的混合感染或繼發感染，發病率高達80%，康復后易出現 麻痹、抽搐、癲癇發作等后遺癥。
[0003] 犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus，CPIV)又稱副流感病毒5型 (Parainfluenza virus 5)，屬于副粘液病毒亞科副粘病毒屬，是單股負鏈RNA病毒。該病毒 呈世界性分布，可感染各種年齡、性別的犬科動物，特別是幼齡犬，主要通過病犬的眼分泌 物、唾液、呼吸道分泌物等散播，經呼吸道途徑感染，通過損壞犬的上呼吸道組織，引起干 咳、尖咳、鼻塞等癥狀，嚴重者會引起犬的支氣管炎和支氣管肺炎，并給其它病原體的感染 創造條件。
[0004] 犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)是腺病毒科哺乳動物腺病毒屬中致病性最強 的一種病毒，危害了我國的養犬業和皮毛動物養殖業，每年都會造成巨大的經濟損失。犬腺 病毒有2個血清型，其中，犬腺病毒I型(CAV-1)又稱犬傳染性肝炎病毒(infectious canine hepatitis virus，ICHV)，既可引起犬傳染性肝炎（以肝小葉中心壞死，肝實質細胞和皮質 細胞核內出現包涵體和出血時間長為特征的急性敗血性傳染病），又可引起狐貍腦炎，臨床 癥狀以嘔吐、腹痛、腹瀉、體溫升高、突然死亡為特征，是重要的傳染病;犬腺病毒n型(CAV-2)引起犬傳染性喉氣管炎及肺炎癥狀，臨床特征表現為持續性高熱、咳嗽、漿液性至粘液性 鼻漏、扁桃體炎、喉氣管炎和肺炎等呼吸道癥狀，從臨床發病情況統計，該病多見于半年以 下的幼犬，可造成全窩或全群幼犬咳嗽。
[0005] 犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒n型主要引發犬的呼吸 道感染，所引發的疾病常常混合感染和繼發感染。隨著人們所養的犬越來越多，這幾種病毒 所造成的經濟損失越嚴重。因此，亟需研發能實現犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒的 檢測方法。
[0006] 目前，檢測這幾種病毒的方法包括病毒分離鑒定和血清檢查，但操作過程繁瑣、耗 時過長;PCR/RT-PCR檢測，但需要專門的儀器和專業的操作人員，這些方法均不適合基層或 現場快速檢測。現有技術也有各自單一的膠體金檢測試紙條，但價格昂貴或檢測靈敏度低。 因而，亟需研制一種能簡單、快速、準確、同時檢測這幾種病毒的裝置及檢測方法。

【發明內容】

[0007] 為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種檢測試劑盒，該試劑盒可簡單、快 速、靈敏度高并同時檢測出至少犬瘟熱病毒、犬副流感病毒這兩種病毒。
[0008] 本發明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1、2， 有效量的抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4,還包括對抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑，其 中，所述單克隆抗體1為抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，所述單克隆抗體2為抗犬瘟熱病毒 單克隆抗體1G5;所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4分別選自4F3B6、4C9D6、5B4C9、4G7F4 中的兩種，且所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4能與犬副流感病毒同時發生抗原抗體反 應。
[0009] 本發明還涉及所述試劑盒檢測樣品中病毒的方法，所述檢測方法包括：（1)將檢測 樣品與所述單克隆抗體1、2,所述單克隆抗體3和4進行接觸，（2)檢測所述單克隆抗體1、2， 所述單克隆抗體3和4與樣品中病毒的反應;其中，所述檢測方法步驟(1)中的所述單克隆抗 體1、所述單克隆抗體3固定在固相上，所述固相優選為微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖 維素膜中的任一種;其中，所述方法步驟(2)中所述反應可通過酶顯色、膠體金、熒光、化學 發光中的任一種方法進行測定。
[0010] 本發明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒檢測中 的應用，其應用過程簡單、快速并且靈敏度高。
【附圖說明】
[0011] 圖1為單克隆抗體6E11、1G5的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定圖，其中泳道M為蛋白 Marker;泳道1為單克隆抗體1G5,包括上端的重鏈和下端的輕鏈;泳道2為單克隆抗體6E11， 包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
[0012] 圖2為酶免疫層析檢測試紙條的側向示意圖，圖2(1)為固定了兩種單克隆抗體酶 免疫層析檢測試紙條側向示意圖，圖2(2)為固定了三種單克隆抗體酶免疫層析檢測試紙條 側向示意圖，圖2(3)為固定了四種單克隆抗體酶免疫層析檢測試紙條側向示意圖，圖中：硝 酸纖維素膜1、酶標墊2、底物墊3、吸水墊4、展開液墊5、檢測線6、質控線7、底物緩沖液槽8、 底物緩沖液9、支撐物10、檢測樣品11。
【具體實施方式】
[0013]以下，對本發明的實施方式進行說明。
[0014] 本發明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1、2 和有效量的抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4，以及對抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑;其 中，所述單克隆抗體1為抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，所述單克隆抗體2為抗犬瘟熱病毒 單克隆抗體1G5;以及所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4分別選自4F3B6、4C9D6、5B4C9、 4G7F4中的兩種，且所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4能與犬副流感病毒同時發生抗原抗 體反應。
[0015] 術語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個 體都相同，除了可能存在少量可能的自發突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質不 是離散抗體的混合物。優選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、犬源化抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結合結構域的任何多肽。抗體為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因 子，因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、犬源化抗體以及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是合成產生的。抗體 的實例是免疫球蛋白亞型（如186，18￡，1811，18〇和184)及其亞型亞類;也可以是包含抗原結 合結構域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1 ;和雙鏈抗體((113130(1168)。融合至另一多肽的、包 含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產 生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區或互補性決定區（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區或恒定區加框架區， 參見EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。還可以對雜交瘤細胞或產生抗體的其它細 胞進行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產生抗體的結合特異性。用于本發 明的"單克隆抗體"也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發明鼠源化抗體的DNA序列可用本 領域技術人員熟知的常規手段，如根據本發明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增 得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體 中。最后，在適合本發明抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然后本領域技術人 員應用熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的單克隆抗體。抗體包含通過二硫橋連接 在一起的多肽鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構成抗體的所有主要結構類別 (同型物）。重鏈和輕鏈都進一步可分為稱作可變區和恒定區的一些亞區。重鏈包括單個的 可變區和三個不同的恒定區，輕鏈則包括單個可變區（不同于重鏈的可變區）和單個恒定區 (不同于重鏈的恒定區）。重鏈和輕鏈的可變區負責抗體的結合特異性。
[0016]術語"重鏈可變區"是指一種多肽，其長度為110至125個氨基酸，其氨基酸順序相 應于本發明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，術語"輕鏈可變 區"是指一種多肽，其長度為95至115個氨基酸，其氨基酸順序相應于本發明單克隆抗體從 輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。本領域普通技術人員顯然知曉，在本發明所具體 公開的單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區氨基酸序列基礎上，可以通過常規基因工程 和蛋白質工程方法進行一個或多個氨基酸的添加、刪除、替換等修飾，獲得其活性片段或保 守性變異體，而仍能夠保持與相應病毒特異性結合。本發明中的單克隆抗體還包括其活性 片段或保守性變異體。
[0017]術語"有效量"當理解為"診斷有效量"時是指能夠利用本發明所述單克隆抗體有 效檢測樣品中是否存在犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型或犬腺病毒n型的量。根 據已知的免疫化學檢測方法，本領域技術人員能夠知曉，所用單克隆抗體的量隨采用的具 體免疫檢測方法的不同而不同，根據公知文獻的教導，本領域技術人員知曉如何選擇適當 的本發明所述單克隆抗體用量，以用于診斷樣品中是否存在犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬 腺病毒I型或犬腺病毒n型。本領域技術人員知曉，適當地該試劑盒中還應當包括適當的載 體，緩沖液/劑，和用于檢測所產生信號的試劑及使用說明書。本發明所述試劑盒有效檢測 樣品中是否存在犬痕熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型或犬腺病毒n型的量時所米用的 檢測方法可以使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫檢測、化學發光免疫檢測、放射免疫 檢測、熒光免疫檢測、免疫色譜法及類似檢測方法。
[0018]本發明的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11是由小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株分泌產 生，小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株由犬瘟熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠后，取其脾細胞， 與Sp2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選制得；小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 6E11)保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號 為CCTCC No:C2015202,保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏時間為2015年11月25日。
[0019] 本發明的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5是由小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株分泌產生， 小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株由犬瘟熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠后，取其脾細胞，與 Sp2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選制得;小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0, strain 1G5)保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No :C2015201，保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏時間為2015年11月25日。
[0020] 單克隆抗體4?386、扣906、58扣9、467?4公開于犬副流感病毒的分離及單克隆抗體 的制備.岑皓.揚州大學碩士學位論文，2007。
[0021] 作為本發明的一種實施方式，所述單克隆抗體3為抗犬副流感病毒單克隆抗體 4F3B6、所述單克隆抗體4為抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8。
[0022] 作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒進一步含有有效量的抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6,和/或有效量的抗犬腺病毒II型單克隆抗體7、8,其中，所述抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6分別選自0849、63、02、112、2￡10-112中的兩種，且所述抗犬腺病毒1型單克隆抗 體5、6能與犬腺病毒I型同時發生抗原抗體反應;所述抗犬腺病毒II型單克隆抗體7為Santa 公司的anti-CAV-2-Santa、單克隆抗體8為4H1-A7。
[0023] 單克隆抗體C8、E9公開于抗犬I型腺病毒單克隆抗體的制備及生物學特性鑒定.李 曉葉，劉穎，藍田豐等.中國農學通報，2011，27(11): 31-34;單克隆抗體G3、C2、H2公開于抗 犬I型腺病毒單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立.李曉葉.吉林大學碩士學位論文， 2011;單克隆抗體2E10-H2購自Veterinary Medical Research&Development Inc.。
[0024] 單克隆抗體4H1-A7購自Veterinary Medical Research&Development Inc.，單克 隆抗體 anti-CAV-2-Santa 購自 Santa公司。
[0025] 作為本發明的一種實施方式，所述單克隆抗體5為抗犬腺病毒I型單克隆抗體G3， 所述單克隆抗體6為抗犬腺病毒I型單克隆抗體E9。作為本發明的一種實施方式，所述單克 隆抗體1、3、5、7的含量各自分別為25-1000μg/ml，所述單克隆抗體2、4、6、8的含量各自分別 為 50-2000iig/ml。
[0026] 作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒進一步包括洗滌液、稀釋液、底物顯色 液、終止液、陰性對照、陽性對照。
[0027] 作為本發明的一種實施方式，所述單克隆抗體1、單克隆抗體3固定于固相上，所述 固相包括微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜。作為本發明的一種實施方式，所述單 克隆抗體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7固定于固相上，所述固相包括微 滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜。
[0028] 作為本發明的一種實施方式，所述對抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑包括酶顯 色檢測試劑、膠體金檢測試劑、熒光檢測試劑、化學發光檢測試劑或同位素檢測試劑。
[0029] 作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒包括膠體金檢測試紙條，所述膠體金檢 測試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所 述底板上依次有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標墊上含有膠體金 標記的所述單克隆抗體2、膠體金標記的所述單克隆抗體4,所述硝酸纖維素膜上有兩條檢 測線和一條質控線，所述檢測線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3,所述質控線上有羊 抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0030]作為本發明的一種優選實施方式，所述試劑盒還包括有效量的抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6和/或有效量的抗犬腺病毒II型單克隆抗體7、8,所述膠體金檢測試紙條包括 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次 有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標墊上是含有膠體金標記的所述 單克隆抗體2、膠體金標記的所述單克隆抗體4、膠體金標記的所述單克隆抗體6和/或膠體 金標記的單克隆抗體8,所述硝酸纖維素膜上有三條或四條檢測線和一條質控線，所述檢測 線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7,所述質控線上 有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0031]作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒包括緩沖液供應單元和酶免疫層析檢測 試紙條;所述緩沖液供應單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢測試紙條;所述酶免疫 層析檢測試紙條包括硝酸纖維素膜（1)，所述酶免疫層析檢測試紙條在縱向上依次包括底 物供應區、樣品供應區、檢測區；所述底物供應區包括底物墊（3)，其上吸附有干燥的酶底 物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，當所述緩沖液供應單元向所述酶免疫層析檢 測試紙條供給緩沖液，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距所述緩沖液 供應單元的遠端迀移;所述樣品供應區包括酶標墊(2)，其上吸附有酶標記的所述單克隆抗 體2、所述單克隆抗體4,所述酶底物能與所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4上標記的酶產 生顯色反應，所述酶標墊(2)與硝酸纖維素膜(1)接觸，所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4 溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距所述緩沖液供應單元的遠端迀移；以及所述檢 測區依次固定化有所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3;其中，所述緩沖液供應單元包括展 開液墊(5)、底物緩沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液(9)放置于底 物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下所述按鈕可將所述 展開液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測區包括檢測線(6)、質控線(7)，其中，所述質控線 (7)較檢測線(6)更遠離所述樣品供應區，在所述檢測線(6)分別固定化有所述單克隆抗體 1、所述單克隆抗體3,在所述質控線（7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶標 墊(2)上的所述酶標記的單克隆抗體2、單克隆抗體4分別對于固定在檢測線(6)的所述單克 隆抗體1、所述單克隆抗體3而言是過量的；所述硝酸纖維素膜（1)全段粘附在所述支撐物 (10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應單元，底物供應區，樣品供應區，檢測區以及吸水 墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應單元的最遠端；以及檢測樣品（11)加入的位置 為所述酶標墊(2)的位置。
[0032]作為本發明的一種優選實施方式，所述試劑盒還包括有效量的抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6和/或有效量的抗犬腺病毒II型單克隆抗體7、8;所述試劑盒包括緩沖液供應 單元和酶免疫層析檢測試紙條;所述緩沖液供應單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢 測試紙條;所述酶免疫層析檢測試紙條包括硝酸纖維素膜(1 )，所述酶免疫層析檢測試紙條 在縱向上依次包括底物供應區、樣品供應區、檢測區；所述底物供應區包括底物墊(3)，其上 吸附有干燥的酶底物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，當所述緩沖液供應單元向 所述酶免疫層析檢測試紙條供給緩沖液，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1) 上向距所述緩沖液供應單元的遠端迀移;所述樣品供應區包括酶標墊(2)，其上吸附有酶標 記的所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8,所述 酶底物能與所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8 上標記的酶產生顯色反應，所述酶標墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體2、所 述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜 (1)上向距所述緩沖液供應單元的遠端迀移；以及所述檢測區依次固定化有所述單克隆抗 體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7;其中，所述緩沖液供應單 元包括展開液墊(5)、底物緩沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液(9) 放置于底物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下所述按鈕 可將所述展開液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測區包括檢測線(6)、質控線（7)，其中，所 述質控線(7)較檢測線(6)更遠離所述樣品供應區，在所述檢測線(6)分別固定化有所述單 克隆抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7,在所述質控線(7) 固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶標墊(2)上的所述酶標記的單克隆抗體2、 單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8分別對于固定在檢測線(6)的所述 單克隆抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7而言是過量的； 所述硝酸纖維素膜（1)全段粘附在所述支撐物（10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應單 元，底物供應區，樣品供應區，檢測區以及吸水墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應 單元的最遠端；以及檢測樣品（11)加入的位置為所述酶標墊(2)的位置。
[0033] 作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒中的所述酶免疫層析檢測試紙條包括固 相的硝酸纖維素膜1、含有標記試劑的酶標墊2、底物墊3、吸水墊4、展開液墊5、檢測線6、質 控線7、底物緩沖液槽8、底物緩沖液9、支撐物10,其中2屬于樣品供應區，3屬于底物供應區， 5、8屬于緩沖液供應單元，6、7屬于檢測區。檢測樣品11加入的位置為酶標墊2的位置。所述 檢測試紙條固定在塑料外殼中，其上從左到右依次固定展開液墊5、底物墊3、酶標墊2、吸水 墊4。硝酸纖維素膜1粘附在支撐物10的全段;吸水墊4卡在硝酸纖維素膜1的頂端，且與硝酸 纖維素膜1有重疊;酶標墊2位于硝酸纖維素膜1的中段，上面干燥有酶標記的所述單克隆抗 體2、所述單克隆抗體4和/或所述單克隆抗體6;底物墊3卡在硝酸纖維素膜1的底端，其上有 干燥的酶底物。展開液墊5的上端覆蓋了底物墊3,且其下端位于底物緩沖液槽8的底端。底 物緩沖液槽8的上面覆蓋了一層鋁箱紙，以防止底物緩沖液9滲漏，其上有緩沖液按鈕，按下 緩沖液按鈕可刺破鋁箱紙，并將展開液墊5的下端浸入到底物緩沖液9中。檢測線6位于硝酸 纖維素膜1的中上端，其上固定化有所述單克隆抗體1。質控線7位于硝酸纖維素膜1的中上 端、檢測線6的上游，其上固定化有羊抗鼠二抗。
[0034] 術語"檢測樣品"包括但不限于動物或患者的眼鼻腔分泌物、動物細胞培養的完整 病毒或裂解病毒液等。
[0035] 本發明還涉及使用所述試劑盒檢測樣品中病毒的方法，所述方法包括：（1)將檢測 樣品與所述單克隆抗體1、2,所述單克隆抗體3和4,所述單克隆抗體5、6和/或所述單克隆抗 體7、8進行接觸，（2)檢測所述單克隆抗體1、2,所述單克隆抗體3和4,所述單克隆抗體5、6 和/或所述單克隆抗體7、8與樣品中病毒的反應;其中，所述方法步驟(1)中的所述單克隆抗 體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7附著在固相上，所述固相 優選為微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜中的任一種;其中，所述方法步驟(2)中 所述反應可通過酶顯色、膠體金、熒光、化學發光中的任一種方法進行測定。
[0036] 作為本發明的一種實施方式，所述檢測方法進一步包括:在所述步驟（1)前，將采 集的微生物拭子插入到樣品處理管中，使所述檢測樣品盡可能溶解在溶液中，將處理后的 檢測樣品滴加至檢測試紙條加樣孔中心。
[0037] 作為本發明的一種實施方式，所述檢測方法進一步包括:在所述步驟(2)后，10或 30分鐘后判定結果:若質控線顯色即試驗成立，檢測線顯色即可判為陽性，檢測線不顯色即 可判為陰性;若質控線未顯色即試驗不成立，無論檢測線是否顯色，均判定為無效結果，需 重測。
[0038] 本發明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒檢測中 的應用。
[0039] 本發明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺 病毒I型和/或犬腺病毒n型檢測中的應用。
[0040] 所述非診斷目的包括流行病學分析、對離體組織進行定性和定量檢測、表位鑒定 研究以及定性和定量鑒別檢驗含所述犬瘟熱病毒、犬副流感病毒的全病毒抗原的疫苗組合 物中的全病毒抗原，或定性和定量鑒別檢驗含犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/ 或犬腺病毒n型的全病毒抗原的疫苗組合物中的全病毒抗原。
[0041] 作為本發明的一種實施方式，本發明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2和 有效量的所述單克隆抗體3、4的試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒和犬副流感病毒檢 測中的應用。
[0042] 作為本發明的一種實施方式，本發明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體3、4和有效量的所述單克隆抗體5、6的試劑盒在用于非診斷目的的 犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒I型檢測中的應用。
[0043] 作為本發明的一種實施方式，本發明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體3、4和有效量的所述單克隆抗體7、8的試劑盒在用于非診斷目的的 犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒n型檢測中的應用。
[0044] 作為本發明的一種實施方式，本發明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體5、6和有效量的所述單克隆抗體7、8的試劑盒在用于非診斷目的的 犬痕熱病毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒n型檢測中的應用。
[0045] 作為本發明的一種實施方式，本發明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體3、4,有效量的所述單克隆抗體5、6,和有效量的所述單克隆抗體7、8 的試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒n型檢 測中的應用。
[0046] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員 應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0047]本實施例中所用的磷酸鹽緩沖液為pH值7.4的roS，其1L體積配方為:NaCl 8.0g、 KC1 0.2g、Na2HP〇4. 12H20 2.9g、KH2P〇4 0.24g，但該實施方式無論在任何情況下均不構成 對本發明的限定。
[0048]本實施例中以膠體金檢測試紙條中的檢測線從左到右依次固定單克隆抗體1、3為 膠體金檢測試紙條1，固定單克隆抗體1、3、5為膠體金檢測試紙條2,單克隆抗體1、3、5、7時 作為膠體金檢測試紙條3;以酶免疫層析檢測試紙條中的檢測線從左到右依次固定單克隆 抗體1、3為酶免疫層析檢測試紙條1，固定單克隆抗體1、3、5為酶免疫層析檢測試紙條2，固 定單克隆抗體1、3、5、7為酶免疫層析檢測試紙條3為例進行闡述，但該實施方式無論在任何 情況下均不構成對本發明的限定。
[0049] 本發明以下所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規方法;所述的生物材料，若 無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0050] 實施例1抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備、純化、鑒定及檢驗
[0051 ] 1.1抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備和純化
[0052]將犬痕熱病毒CVCC AV299株按照Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998,139-312) 文獻的操作方法制備小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株、小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株，并提交保 藏;使用這兩種小鼠骨髓雜交瘤細胞株進一步分別制得抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11、抗 犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5。并分別對單克隆抗體6E1U1G5按照陳丹等(陳丹，孫廣瑞，柳增 善.辛酸-硫酸銨聯合沉淀法在單克隆抗體純化中的應用.安徽農業科學，2007，35(26): 8105，8108)的辛酸-硫酸銨聯合沉淀法純化。
[0053] 1.2抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的鑒定
[0054] 1.2.1單克隆抗體類型和亞類的鑒定
[0055]運用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并參照說明書對抗體的亞 型進行鑒定。鑒定結果見表1:
[0056]表1各單克隆抗體類型的鑒定
[0058] 注:+表示陽性反應，-表示陰性反應。
[0059]由表1可知，單克隆抗體1G5、6E11重鏈亞型都為IgGl，輕鏈類型都為kappa。
[0060] 1.2.2單克隆抗體特異性的鑒定
[0061]按照蘇建青(蘇建青等，犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及特性鑒定，吉林農業大學 學報，2009，31 (1): 88~92)所提供的方法進行單克隆抗體的特異性鑒定。
[0062]測定結果顯示：單克隆抗體1G5、6E11與其他病毒均不發生反應，均是抗犬瘟熱病 毒的特異性單克隆抗體。
[0063] 1.3純化單克隆抗體的檢驗
[0064] 1.3.1純化單克隆抗體的外觀
[0065] 室溫下，肉眼觀察可見純化抗體呈無色澄清狀態，未見絮狀物沉淀。
[0066] 1.3.2無菌試驗
[0067] 采用無菌檢驗法，取純化后的單克隆抗體原料接種10mL/管的營養瓊脂斜面培養 基、改良馬丁培養基和硫乙醇酸鹽培養基各2管(接種量為0.5mL/管）。接種后的硫乙醇酸鹽 培養基及營養瓊脂斜面培養基各一管置于30_35°C培養，另一管于2〇-25°C培養。改良馬丁 培養基置于20_25°C培養。同時以無菌生理鹽水同法操作做陰性對照。培養14天后均未觀察 到培養基中有微生物生長，表明單克隆抗體1G5、6E11原料符合無菌要求。
[0068] 1.3.3單克隆抗體純度
[0069] 采用SDS-PAGE電泳鑒定，上樣量為10yg，檢測結果如圖2所示。結果表明：單克隆抗 體1G5、6E11的純度均不低于80%。
[0070] 1.3.4單克隆抗體相對親和力的測定
[0071]對純化的單克隆抗體進行其相對親和力的測定:將純化開始作倍比稀釋，分別加 入包被有⑶V抗原（1: 200倍V/V稀釋）的96孔酶標板，同時設陰性血清和空白對照37 °C反應 30分鐘，用TOST洗板3次，拍干;每孔加入羊抗鼠IgG-HRP(l: 1 X 104稀釋）100此/孔，反應過 后洗滌同上，每孔加入1〇〇此/孔TMB(四甲基聯苯胺)底物溶液顯色，用2m 〇L/L H2S〇4(50yL/ 孔)終止反應，讀取〇D45Qr?值。結果以與包被抗原出現50 %結合時的單克隆抗體的蛋白含量， 即為該株單克隆抗體的相對親和力。
[0072]以純化單克隆抗體的稀釋度與其相對應的OD45〇M值作圖，曲線趨于平坦時的 0D45Q?作為100%，即抗原與單克隆抗體的結合已達到飽和狀態。取曲線上50%飽和度所對 應的單克隆抗體濃度，即為該株單克隆抗體的相對親和力，親和力越大，所需單克隆抗體的 量越低。計算結果表明：單克隆抗體1G5、6E11的相對親和力均為1:5120。
[0073] 1.3.5單克隆抗體IPMA效價的測定
[0074]參照劉杉杉(劉杉杉等，豬細小病毒抗體IPMA檢測方法的建立及應用，中國獸醫科 學，2011，41 (04): 387-391)所述IPMA檢測方法，用此方法對兩株單克隆抗體進行效價測定。 測定結果表明：單克隆抗體1G5、6E11的IPMA效價均為1:12800。
[0075] 1.4單克隆抗體1G5、6E11可變區序列的測定
[0076] 根據鼠源單克隆抗體的序列特征，設計1G5重鏈可變區引物序列：
[0077] P1:ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
[0078] P2：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA [0079] 設計1G5輕鏈可變區引物序列：
[0080] P3：ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA [0081 ] P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
[0082]根據鼠源單克隆抗體的序列特征，設計6E11重鏈可變區引物序列：
[0083] PI：ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
[0084] P2：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA [0085] 設計6E11輕鏈可變區引物序列：
[0086] P3:ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA
[0087] P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
[0088]按照張愛華等(張愛華，閉蘭，王志友等.系列鼠抗⑶分子單克隆抗體輕、重鏈可變 區基因的克隆和序列分析.中國生物制品學雜志，2001，15(2): 65-68)建立的可變區序列測 定方法，通過分子克隆技術分別獲得單克隆抗體6E1U1G5的可變區序列，選取對應的克隆 質粒送至蘇州金維智生物科技有限公司進行測序。
[0089]結果：單克隆抗體6E11的重鏈可變區、輕鏈可變區的基因序列分別如SEQ ID 如.1、36〇10如.3所示，由其推導的氨基酸序列分別為3￡〇10如.2、3￡〇10如.4;單克隆 抗體1G5的重鏈可變區、輕鏈可變區的基因序列分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No. 7所示，由 其推導的氨基酸序列分別為SEQ ID No.6、SEQ ID No.8。
[0090] 1.5單克隆抗體的配對
[0091] 選擇犬瘟熱病毒CVCC AV299株病毒液，稀釋到102'5TCID5Q/ml，對于不同搭配模式 進行檢測，結果見表2:
[0092]表2單克隆抗體搭配檢測
[0094] 注:+表示陽性反應，-表示陰性反應。
[0095] 結果顯示：除了固相的單克隆抗體6E11與酶標的單克隆抗體1G5檢測102 ? 5TCID50/ ml的犬瘟熱病毒CVCC AV299株病毒稀釋液為陽性，其它搭配檢測均為陰性。因而，以單克隆 抗體6E11作為固定抗體、單克隆抗體1G5作為標記抗體進行試驗。
[0096]實施例2試劑盒的制備及方法、質量研究及應用
[0097] 2.1試劑盒之膠體金檢測試紙條
[0098] 2.1.1試劑盒之膠體金檢測試紙條的制備及應用
[0099] 試劑盒包括膠體金檢測試紙條、樣品處理液（即含2%CHAPS的pH7.4的磷酸鹽緩沖 液）、樣品處理管、樣品保存液，樣品保存液（即PH7.4的磷酸鹽緩沖液)在樣品保存瓶中，其 中膠體金檢測試紙條的制備如下：
[0100] 按照中國CN101614737A建立的膠體金制備方法制備膠體金溶液，并分別標記單克 隆抗體2(實施例1制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5,用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至標記 濃度為350iig/ml)、單克隆抗體4(抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8,標記濃度為400yg/ ml)、單克隆抗體6(抗犬腺病毒I型單克隆抗體E9,標記濃度為450iig/ml)、單克隆抗體8(抗 犬腺病毒II型單克隆抗體4H1-A7，標記濃度為450μg/ml)，單克隆抗體1 (實施例1制備的抗 犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，固定包被濃度為180iig/ml)、單克隆抗體3(抗犬副流感病毒單 克隆抗體4F3B6，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為200iig/ml)、單克隆抗體5(抗犬 腺病毒I型單克隆抗體G3,用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為220iig/ml)和/或 Santa公司的單克隆抗體7(抗犬腺病毒II型單克隆抗體anti-CAV-2-Santa，用pH7.4的磷酸 鹽緩沖液稀釋至固定濃度為210μg/ml)，以及羊抗鼠二抗（即羊抗鼠IgG，購自Sigma公司）噴 涂固定在硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質控線，將該硝酸纖維素膜和浸潤有膠體金標 記的單克隆抗體2、單克隆抗體4、單克隆抗體6和/或單克隆抗體8的金標墊用塑料外殼包裝 起來，做成膠體金檢測試紙條。
[0101] 其中，當檢測線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3時作為膠體金 檢測試紙條1;當檢測線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3、5時作為膠體金 檢測試紙條2;當檢測線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3、5、7時作為膠體 金檢測試紙條3。
[0102] 檢測時，將樣品與樣品處理液混合，將2-3滴(約80yl)混合液滴加于膠體金檢測試 紙條的加樣孔處，同時迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在檢測試紙條的檢測區觀察記 錄結果。結果判定標準:若質控線顯色即試驗成立，檢測線顯色即可判為陽性，檢測線不顯 色即可判為陰性;若質控線未顯色即試驗不成立，無論檢測線是否顯色，均則判定為無效結 果，需重測。
[0103] 2.1.2膠體金檢測試紙條的質量研究
[0104] 靈敏度檢驗:將犬瘟熱病毒CVCC AV299株(購自北京普天同創生物科技有限公司） 病毒液105'5TCID 5Q做梯度稀釋，稀釋后的濃度依次為他氣他^他允他^如^將犬副流 感病毒Cornell株(源自Nobivaf)病毒液 1〇6'5tcid5〇作梯度稀釋，稀釋濃度依次為1〇4'5、 10 4'Q、103'5、103' Q、102'5;將犬腺病毒 I 型 H株(參見中國專利 CN101914502A)病毒液 106'qTCID50 作梯度稀釋，稀釋濃度依次為1〇3'5、1〇3'1〇2' 5、1〇2'1〇1'5;將犬腺病毒11型426株（即 Toronto A26/61 株或ATCC VR-800株，參見文獻Darai G,Rosen A，DepI-Hs H，Flugel RM.Characterization of the DNA of canine adenovirus byrestriction enzyme analysis. Intervirology，1985,23(1) :23_28)病毒液 105'QTCID5〇做濃度稀釋，稀釋度依次 為104' ()、103'5、103'()、10 2'5、102'()。然后分別用膠體金檢測試紙條1、2、3對各病毒進行檢測，以 確定膠體金檢測試紙條1、2、3對各種病毒的檢測下限。結果表明：膠體金檢測試紙條1、2、3 對⑶V的檢測下限均為10 2'5TCID5Q/ml，膠體金檢測試紙條1、2、3對CPIV的檢測下限均為 10 3'5TCID5Q/ml，膠體金檢測試紙條2、3對CAV-1的檢測下限均為10 3'5TCID5Q/ml (針對CAV-1 的檢測在l〇2'6TCID5Q/ml檢測結果為陰性，因此盡管其在10 3'2TCID5Q/ml含量時檢測結果為 陽性，仍將檢測下限定為l〇 3'5TCID5Q/ml)，膠體金檢測試紙條3對CAV-2的檢測下限為 10 3-0TCID5〇/ml〇
[0105] 特異性測定：用膠體金檢測試紙條1、2、3分別檢測犬源其它病毒，包括犬細小病 毒、狂犬病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌，結果均為陰性，說明試紙條1、2、3特異性均良好。
[0106] 重復性試驗:分別取膠體金檢測試紙條1、2、3,每批各抽15條，分別檢測試紙條上 檢測線固定單克隆抗體對應的靶標病毒溶液各5次，如膠體金檢測試紙條1檢測CDV、CPIV， 結果:各相應樣品檢測均為陽性，且試紙條間顯色強度一致，表明重復性良好。
[0107] 保存期研究:分別將膠體金檢測試紙條1、2、3按照以下要求進行檢測，將三個連續 批號試紙條分別于37°C放置6天后進行熱穩定性試驗;將試紙條在2-8°C分別存放6個月、9 個月、12個月和15個月，進行試紙條的實時穩定性試驗。對不同保存條件的試紙條進行質控 品檢驗。質控品為病毒含量為10 3'102'101、(：105()/1111的〇^(^〇^￥299株病毒液，病毒含 量含10 4'5、103'5、102' 51'(：105()/1111的〇?1￥(：〇^1611株病毒液，病毒含量為103' 5、102'5、 IOUtCIDm的CAV-1H株病毒液，病毒含量為104'Q、103' Q、102'QTCID5QCAV-2A26株病毒液，重復 檢測3次。試紙條1、2、3分別各檢測3次的結果均為陽性且同一試紙條間顯色強度一致，表明 試紙條1、2、3在37°C條件下保存可貯存6天，在2-8°C規定條件下保存可貯存15月，表明試紙 條的保存期至少均可達12個月。
[0108] 2.1.3樣品檢測及比對試驗
[0109] 將CDV CVCC AV299株、CPIV Cornell株、CAV-1H株、CAV-2A26株用pH7.4磷酸鹽緩 沖液配制成10份已知病毒的混合溶液（即樣品1-10)，分別經實施例2.1.1制備的膠體金檢 測試紙條1、2、3進行檢測，檢測結果見表3-5。
[0110] 將采集的1〇份臨床樣品（即樣品11-20)即微生物拭子(約含樣品100mg)插入到樣 品處理管中，使樣品盡可能溶解在樣品處理液(即pH7.4的磷酸鹽緩沖液）中，最后使微生物 拭子頭這段留于管中；然后將含有臨床樣品的樣品處理管蓋子頭部折斷，滴加2-3滴混勻后 的樣品（約80yl)至膠體金檢測試紙條加樣孔中心；10分鐘后在膠體金檢測試紙條的檢測區 觀察，根據結果判定標準記錄結果(見表3-5)。
[0111] 同時，將20份樣品按照中國專利CN102618666A對CDV、CPIV、CAV-l、CAV-2進行RT-pCR檢測，同時分別用Bi 0n0te犬瘟熱病毒抗原快速檢測試劑盒(購自韓國安捷公司，參照試 劑盒參考說明書進行操作）、犬副流感病毒檢測卡(購自上海快靈生物科技有限公司）、犬腺 病毒I型檢測卡(購自上海快靈生物科技有限公司）、犬腺病毒n型檢測卡(購自上海快靈生 物科技有限公司)進行對比檢測，結果見表3-5。
[0112] 表3膠體金檢測試紙條1、酶免疫層析檢測試紙條1檢測及與現有技術比對結果
[0114]表4膠體金檢測試紙條2、酶免疫層析檢測試紙條2檢測及與現有技術比對結果
[0116]表5膠體金檢測試紙條3、酶免疫層析檢測試紙條3檢測及與現有技術比對結果
[0118]
[0119] 注:樣品1-10為病毒液，樣品11-20為臨床樣品；"+"表示檢測結果為陽性，表示 檢測結果為陰性，7"表示臨床糞便樣品；金標1、2、3依次表示膠體金檢測試紙條1、2、3,酶 免1、2、3依次表示酶免疫層析檢測試紙條1、2、3。
[0120] 由表3可知:膠體金檢測試紙條1可同時檢測⑶V、CPIV兩種病毒，并且膠體金檢測 試紙條1檢測CDV的結果略低于RT-PCR的檢測結果比，優于韓國安捷CDV試劑盒的檢測結果； 檢測CPIV的結果也略低于RT-PCR的檢測結果，優于上海快靈CPIV檢測卡的檢測結果。
[0121] 由表4可知：膠體金檢測試紙條2可同時檢測⑶V、CPIV、CAV-1三種病毒，并且膠體 金檢測試紙條2檢測CDV的結果與膠體金檢測試紙條1的結果相當，略低于RT-PCR的檢測結 果，優于韓國安捷試劑盒的檢測結果;檢測CPIV的結果與膠體金檢測試紙條1的結果相當， 略低于RT-PCR的檢測結果，優于上海快靈CPIV的檢測結果;檢測CAV-1的結果略低于RT-PCR 的檢測結果，優于上海快靈CAV-1的檢測結果。
[0122] 由表5可知:膠體金檢測試紙條3可同時檢測⑶￥、0?1￥、04￥-1、0六￥-2四種病毒，并 且膠體金檢測試紙條3檢測CDV的結果與膠體金檢測試紙條1、2的結果相當，略低于RT-PCR 檢測結果相當，優于韓國安捷試劑盒的檢測結果;檢測CPIV的結果與膠體金檢測試紙條1、2 的結果相當，略低于RT-PCR的檢測結果，優于上海快靈CPIV檢測卡的檢測結果;檢測CAV-1 的結果與膠體金檢測試紙條2的結果相當，略低于RT-PCR的檢測結果，優于上海快靈CVA-1 檢測卡的檢測結果;檢測CAV-2的結果略低于RT-PCR的檢測結果，優于上海快靈CVA-2檢測 卡的檢測結果。
[0123] 2.2試劑盒之酶免疫層析檢測試紙條的制備及應用
[0124] 2.2.1試劑盒之酶免疫層析檢測試紙條的制備
[0125] 試劑盒包括酶免疫層析檢測試紙條、樣品處理液（即含2%CHAPS的pH7.4的磷酸鹽 緩沖液）、樣品處理管、樣品保存液，樣品保存液（即PH7.4的磷酸鹽緩沖液)在樣品保存瓶 中，其中酶免疫層析檢測試紙條的制備如下：
[0126] 按照中國CN104062430A制備酶免疫層析檢測試紙條，先將單克隆抗體2(實施例1 制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至標記濃度為350iig/ml)、 單克隆抗體4(抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8,標記濃度為400iig/ml)、單克隆抗體6(抗 犬腺病毒I型單克隆抗體E9,標記濃度為450iig/ml)、單克隆抗體8(抗犬腺病毒II型單克隆 抗體4H1-A7，標記濃度為450iig/ml)分別用辣根過氧化物酶HRP進行標記，將單克隆抗體1 (實施例1制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，固定包被濃度為180μg/ml)、單克隆抗體3 (抗犬副流感病毒單克隆抗體4F3B6,用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為200yg/ ml)、單克隆抗體5(抗犬腺病毒I型單克隆抗體G3,用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度 為220邱/1111)和/或單克隆抗體7(抗犬腺病毒11型單克隆抗體 &1^1-04￥-2-3&1^&，用口117.4 的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為210iig/ml)，以及羊抗鼠二抗（即羊抗鼠IgG，購自Sigma 公司）噴涂固定在硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質控線，將該硝酸纖維素膜和浸潤有 酶標記的單克隆抗體2、單克隆抗體4、單克隆抗體6和/或單克隆抗體8的酶標墊用塑料外殼 包裝起來，做成酶免疫層析檢測試紙條。
[0127] 其中，當檢測線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3時作為酶免疫 層析檢測試紙條1，如圖2(1)所示；當檢測線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體 1、3、5時作為酶免疫層析檢測試紙條2,如圖2(2)所示；當檢測線固定的單克隆抗體從左到 右依次為單克隆抗體1、3、5、7時作為酶免疫層析檢測試紙條3,如圖2(3)所示。
[0128] 檢測時，將樣品與樣品處理液混合，將2-3滴(約80yl)混合液滴加于酶免疫層析檢 測試紙條的加樣孔處，同時迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在檢測試紙條的檢測區觀 察記錄結果。結果判定標準:若質控線顯色即試驗成立，檢測線顯色即可判為陽性，檢測線 不顯色即可判為陰性;若質控線未顯色即試驗不成立，無論檢測線是否顯色，均則判定為無 效結果，需重測。
[0129] 2.2.2酶免疫層析檢測試紙條的質量研究
[0130] 靈敏度檢驗:將實施例2.1制備的含CVCC AV299株的不同濃度病毒溶液、含CPIV Cornell株的不同濃度病毒溶液、含CAV-1H株的不同濃度病毒溶液和/或含CAV-2A26株的不 同病毒液的混合溶液，然后分別用酶免疫層析檢測試紙條進行檢測，分別確定酶免疫層析 檢測試紙條1、2、3對各種病毒的檢測下限。結果，酶免疫層析檢測試紙條1、2、3對CDV的檢測 下限均為H^TCIDM/ml;酶免疫層析檢測試紙條1、2、3對CPIV的檢測下限均為H^TCIDm/ ml;酶免疫層析檢測試紙條2、3對CAV-1的檢測下限均為lO^TCIDso/ml;酶免疫層析檢測試 紙條3對CAV-2的檢測下限均為10 2 ? 5TCID5Q/ml。
[0131] 特異性測定：用酶免疫層析檢測試紙條1、2、3分別檢測犬源其它病毒，包括犬細小 病毒、狂犬病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌，結果均為陰性，說明試紙條1、2、3特異性均良好。
[0132] 重復性試驗:取酶免疫層析檢測試紙條1、2、3,各抽15條，分別檢測試紙條上檢測 線固定單克隆抗體對應的靶標病毒溶液各5次，如酶免疫層析檢測試紙條1檢測CDV、CPIV， 結果，各相應樣品檢測均為陽性，且試紙條間顯色強度一致，表明重復性良好。結果，試紙條 1、2、3的檢測結果均為陽性，且顯色強度一致，表明重復性良好。
[0133] 保存期研究:分別將酶免疫層析檢測試紙條1、2、3按照以下要求進行檢測，將三個 連續批號試紙條分別于37°C放置6天后進行熱穩定性試驗;將試紙條在2-8°C分別存放6個 月、9個月、12個月和15個月，進行試紙條的實時穩定性試驗。對不同保存條件的試紙條進行 質控品檢驗，質控品為病毒含量為10 3'102'5、101、(：105()/1111的〇^(^〇^￥299株病毒液，病 毒含量含1〇 4'5、1〇3'5、1〇2' 51'(：105()/1111的0?1￥0^11611株病毒液，病毒含量為103' 5、102'5、 IOUtCIDm的CAV-1H株病毒液，病毒含量為104'Q、103' Q、102'QTCID5QCAV-2A26株病毒液，重復 檢測3次。試紙條1、2、3分別各檢測3次的結果均為陽性且同一試紙條間顯色強度一致，表明 試紙條1、2、3在37°C條件下保存可貯存6天，在2-8°C規定條件下保存可貯存15月，表明試紙 條的保存期至少均可達12個月。
[0134] 2.2.3樣品檢測及比對試驗
[0135] 將2~3滴(約80yl)實施例2.1制備的20份樣品滴加于酶免疫層析檢測試紙條的加 樣孔處，同時迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在酶免試紙條的檢測區觀察，根據結果判 定標準記錄各檢測結果。
[0136] 由表3可知:酶免疫層析檢測試紙條1可同時檢測CDV、CPIV兩種病毒，并且酶免疫 層析檢測試紙條1檢測CDV的結果與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金檢測試紙條1、2、3 以及韓國安捷試劑盒的檢測結果;檢測CPIV的結果與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金 檢測試紙條1、2、3以及上海快靈CPIV檢測卡的檢測結果。
[0137] 由表4可知：酶免疫層析檢測試紙條2可同時檢測⑶V、CPIV、CAV_1三種病毒，并且 酶免疫層析檢測試紙條2檢測CDV的結果與酶免疫層析檢測試紙條1的結果相當，與RT-PCR 的檢測結果相當，優于膠體金檢測試紙條1、2、3及韓國安捷試劑盒的檢測結果;檢測CPIV的 結果與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金檢測試紙條1、2、3以及上海快靈CPIV檢測卡的 檢測結果;檢測CAV-1的結果與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金檢測試紙條2、3以及上 海快靈CPIV檢測卡的檢測結果。
[0138] 由表5可知：酶免疫層析檢測試紙條3可同時檢測0^、0?1￥、04￥-1、04￥-2四種病 毒，并且酶免疫層析檢測試紙條3檢測CDV的結果與酶免疫層析檢測試紙條1、2的結果相當， 與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金檢測試紙條1、2、3以及韓國安捷試劑盒的檢測結果； 檢測CPIV的結果與酶免疫層析檢測試紙條1、2的結果相當，與RT-PCR的檢測結果相當，優于 膠體金檢測試紙條1、2、3以及上海快靈CPIV檢測卡的檢測結果;檢測CAV-1的結果與酶免疫 層析檢測試紙條2的結果相當，與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金檢測試紙條2、3以及 上海快靈CAV-1的檢測結果;檢測CAV-2的結果與RT-PCR的檢測結果相當，優于膠體金檢測 試紙條3以及上海快靈CVA-2檢測卡的檢測結果。
[0139] 綜上所述，本發明制備的膠體金檢測試紙條、酶免疫層析檢測試紙條可同時檢測 兩種、三種或四種病毒膠體金檢測試紙條優于現有技術中的其他膠體金檢測試紙，酶免疫 層析檢測試紙條與PCR檢測靈敏度相當。
[0140]以上所述僅為本發明的具體實施例，本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉 本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案的范圍內，當可利用上述揭示的技術內容作 出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據 本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發明 技術方案的范圍內。
【主權項】
1. 一種試劑盒，所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體I、2和有效量的抗 犬副流感病毒單克隆抗體3、4,以及對抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑； 其中，所述單克隆抗體1為抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，所述單克隆抗體2為抗犬瘟 熱病毒單克隆抗體1G5;以及 所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4分別選自4F3B6、4C9D6、5B4C9、4G7F4中的兩種，且 所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4能與犬副流感病毒同時發生抗原抗體反應。2. 根據權利要求1所述試劑盒，其中，所述單克隆抗體3為抗犬副流感病毒單克隆抗體 4F3B6、所述單克隆抗體4為抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8。3. 根據權利要求1或2所述試劑盒，其中，所述試劑盒進一步含有有效量的抗犬腺病毒I 型單克隆抗體5、6,和/或有效量的抗犬腺病毒Π 型單克隆抗體7、8， 其中，所述抗犬腺病毒I型單克隆抗體5、6分別選自C8、E9、G3、C2、H2、2E10-H2中的兩 種，且所述抗犬腺病毒I型單克隆抗體5、6能與犬腺病毒I型同時發生抗原抗體反應;以及 所述抗犬腺病毒Π 型單克隆抗體7為Santa公司的anti-CAV-2-Santa、單克隆抗體8為 4H1-A7； 優選地，所述單克隆抗體5為抗犬腺病毒I型單克隆抗體G3,所述單克隆抗體6為抗犬腺 病毒I型單克隆抗體E9。4. 根據權利要求1~3任一項所述試劑盒，其中，所述單克隆抗體1、3、5、7的含量各自分 別為25-1 OOOμg/ml，所述單克隆抗體2、4、6、8的含量各自分別為50-2000μg/ml。5. 根據權利要求1~3任一項所述試劑盒，其中，所述試劑盒進一步包括洗滌液、稀釋 液、底物顯色液、終止液、陰性對照、陽性對照。6. 根據權利要求1~3任一項所述試劑盒，其中，所述單克隆抗體1、單克隆抗體3固定于 固相上，所述固相包括微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜;優選地，所述單克隆抗 體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7固定于固相上，所述固相包括微滴定板、 磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜。7. 根據權利要求1~3任一項所述試劑盒，其中，所述對抗原抗體反應進行檢測的檢測 試劑包括酶顯色檢測試劑、膠體金檢測試劑、熒光檢測試劑、化學發光檢測試劑或同位素檢 測試劑。8. 根據權利要求1~3任一項所述試劑盒，其中，所述試劑盒包括膠體金檢測試紙條，所 述膠體金檢測試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二 端的方向，所述底板上依次有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標墊上 含有膠體金標記的所述單克隆抗體2、膠體金標記的所述單克隆抗體4,所述硝酸纖維素膜 上有兩條檢測線和一條質控線，所述檢測線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3所述質 控線上有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗； 優選地，所述試劑盒還包括有效量的抗犬腺病毒I型單克隆抗體5、6和/或有效量的抗 犬腺病毒II型單克隆抗體7、8,所述試劑盒的所述金標墊上進一步包括含有膠體金標記的 所述單克隆抗體6和/或膠體金標記的單克隆抗體8,所述硝酸纖維素膜上有三條或四條檢 測線，所述檢測線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7。9. 根據權利要求1~3任一項所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括緩沖液供應單元和 酶免疫層析檢測試紙條;所述緩沖液供應單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢測試紙 條;所述酶免疫層析檢測試紙條包括硝酸纖維素膜(I)，所述酶免疫層析檢測試紙條在縱向 上依次包括底物供應區、樣品供應區、檢測區;所述底物供應區包括底物墊(3)，其上吸附有 干燥的酶底物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，當所述緩沖液供應單元向所述酶 免疫層析檢測試紙條供給緩沖液，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距 所述緩沖液供應單元的遠端迀移;所述樣品供應區包括酶標墊(2)，其上吸附有酶標記的所 述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4,所述酶底物能與所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4上 標記的酶產生顯色反應，所述酶標墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體2、所述 單克隆抗體4溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜(1)上向距所述緩沖液供應單元的遠端迀移； 以及所述檢測區依次固定化有所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3;其中，所述緩沖液供應 單元包括展開液墊(5)、底物緩沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液 (9)放置于底物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下所述按 鈕可將所述展開液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測區包括檢測線(6)、質控線(7)，其中， 所述質控線(7)較檢測線(6)更遠離所述樣品供應區，在所述檢測線(6)分別固定化有所述 單克隆抗體1、所述單克隆抗體3,在所述質控線(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且 吸附在酶標墊(2)上的所述酶標記的單克隆抗體2、單克隆抗體4分別對于固定在檢測線(6) 的所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3而言是過量的;所述硝酸纖維素膜(1)全段粘附在所 述支撐物（10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應單元，底物供應區，樣品供應區，檢測區 以及吸水墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應單元的最遠端；以及檢測樣品（11)加 入的位置為所述酶標墊(2)的位置； 優選地，所述試劑盒的酶標墊(2)，其上吸附有酶標記的所述單克隆抗體2、所述單克隆 抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8,所述酶底物能與所述單克隆抗體2、所述 單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8上標記的酶產生顯色反應，所述酶 標墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6 和/或所述單克隆抗體8溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜(1)上向距所述緩沖液供應單元的 遠端迀移；以及所述檢測區依次固定化有所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆 抗體5和/或所述單克隆抗體7;且吸附在酶標墊(2)上的所述酶標記的單克隆抗體2、單克隆 抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8分別對于固定在檢測線(6)的所述單克隆 抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體。10.-種根據權利要求1~9任一項所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副 流感病毒檢測中的應用;優選地，所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病 毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒Π 型檢測中的應用； 所述非診斷目的包括流行病學分析、對離體組織進行定性和定量檢測、表位鑒定研究 以及定性和定量鑒別檢驗含所述犬瘟熱病毒、犬副流感病毒的全病毒抗原的疫苗組合物中 的全病毒抗原，或定性和定量鑒別檢驗含犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/或犬 腺病毒Π 型的全病毒抗原的疫苗組合物中的全病毒抗原。
【文檔編號】G01N33/577GK105891491SQ201610221785
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月11日
【發明人】田克恭, 王瑩
【申請人】洛陽普萊柯萬泰生物技術有限公司