本發明涉及獸藥殘留(liu)檢測技術領域，特別是檢測大米中滅(mie)多(duo)威的酶(mei)聯(lian)免疫試(shi)劑盒。
背景技術：
滅多(duo)(duo)(duo)威是一(yi)種廣(guang)譜性氨基(ji)甲(jia)(jia)酸酯類(lei)(lei)殺(sha)蟲(chong)劑(ji)，具有(you)揮發性強，吸(xi)入毒(du)性高(gao)等特性,主要用(yong)(yong)于(yu)防治二化螟(ming)、飛虱類(lei)(lei)、斜紋(wen)夜蛾(e)等類(lei)(lei)害蟲(chong)。原(yuan)藥(yao)為(wei)(wei)白色晶體粉(fen)末，商品態為(wei)(wei)可(ke)濕性粉(fen)劑(ji)、可(ke)溶性粉(fen)劑(ji)或乳油。滅多(duo)(duo)(duo)威為(wei)(wei)一(yi)種內(nei)吸(xi)性具有(you)觸殺(sha)、胃毒(du)作用(yong)(yong)的(de)氨基(ji)甲(jia)(jia)酸酯類(lei)(lei)的(de)廣(guang)譜殺(sha)蟲(chong)劑(ji)。最(zui)先推(tui)薦作為(wei)(wei)殺(sha)蟲(chong)、殺(sha)線蟲(chong)劑(ji)。適用(yong)(yong)于(yu)棉花(hua)、煙草、果樹、蔬菜防治蚜蟲(chong)、蛾(e)、地老虎(hu)等。因此定期對滅多(duo)(duo)(duo)威殘(can)留進行檢測成為(wei)(wei)許多(duo)(duo)(duo)國家的(de)監控的(de)必要手段(duan)。
酶聯(lian)免疫吸附法(fa)是一種準(zhun)確、可靠、快速(su)、特異的檢測方法(fa)，適(shi)合于(yu)大(da)批樣(yang)品的快速(su)篩選，近年來(lai)已廣泛應用(yong)于(yu)食(shi)品安全檢測行業。本發明旨在建立一種檢測滅多威的酶聯(lian)免疫試劑盒及(ji)其(qi)檢測方法(fa)。
技術實現要素：
為了克服(fu)色譜法的不足(zu)，本發明提(ti)供一種(zhong)檢測滅多威(wei)的酶(mei)聯免(mian)疫(yi)試劑盒(he)及其檢測方(fang)法。該方(fang)法靈敏、準確、快速(su)(su)，操作簡便、特異性(xing)強，適用于(yu)大批樣品的快速(su)(su)檢測。
本發明檢測滅多威的(de)酶(mei)聯免疫(yi)試劑盒，包括(kuo)酶(mei)標(biao)板、滅多威標(biao)準(zhun)品(pin)、滅多威抗體工作(zuo)液(ye)(ye)、滅多威酶(mei)標(biao)二(er)抗工作(zuo)液(ye)(ye)、底(di)物液(ye)(ye)A、底(di)物液(ye)(ye)B、終止液(ye)(ye)、濃縮稀釋液(ye)(ye)和濃縮洗(xi)滌液(ye)(ye)。
本發明檢(jian)測滅(mie)(mie)多威的(de)(de)酶聯免疫試(shi)劑盒的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)，包括以(yi)下(xia)步驟：酶標(biao)板的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、滅(mie)(mie)多威標(biao)準品的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、滅(mie)(mie)多威抗體工作(zuo)液(ye)(ye)的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、滅(mie)(mie)多威酶標(biao)二抗工作(zuo)液(ye)(ye)的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、底(di)物液(ye)(ye)A的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、底(di)物液(ye)(ye)B的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、終(zhong)止(zhi)液(ye)(ye)的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)、濃(nong)縮稀釋液(ye)(ye)的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)和(he)濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液(ye)(ye)的(de)(de)制(zhi)備(bei)(bei)。
其進(jin)一(yi)步特(te)征在于(yu)：所述的(de)酶(mei)標板(ban)(ban)經(jing)由(you)滅(mie)多(duo)威抗原(yuan)包(bao)被制備(bei)，具(ju)體步驟(zou)是(shi)將滅(mie)多(duo)威半抗原(yuan)與載(zai)體蛋(dan)(dan)白牛(niu)血清(qing)白蛋(dan)(dan)白(BSA)偶(ou)聯得到包(bao)被抗原(yuan)，用0.05 mol/L pH 9.6的(de)碳酸鹽(CBS)緩沖液(ye)作為包(bao)被液(ye)，將滅(mie)多(duo)威包(bao)被抗原(yuan)稀釋成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶(mei)標板(ban)(ban)甩(shuai)掉(diao)板(ban)(ban)內液(ye)體，加(jia)(jia)入(ru)經(jing)稀釋的(de)濃縮洗滌(di)液(ye)300 μL/孔，洗板(ban)(ban)2次，30 s/次，然后加(jia)(jia)入(ru)0.5%牛(niu)血清(qing)白蛋(dan)(dan)白(BSA)封閉液(ye)，150 μL/孔，37℃放(fang)置(zhi)1.5 h，甩(shuai)掉(diao)封閉液(ye)直接拍(pai)干，拍(pai)干后的(de)酶(mei)標板(ban)(ban)放(fang)置(zhi)恒(heng)溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶(mei)標板(ban)(ban)真空密封于(yu)4℃條件下保存(cun)。
滅(mie)多威標(biao)準品濃(nong)度分別為(wei)0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
所述滅多威抗體(ti)工作(zuo)液(ye)是采用(yong)滅多威人(ren)工抗原免(mian)疫小鼠得(de)到單克隆抗體(ti)，用(yong)抗體(ti)稀釋(shi)液(ye)稀釋(shi)成1：60000比(bi)例制備。
所(suo)述滅多威酶標二抗(kang)(kang)工作液(ye)(ye)由酶標二抗(kang)(kang)加(jia)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)(ye)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)成1：2000比例(li)，所(suo)述底(di)物(wu)液(ye)(ye)A為(wei)含有0.5 mmol/L的(de)過氧(yang)化(hua)氫(qing)脲的(de)檸(ning)檬酸(suan)-磷酸(suan)氫(qing)二鈉(na)緩沖溶液(ye)(ye)，所(suo)述底(di)物(wu)液(ye)(ye)B為(wei)四甲(jia)基聯苯二胺的(de)乙醇溶液(ye)(ye)，所(suo)述終(zhong)止液(ye)(ye)為(wei)2 mol/L的(de)硫酸(suan)，所(suo)述濃縮(suo)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)(ye)是(shi)10倍濃縮(suo)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)(ye)，為(wei)0.1 mol/L的(de)PBS，pH值范圍(wei)7.0-7.5之(zhi)間，所(suo)述濃縮(suo)洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)是(shi)10倍濃縮(suo)洗(xi)(xi)滌液(ye)(ye)，為(wei)含0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L的(de)PBST，pH值范圍(wei)7.0-7.5之(zhi)間。
檢測(ce)滅多威的(de)酶聯(lian)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)試劑盒及其檢測(ce)方(fang)法，基(ji)于抗(kang)原抗(kang)體的(de)間接競爭(zheng)酶聯(lian)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)反應原理，該方(fang)法包括以下步驟：
(1)預處理待測樣品(pin)，即將待測試的樣品(pin)處理為液體(ti)樣品(pin)，或者(zhe)用有機(ji)溶劑提(ti)取待測樣品(pin)，并將其(qi)復(fu)溶于樣品(pin)稀釋液中(zhong)；
(2)將所需試劑從冷藏環境中取出(chu)，置于室溫（20～25℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖(yao)勻；
(3)取包(bao)被有滅(mie)多(duo)威抗(kang)原的(de)酶(mei)標板，加(jia)標準品/樣本50 μL/孔到對應的(de)微(wei)孔中(zhong)，加(jia)入(ru)滅(mie)多(duo)威酶(mei)標二抗(kang)工(gong)作液，50 μL/孔，然(ran)后加(jia)入(ru)滅(mie)多(duo)威抗(kang)體(ti)工(gong)作液，50 μL/孔，輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，用蓋(gai)板膜蓋(gai)板后置室溫(wen)25℃避光環境中(zhong)反應30 min；
(4)小心揭(jie)開蓋板膜，將孔內(nei)液(ye)(ye)體甩干，用洗(xi)滌工作液(ye)(ye)260 μL/孔，充分洗(xi)滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水(shui)紙(zhi)拍干(拍干后未(wei)被清除(chu)的氣泡可用未(wei)使用過的槍頭戳(chuo)破(po))；
(5)加入底物液A 50 μL/孔(kong)，底物液B 50 μL/孔(kong)，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，用(yong)蓋板(ban)膜(mo)蓋板(ban)后置25℃避光環境中反應15～20 min；
(6)加入終(zhong)止液50 μL/孔，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻(yun)，設定(ding)酶標儀于450 nm處或雙(shuang)波(bo)長(chang)450/630 nm檢測，測定(ding)每孔吸光度值（請在5 min內(nei)讀完數(shu)據(ju)）；
(7)以的標(biao)(biao)準品濃度(ppb)的對數為(wei)橫坐標(biao)(biao)，標(biao)(biao)準品百分吸(xi)光度值為(wei)縱坐標(biao)(biao)，繪(hui)制標(biao)(biao)準曲線，對照標(biao)(biao)準曲線計算樣品中滅(mie)多威(wei)的含量。
本發明檢(jian)(jian)測(ce)滅(mie)(mie)多威(wei)(wei)的(de)(de)酶(mei)(mei)聯免疫(yi)試劑(ji)盒(he)及其檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法的(de)(de)測(ce)定原(yuan)理：樣(yang)(yang)(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de)滅(mie)(mie)多威(wei)(wei)與酶(mei)(mei)標(biao)(biao)板上固定的(de)(de)抗(kang)原(yuan)特異性競爭抗(kang)體，加入酶(mei)(mei)標(biao)(biao)二抗(kang)，與抗(kang)體反應(ying)，通過酶(mei)(mei)催化顯色(se)劑(ji)顯色(se)，根據顯色(se)的(de)(de)深(shen)淺(qian)來判斷樣(yang)(yang)(yang)品(pin)中(zhong)滅(mie)(mie)多威(wei)(wei)的(de)(de)含量。如果樣(yang)(yang)(yang)品(pin)中(zhong)的(de)(de)滅(mie)(mie)多威(wei)(wei)含量少(shao)，顯色(se)深(shen)；反之，則(ze)顯色(se)淺(qian)。本發明的(de)(de)試劑(ji)盒(he)檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法操作簡便，檢(jian)(jian)測(ce)靈敏(min)、準確(que)、快速，適用于大批量樣(yang)(yang)(yang)品(pin)的(de)(de)快速檢(jian)(jian)測(ce)。
具體實施方式
滅(mie)多威蛋(dan)白質偶聯物(wu)的制備(bei)：
采用(yong)琥珀酸酐(gan)法得(de)到(dao)帶羧基(ji)的(de)滅多威半抗原衍生物，之后(hou)取(qu)0.05 mmol與載體蛋白BSA按(an)10：1的(de)結合(he)比混合(he)在0.05 mol/L pH 9.6的(de)碳(tan)酸鹽緩沖(chong)液(ye)(CBS)中，然后(hou)加入0.15 mmol碳(tan)二(er)亞胺，攪拌(ban)置室溫反應24 h，最后(hou)于(yu)0.2 mol/L pH 7.6的(de)PBS緩沖(chong)液(ye)中透析兩(liang)天，除去未反應的(de)半抗原，將(jiang)得(de)到(dao)的(de)蛋白質(zhi)偶聯(lian)物溶液(ye)于(yu)-20℃保存備用(yong)。
滅多威抗體的制備：
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質偶聯制備的免疫抗原50μg與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進行末次免疫，3天后取脾制備脾細胞懸浮液與骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細胞系進行克隆化，選擇處于對數生長期的雜交瘤細胞進行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106個雜交(jiao)瘤細胞，接種細胞7-10天后可(ke)產(chan)生腹(fu)水，待腹(fu)水盡(jin)可(ke)能多時用注(zhu)射器抽取腹(fu)水，反復收集數(shu)次，4000 rpm離心(xin)15 min，收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹(fu)水對單克(ke)隆抗體進行(xing)純化，冷凍(dong)干燥得凍(dong)干粉后于(yu)-20 ℃保(bao)存備用。
制備(bei)包被(bei)有滅多威包被(bei)抗原(yuan)的酶(mei)標板：
包被抗原是將滅多威半抗原與(yu)載體(ti)(ti)蛋(dan)白(bai)(bai)牛血清(qing)白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(BSA)偶聯得(de)到的(de)，用(yong)0.05 mol/L pH 9.6的(de)碳酸鹽(yan)(CBS)緩沖液(ye)作為包被液(ye)，將滅多威抗原稀(xi)釋成1:40000比(bi)例，100 μL/孔(kong)，37℃放置(zhi)2 h，取(qu)出酶標板(ban)甩(shuai)掉板(ban)內液(ye)體(ti)(ti)，用(yong)稀(xi)釋后的(de)濃縮洗滌液(ye)300 μL/孔(kong)，洗板(ban)2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清(qing)白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(BSA)封(feng)(feng)閉，150 μL/孔(kong)，37℃放置(zhi)1.5 h，棄(qi)去(qu)封(feng)(feng)閉液(ye)，拍干后的(de)酶標板(ban)放置(zhi)恒溫間(25℃)晾(liang)干，抽檢合格后將酶標板(ban)真空密封(feng)(feng)后置(zhi)4℃下(xia)保存(cun)。
滅多威標(biao)準品配制濃(nong)度分(fen)別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
滅多威抗(kang)體(ti)(ti)工(gong)作液(ye)的制(zhi)備(bei)：采用滅多威人(ren)工(gong)抗(kang)原(yuan)免疫小鼠得(de)到單克隆抗(kang)體(ti)(ti)，用抗(kang)體(ti)(ti)稀(xi)釋液(ye)稀(xi)釋成1：60000比例制(zhi)備(bei)。
滅多威(wei)酶標(biao)二抗工(gong)作液(ye)(ye)(ye)由酶標(biao)二抗加稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)(ye)稀(xi)(xi)釋成1：2000比例，底物(wu)液(ye)(ye)(ye)A為含有(you)0.5 mmol/L的(de)(de)(de)過(guo)氧化(hua)氫(qing)脲的(de)(de)(de)檸檬酸-磷酸氫(qing)二鈉(na)緩(huan)沖溶液(ye)(ye)(ye)，底物(wu)液(ye)(ye)(ye)B為四甲基聯苯(ben)二胺(an)的(de)(de)(de)乙(yi)醇溶液(ye)(ye)(ye)，終止液(ye)(ye)(ye)為2 mol/L的(de)(de)(de)硫酸，濃縮稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)(ye)是10倍(bei)濃縮稀(xi)(xi)釋液(ye)(ye)(ye)，為0.1 mol/L的(de)(de)(de)PBS，pH值范圍7.0-7.5之(zhi)間，濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)(ye)(ye)是10倍(bei)濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)(ye)(ye)，為含0.5% 吐溫-20，0.01mol/L的(de)(de)(de)PBST，pH值范圍7.0-7.5之(zhi)間。
基(ji)于上述制備(bei)的試劑(ji)(ji)，本發明(ming)用(yong)于檢測(ce)滅(mie)多(duo)威(wei)的酶(mei)聯免疫試劑(ji)(ji)盒包括(kuo)如下材料(liao)：
(1)96孔酶(mei)標(biao)板(ban)×1塊(kuai)；
(2)標準液×6瓶：(1mL/瓶) 0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg；
(3)抗(kang)體工(gong)作液 7 mL；
(4)酶標(biao)二抗工作液 7 mL；
(5)底(di)物液A 7 mL；
(6)底物(wu)液B 7 mL；
(7)終止液 7 mL；
(8)10×濃縮稀釋液 40 mL；
(9)10×濃縮(suo)洗滌(di)液 40 mL；
本(ben)發明(ming)(ming)的試劑(ji)盒用于(yu)檢測農(nong)作物(wu)樣本(ben)中滅多威殘留量(liang)時(shi)，通過以下(xia)步驟實(shi)施：樣品預處理、用本(ben)發明(ming)(ming)試劑(ji)盒進(jin)行檢測、分析結果(guo)。
(1)用本發(fa)明試劑盒(he)檢測待測樣品中滅多威殘留量(liang)
取包被有滅(mie)多威抗原的(de)酶(mei)標板(ban)，加(jia)標準品/樣(yang)(yang)本(ben)50 μL/孔(kong)(kong)到對應的(de)微孔(kong)(kong)中；加(jia)入(ru)酶(mei)標二抗工作液(ye)(ye)，50 μL/孔(kong)(kong)，然后(hou)加(jia)入(ru)滅(mie)多威抗體工作液(ye)(ye)，50 μL/孔(kong)(kong)，輕(qing)輕(qing)振(zhen)(zhen)蕩(dang)混勻，用(yong)蓋板(ban)膜(mo)蓋板(ban)后(hou)置(zhi)室溫(wen)25℃避光(guang)環(huan)境中反應30 min；小(xiao)心揭開蓋板(ban)膜(mo)，將孔(kong)(kong)內液(ye)(ye)體甩干，用(yong)洗滌工作液(ye)(ye)300 μL/孔(kong)(kong)，充分洗滌4次，浸泡15-30 s，用(yong)吸(xi)水紙拍干；加(jia)入(ru)底(di)物(wu)液(ye)(ye)A 50 μL/孔(kong)(kong)，底(di)物(wu)液(ye)(ye)B 50 μL/孔(kong)(kong)，輕(qing)輕(qing)振(zhen)(zhen)蕩(dang)混勻，用(yong)蓋板(ban)膜(mo)蓋板(ban)后(hou)置(zhi)25℃避光(guang)環(huan)境中反應15 min；加(jia)入(ru)終止液(ye)(ye)50 μL/孔(kong)(kong)，輕(qing)輕(qing)振(zhen)(zhen)蕩(dang)混勻，設定酶(mei)標儀(yi)于(yu)450 nm處或雙波長450/630 nm檢測(ce)，測(ce)定每孔(kong)(kong)吸(xi)光(guang)度(du)值（請在5 min內讀完數據）；對比待測(ce)樣(yang)(yang)品與標準品的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值大小(xiao)，定量分析待測(ce)樣(yang)(yang)品中滅(mie)多威殘留量。
(2)分析結果
百分(fen)吸光度(du)值的(de)(de)(de)計(ji)算(suan)，標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)或樣(yang)本的(de)(de)(de)百分(fen)吸光度(du)值等(deng)于標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)或樣(yang)本的(de)(de)(de)吸光度(du)值的(de)(de)(de)平均值(雙孔)除(chu)以第一(yi)個標(biao)準(zhun)(zhun)(0標(biao)準(zhun)(zhun))的(de)(de)(de)吸光度(du)值，再乘(cheng)以100%，即
百分吸光度值(%) ＝B/B0×100%
其中B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0—0 ppb標準溶液的平(ping)均吸(xi)光度值。
以滅(mie)多(duo)威的標(biao)(biao)準(zhun)品濃度(du)(du)(ppb)的對數為橫坐標(biao)(biao)，標(biao)(biao)準(zhun)品百(bai)分吸(xi)光(guang)度(du)(du)值為縱(zong)坐標(biao)(biao)，繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲線，求(qiu)出(chu)直(zhi)線方程。將樣本(ben)的百(bai)分吸(xi)光(guang)度(du)(du)值代入標(biao)(biao)準(zhun)曲線中(zhong)，從標(biao)(biao)準(zhun)曲線上讀出(chu)樣本(ben)所對應的濃度(du)(du)，乘(cheng)以其對應的稀釋倍數即為樣本(ben)中(zhong)滅(mie)多(duo)威的實際濃度(du)(du)。