微球富集增強技術檢測循環腫瘤細胞抗原的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了微球富集增強技術檢測循環腫瘤細胞抗原的方法及試劑盒。所述方法步驟如下：1）取乳膠微球加入MES緩沖溶液HER2兔單抗抗體，BSA，HRP，EDC混合吹打均勻；在45℃振蕩反應1h；離心并用洗滌液洗滌，去上清；用封閉液定容，45℃振蕩封閉30min，離心洗滌一次；最后定容儲存備用；2）取細胞懸液于微孔反應條板中，用PBS定容，加入生物素標記EpCAM抗體和抗體標記的乳膠微球，室溫振蕩反應1h；加入鏈霉親和素磁珠，室溫下振蕩反應1h；磁分離，洗滌并且去除上清；然后進行顯色反應。一種試劑盒，包括HRP和HER2抗體標記的80nm乳膠微球。另一種試劑盒，包括80nm乳膠微球、用于標記乳膠微球的HER2兔單抗抗體和HRP。本發明靈敏度高，準確性好，具有成本優勢，便于普及應用。
【專利說明】
微球富集増強技術檢測循環腫瘤細胞抗原的方法及試劑盒
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種免疫檢測循環腫瘤細胞抗原的方法。
【背景技術】
[0002] 在全球范圍內，乳腺癌是女性群體中最常見的惡性腫瘤，在所有病例中，約有so-so% 為"最兇險的乳腺癌"一一HER2陽性乳腺癌。相對于其他類型的乳腺癌，HER2陽性乳腺 癌的疾病進展速度更快，惡性程度更高，更容易復發和轉移，預后也較差。
[0003] 中國的乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢，尤其在京、津、滬等大城市，乳腺癌已位 居女性惡性腫瘤發病率之首。根據乳腺癌的生物學特性，可以把其分成4~5個分子亞群，不 同的亞群有不同的預后和治療策略。現代醫學已經進入了乳腺癌分類治療的時代，搞清患 者的分子類型是正確治療的前提，在所有乳腺癌患者中，屬于ffiR2基因過表達者占20%-30%，和其他亞群乳腺癌相比，該類型乳腺癌患者更容易出現復發和轉移。如果只接受常規 綜合治療，J1ER2陽性乳腺癌患者的生存時間僅為HER2陰性患者的一半;相反，如果能及早確 定HER2狀態，及早采用針對性治療，與普通乳腺癌患者相比，HER2陽性患者的生存機會就會 接近HER2陰性患者。
[0004]自從1987年Slamon等發現了HER2在人類乳腺癌發病機制中的作用，而經典的抗 HER2靶向治療藥物曲妥珠單抗自1998年經美國FDA批準用于臨床以來也已應用了10余年， 認為乳腺癌HER2狀態是乳腺癌患者重要的預后因子和靶向藥物療效的預測因子。大量研究 數據和臨床實踐已使大家在抗J1ER2治療作用機制和臨床療效等方面達成一定的共識。而目 前臨床上檢測HER2狀態都是基于患者原發灶或者轉移灶組織的檢測，而這些檢測往往會受 到腫瘤組織(取材、固定和保存等操作不當）、檢測方法、腫瘤異質性或變異等影響，造成患 者的HER2狀態無法確定，特別是一些復發轉移性患者，以往腫瘤組織保存時間較長或者轉 移灶無法活檢獲取組織等情況，更無法在治療過程中對患者進行動態的監測。針對HER-2陽 性乳腺癌患者的靶向治療，目前的臨床指南是:①HER2陽性乳腺癌術后輔助治療建議使用 赫賽汀靶向治療一年為標準治療;②進展期HER-2陽性乳腺癌建議赫賽汀使用至少一年，并 推薦使用直至進展，甚至，在靶向維持治療進展后仍可繼續赫賽汀靶向治療基礎上更換新 的化療。
[0005]從HER-2陽性乳腺癌患者的生物學特征和靶向治療的療效，只有盡早、準確進行 HER2狀態的檢測，才能對患者進行復發風險度準確評估和采取正確的針對性治療(赫賽汀 等靶向藥物）。傳統對石蠟包埋組織采用常規免疫組化法和FISH(原位熒光雜交)方法對組 織標本制作和保存有較高的要求，因此，一旦這些手術或者活檢組織標本不能滿足檢測要 求，患者的HER-2狀態就無法確定，腫瘤分子分型和分類治療就無法進行，臨床上屢見這類 患者，如標本保存時間太長、術前化療前標本留取太少、以往的檢測方法不標準、反復檢測 HER-2屬于臨界狀態、患者復發轉移與原腫瘤生物學行為不符但轉移灶無法重新活檢等，臨 床上無法鑒定患者真正的HER-2狀態;HER-2靶向藥物赫賽汀本身相當昂貴，還有潛在的心 臟毒性，這使得臨床醫生在患者使用靶向治療的決策上左右為難、難以取舍。此外，除了客 觀有效率的評價之外，HER-2陽性乳腺癌患者接受靶向治療期間處于穩定或者完全緩解情 況下，目前臨床上還無法對其進行進一步的動態療效檢測，循環腫瘤標記物和循環腫瘤細 胞(CTC)檢測只能在一定程度上發揮作用，但并非真正反映體內HER-2陽性乳腺癌細胞的動 態變化和療效。
[0006] 循環腫瘤細胞(CTCs)檢測是目前公認的能夠很好監測腫瘤患者體內腫瘤負荷的 理想方法，在癌癥治療中，醫生常常希望將循環腫瘤細胞水平作為監控和調整治療和預后 的診斷依據，但傳統檢測方法往往無法準確地確定患者體內的CTCs水平，Ce 11 Search血液 中循環腫瘤細胞系統是Veridex公司專有的一項技術，已通過美國FDA準入應用于預測有轉 移性的乳腺癌、結直腸癌或前列腺癌的無進展存活率和總存活率。該檢驗方法可隨時進行， 便于對此類癌癥患者進行連續監測。在歐洲，CellSearch也被認定是一個有效的診斷檢驗 工具。我國已經完成了該項技術的臨床研究，正在向國家H)A申請批件，研究結果與國外同 類研究基本一致。CellSearch檢測的工作原理是，采用了一種可同鐵微粒相結合的抗體(稱 為鐵磁流體），這種抗體/鐵磁流體同CTCs有極強的特異性結合能力。結合后再應用強力磁 體將這些CTCs從血液樣本中提取出，達到細胞富集的作用，在進行生物或化學染色后可以 在CellSearch檢測儀上準確識別CTCs并計數。目前認為晚期乳腺癌患者檢測血液中循環腫 瘤細胞系統CTC臨界值是多5CTCs，研究已經證明，乳腺癌患者治療前多5CTCs者PFS(無進展 生存時間)較短，在治療后如果患者的循環腫瘤細胞數降低到5個以下，則其PFS將得到明顯 延長。因此，CTCs檢測對于乳腺癌患者預后和療效評估十分重要，能夠改進晚期乳腺癌的治 療策略。目前市場上CellSearch檢測儀的價格大約400萬元，不計檢測試劑，一般醫療機構 無法引進該項檢測技術，一旦引進，其檢測的價格亦不菲。因此，普通患者無法承受其作為 常規檢測，更不能作為治療期間的動態監測。
[0007] 近年來，生物分析技術與納米技術的深入結合是國際生物醫學分析技術領域的前 沿和熱點問題。與傳統材料相比，納米級的顆粒存在比表面積大和小尺寸效應等特點。而磁 性高分子微球的研究始于20世紀70年代，是利用納米技術制備出的一種具有磁性特性的微 球。此類微球一方面，它具有有機聚合物微球的眾多特性，如可通過共聚、表面改性等途徑， 賦予其表面多種反應性官能團（如羥基、氨基、羧基等），可通過吸附或共價鍵合的方式與抗 體、DNA、RNA等生物活性物質結合;另一方面，由于它具有磁性可以很方便地在外加磁場作 用下從介質中分離出來。與傳統的分離技術相比，該方法將分離與富集結合于一體，其較大 的比表面積大大提高了分離過程中反應物之間相互作用的動力學速度，具有高效、快速、非 玷污的優點。因此，磁性高分子微球被廣泛地應用作分離材料和載體，如在臨床診斷、靶向 藥物、細胞分離、細胞標記等領域有著廣闊的應用前景。

【發明內容】

[0008] 為了克服現有技術的不足，本發明提供了微球富集增強技術檢測循環腫瘤細胞抗 原的方法及試劑盒。
[0009] -種微球富集增強技術檢測循環腫瘤細胞抗原的方法，步驟如下：
[0010] 1 )HRP和HER2抗體標記乳膠微球的合成：
[0011] 取l〇〇ul固含量10%w/v 80nm乳膠微球加入MES緩沖溶液吹打均勻，再加入 0 ? 614ug HER2兔單抗抗體，90ugBSA，9ugHRP，5mg EDC并吹打均勻，總體系為lmL;在45°C振 蕩反應lh;離心并用洗滌液洗滌，去上清；用封閉液定容至原體積lmL，45°C振蕩封閉30min， 離心并用封閉液洗滌一次;最后用含有0.5%蔗糖的封閉液定容至lmL;4°C儲存備用；
[0012] 2)外周血中循環腫瘤細胞抗原的檢測：
[0013] 取10-20uL細胞懸液于微孔反應條板中，用pH為2的PBS定容至200uL，加入 luL0.0 4mg/mL的生物素標記EpCAM抗體和50uL步驟1)中抗體標記的乳膠微球，室溫振蕩反 應lh;加入2uL 1 %鏈霉親和素磁珠，室溫下振蕩反應lh;磁分離，洗滌并且去除上清；加入 100微升TMB及底物混合液和50微升1 %過氧化尿素溶液，室溫條件下避光15min，避光結束 后加入50微升硫酸終止液;磁分離，取150微升上清并在酶標儀中測量0D450。
[0014] 一種采用所述方法的試劑盒，包括HRP和HER2抗體標記的80nm乳膠微球。
[0015] 一種采用所述方法的試劑盒，包括80nm乳膠微球、用于標記乳膠微球的HER2兔單 抗抗體和HRP。
【附圖說明】
[0016]圖1是已知低濃度樣本的標準曲線；
[0017] 圖2是已知高濃度樣本的標準曲線。
【具體實施方式】
[0018] 由于納米乳膠微球具有較大的比表面積，可以成為蛋白質核酸等物質的優良載 體。本發明采用磁性微球分離與富集ffiR-2陽性乳腺癌細胞，并用小尺度的納米乳膠微球作 為固相載體同時偶聯抗體和酶分子，替代常規ELISA中的酶標抗體，操作方法如常規ELISA 操作，使用酶標儀進行讀數。相比傳統的復合反應過程納米載體能夠引入更多酶分子(如辣 根過氧化物酶HRP)，帶來更顯著的檢測信號，達到增強的作用。
[0019] -、材料和試劑
[0020]表1為藥品規格，如果沒有特別指出，為常規試劑。
[0021]表1

[0023] PBS緩沖液：8gNaCl，0 ? 2gKCl，1 ? 42gNa2HP〇4，0 ? 27gKH2P〇4溶于 1L去離子水中，調節 PH；
[0024] MES緩沖液:0? 1562gMES溶于40mL去離子水中，調節pH;
[0025]洗滌緩沖液:0.15g甘氨酸溶于lOOmLMES緩沖液中；
[0026] 封閉液:0? 15g甘氨酸，lgBSA溶于lOOmLMES緩沖液中；
[0027] R2:將0.5% (質量百分比）蔗糖溶于封閉液中；
[0028] TMB 溶液：3mgTMB 溶于 lmLDMSO 中；
[0029] 底物稀釋液:2.52g檸檬酸，3.26gNa2HP〇4,溶于120mL去離子水中；調節pH至5.5;
[0030] 1%過氧化尿素溶液：10mg過氧化尿素溶于lmL去離子水中；
[0031] 終止液:2mo 1 /L硫酸。
[0032] 二、實驗步驟
[0033] 1 )HRP和HER2抗體標記乳膠微球的合成：
[0034] 取100uL固含量10%(w/v)乳膠微球加入適量MES緩沖溶液吹打均勻，再加入 0.614ugHER2兔單克隆抗體，90ugBSA，9ugHRP，5mgEDC并吹打均勻；在金屬浴中45°C振蕩反 應lh;離心并用洗滌液洗滌3次，去上清；用封閉液定容至lmL，在金屬浴中45°C振蕩封閉 30min離心并用封閉液洗滌一次;最后用R2定容至lmL;4°C儲存備用。
[0035] 2)外周血中循環腫瘤細胞抗原的檢測：
[0036] 取10-20uL細胞懸液于微孔反應條板中，用pH為2的roS定容至200uL，加入0.04ug 生物素標記EpCAM鼠單抗(0.04mg/mL)和50uLHRP和HER2抗體標記的乳膠微球，室溫條件下 振蕩反應lh;加入2uLl % (w/v固含量)鏈霉親和素磁珠，室溫下振蕩反應lh;磁分離，洗滌3 次并且去除上清;取100uL 3mg/mL的TMB溶液和1.9ml底物稀釋液配成TMB及底物混合液，并 向上述沉淀中加入100uL TMB混合液和50uL 1 %過氧化尿素溶液，室溫條件下避光15min， 避光結束后加入50uL硫酸終止液;磁分離，取150uL上清于干凈的96孔板中，并在酶標儀中 測量0D450。
[0037]三、結果
[0038] 1、線性范圍
[0039] 線性范圍評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據，也是產品注冊所需的重 要申報資料之一。
[0040] 當需要測定溶液的濃度時，不論溶液的濃度是試劑本身的濃度，還是試劑和樣本 (如血清、質控品、標準品、校準品）反應的濃度，通常采用濃度和吸光度之間建立標準曲線 的方法測定，若證明這種標準曲線是否存在線性關系，做法是根據WS/T124《臨床化學體外 診斷試劑盒質量檢驗總則》關于線性范圍的規定，把選取的溶液濃度范圍取6點，包括濃度 的下限（或〇)、中間值及上限，每點重復測定3次吸光度。根據公式計算出直線方程y = a+bx 和回歸系數。
[0041] 當濃度和吸光度之間有了直線方程y = a+bx的關系，就可以快捷的通過溶液的吸 光度值計算出對應的濃度。利用線性范圍公式的計算，推證出完善的校準曲線，從而為檢測 試劑的靈敏度、準確度、精密度打好基礎。
[0042] 1)試劑線性實驗1
[0043]按上述檢測試劑盒的使用方法，取5種已知低濃度的樣本，每個樣本測定3次，取平 均值，結果如圖1所示。
[0044] 2)試劑線性實驗2
[0045] 按上述檢測試劑盒的使用方法，取5種已知高濃度的樣本，每個樣本測定3次，取平 均值，結果如圖2所示。
[0046] 2、精密度
[0047] 精密度是考察試劑盒對同一樣本重復測定時能否得到相同實驗結果的能力的指 標，通常用重復多次樣本測量結果的變異系數(CV%)表示，精密度評價是質量控制的重要 內容。精密度評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據，也是產品注冊所需的重要申 報資料之一。
[0048] 批內精密度是眾多種類精密度中最基本的一個，它是在嚴格的相似條件下，所得 到的最佳的精密度。
[0049] 按上述檢測試劑盒的使用方法，在檢測范圍內取兩個不同細胞數的樣本進行測 定，每個樣本測定7次，將7次檢測結果計算平均值，標準差和變異系數，結果如下表2所示。
[0050] 表 2
[0052] 3、準確度
[0053]很多臨床實驗室內部，通常會有兩個以上的檢測系統，多個檢測系統之間應該定 期進行比對。對于開放檢測系統，也應該對系統進行驗證，其中最重要的一項便是準確度的 評價，準確度評價可以通過方法學比對來實現，利用兩種方法的比對對比配套系統的準確 度進行評估是評估準確度的方法之一。準確度評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依 據，也是產品注冊所需的重要申報資料之一。
[0054] 按上述檢測試劑盒的使用方法，取具有溯源性的標準品，用試劑進行檢測，檢測7 次，計算平均值與靶值進行對照，結果如下表3所示。
[0055] 表 3
[0057] 4、靈敏度
[0058] 按上述檢測試劑盒的使用方法，測定7種不同細胞濃度的樣品，每個樣品測7次，通 過計算變異系數(CV%)，定義開始大于20%的點即為該試劑盒的靈敏度，本發明的檢測試 劑盒的靈敏度為3個/7.5mL，結果如下表4所示。
[0059] 表 4
[0061 ] 5、穩定性
[0062] 穩定性試驗
[0063] 在2~8°C貯存條件下，分別在0月，4月，8月，12月和14月對同一濃度的細胞進行測 定，每個樣本測5次，取均值。結果表明，4月，8月，12月，14月與0月相比，測得的差異很小，說 明本發明的檢測試劑盒在2~8°C貯存條件下可穩定一年，結果如下表5所示。
[0064] 表 5
[0066]試劑開封后，在30天內，30次測定同一濃度的抗體樣本的吸光度均值、最大值、最 小值、標準差和吸光度變異系數，可見本試劑盒試劑在開封后，可穩定一個月以上，結果如 表6所示。
[0067]表 6
【主權項】
1. 一種微球富集增強技術檢測循環腫瘤細胞抗原的方法，其特征在于，步驟如下： I )HRP和HER2抗體標記乳膠微球的合成： 取IOOul固含量10% w/v 80nm乳膠微球加入MES緩沖溶液吹打均勻，再加入0.614ug HER2兔單抗抗體，90ug BSA，9ug HRP，5mg EDC并吹打均勻，總體系為ImL;在45°C振蕩反應 Ih;離心并用洗滌液洗滌，去上清；用封閉液定容至原體積ImL，45 °C振蕩封閉30min，離心 并用封閉液洗滌一次;最后用含有0.5%蔗糖的封閉液定容至ImL; 4°C儲存備用； 2)外周血中循環腫瘤細胞抗原的檢測： 取10-20uL細胞懸液于微孔反應條板中，用pH為2的PBS定容至200uL，加 IuL 0 · 04mg/mL 的生物素標記EpCAM抗體和50uL步驟1)中抗體標記的乳膠微球，室溫振蕩反應Ih;加入2 uL 1%鏈霉親和素磁珠，室溫下振蕩反應Ih;磁分離，洗滌并且去除上清;加入100微升TMB及底 物混合液和50微升1%過氧化尿素溶液，室溫條件下避光15min，避光結束后加入50微升硫酸 終止液;磁分離，取150微升上清并在酶標儀中測量0D450。2. -種采用如權利要求1所述方法的試劑盒，其特征在于，包括HRP和HER2抗體標記的 80nm乳膠微球。3. -種采用如權利要求1所述方法的試劑盒，其特征在于，包括SOnm乳膠微球、用于標 記乳膠微球的HER2兔單抗抗體和HRP。
【文檔編號】G01N33/577GK105891492SQ201610327849
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】沈曉亮, 王曉稼, 趙甜甜
【申請人】浙江天科高新技術發展有限公司, 浙江省腫瘤醫院