本發明屬于生物醫學診斷
技術領域：
，具體涉及一種快速檢測血液中肝素結合蛋白濃度的方法及相應的試劑盒。
背景技術：
：肝素結合蛋白是分子量為37kda的糖蛋白，主要是在嗜中性粒細胞中合成。結構上肝素結合蛋白屬于絲氨酸蛋白酶超家族，盡管它與人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶具有45％的序列同一性，但其作為蛋白酶是無活性的。對肝素結合蛋白的研究最初是由于其具有抗菌的活性，后來的研究發現肝素結合蛋白參與多個炎癥反應過程。嗜中性粒細胞與內皮細胞接觸時被活化，活化嗜中性粒細胞釋放肝素結合蛋白。肝素結合蛋白引起內皮細胞鈣依賴性細胞骨架重排，從而導致細胞收縮并增加內皮細胞的通透性。它被內皮細胞內在化，以防止細胞凋亡。當m蛋白質從細菌細胞表面釋放時，m蛋白質和纖維蛋白原形成的m蛋白/纖維蛋白原復合物。m蛋白/纖維蛋白原復合物與嗜中性粒細胞表面上的整合素相互作用，嗜中性粒細胞被活化釋放肝素結合蛋白。在感染部位，在吞噬過程中，azurophil顆粒可以分泌肝素結合蛋白，肝素結合蛋白表現出其抗菌活性。并且肝素結合蛋白激活單核細胞和其它炎癥介質，并將這些活化的炎癥介質吸引到感染的部位。肝素結合蛋白可被單核細胞吞噬內化，內化的肝素結合蛋白可延長單核細胞的壽命，刺激單核細胞分泌其它細胞因子。這些結果顯示肝素結合蛋白直接參與炎癥過程。大量的臨床數據表明在發生敗血癥之前的幾個小時患者血漿肝素結合蛋白水平增加顯著增加。肝素結合蛋白可以作為一個檢測敗血癥發生的有效的生物靶標。膿毒病是身體對感染的全身炎癥反應，可以進展到嚴重的敗血癥，甚至敗血性休克，最終多器官功能衰竭導致死亡。全世界每年有超過1800萬例嚴重膿毒病例，美國每年有215,000例因膿毒引起的死亡病例，遠遠超過因前列腺癌，結腸直腸癌和乳腺癌而死亡人數之和。近年來由于抗生素的濫用，導致細菌耐藥性上升，以及免疫抑制劑的使用，和人口老齡化膿毒癥病例數量每年都在增加。早期準確診斷和治療對于嚴重膿毒癥的患者的生存至關重要-有研究表明對于膿毒癥治療每延遲的一小時，因嚴重膿毒癥而死亡機率增加7.5％。目前檢測感染炎癥發生的指標主要有pct，crp，wbc，lactate以及il6。大量的研究結果表明肝素結合蛋白(hbp)可作為感染炎癥發生檢測的一個重要的指標(clinicalinfectiousdiseases2009；49:1044-50)。從表中的結果可看到以肝素結合蛋白為檢測靶標更能準確的，特異的預測敗血癥的發生。目前在國外檢測肝素結合蛋白的方法主要是基于酶聯免疫的檢測試劑盒。酶聯免疫檢測方法準確性好，靈敏度高，但檢測速度不快，耗時耗力，最快也要4個小時才能出結果。目前臨床上尚無可快速定量的肝素結合蛋白檢測方法。例如，中國專利cn204882574u公開了一種用于肝素結合蛋白定量檢測試劑盒的檢測板，利用膠體金免疫層析法檢測肝素結合蛋白的濃度，該方法操作簡單，快速，但不能定量，準確度較低。中國專利cn105572386a公開了一種免疫熒光層析法檢測肝素結合蛋白用試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括第一緩沖液、第二緩沖液和試劑卡；第一緩沖液為含有0.83～2ng/μl兔抗人肝素結合蛋白抗體的磷酸鹽緩沖液；第二緩沖液為含有0.05～0.2μg/μl熒光標記的雞抗兔二抗的磷酸鹽緩沖液。cn204882575u公開了一種用于肝素結合蛋白熒光免疫層析法定量檢測試劑盒的檢測板。這些文獻中使用的免疫熒光流相層析法都有方法本身的缺陷，首先免疫熒光流相層析法只能進行半定量的檢測，很難準確測定，再者由于包被的抗體有限，在抗原濃度高時很容易產生倒鉤效應，出現假陰性結果，因此線性范圍不是很大。此外，這種方法每次只能測一個樣品，沒法進行自動化，而且對操作人員操作要求很高。由于抗原抗體反應是一個動態的過程，受到抗體濃度，反應溫度，反應時間的影響。不同的人操作，加樣量的差異，培育時間的差異，檢測環境溫度的差異，都可能導致不同的測定結果。技術實現要素：本發明技術方案針對現有技術不足，基于免疫膠乳濁度分析法，利用抗體和膠乳顆粒共價交聯后與抗原結合形成復合物，根據濁度增加來測定抗原濃度，提供了一種定量檢測血液中肝素結合蛋白濃度的方法及試劑盒。本發明所述方法操作簡單，準確度高，能準確定量，可以用在自動生化儀上對人肝素結合蛋白的檢測，適合用于人肝素結合蛋白的檢測。本發明技術方案如下：一種快速檢測血液中肝素結合蛋白濃度的方法，采用膠乳增強免疫比濁法，使用肝素結合蛋白抗體和膠乳顆粒共價交聯，制得抗體-膠乳顆粒復合物，當抗體-膠乳顆粒復合物與血液中的肝素結合蛋白特異性結合后，抗體-膠乳顆粒復合物發生聚合行成更大的顆粒，從而使得溶液的吸光度增加，吸光度的增加和血液中的肝素結合蛋白濃度程正相關，通過檢測吸光度測定肝素結合蛋白濃度。本發明所述膠乳選自自羧基化聚苯乙烯膠、氨基化聚苯乙烯膠，羧基化硅膠、氨基化硅膠，聚甲基丙烯酸甲酯膠，聚苯乙烯-二乙烯基苯膠中的一種或幾種。優選羧基化聚苯乙烯膠。可采用如下方法制備抗體-膠乳顆粒復合物：將膠乳顆粒溶液加入mes緩沖液中，加入交聯劑，攪拌孵育制得活化的膠乳顆粒溶液，之后與抗肝素結合蛋白抗體混合，攪拌孵育、離心、洗滌后用tris緩沖液重懸制得抗體-膠乳顆粒復合物。所述膠乳顆粒溶液濃度為5-20mg/ml，活化的膠乳顆粒溶液濃度為5-20mg/ml，抗體-膠乳顆粒復合物濃度為5-20mg/ml。所述交聯劑選自edac(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)和/或cmc(1-cyclohexyl-2-(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate)。優選edac。本發明的另一目的在于提供一種快速檢測血液中肝素結合蛋白濃度的試劑，包括試劑1和試劑2，試劑1包括緩沖液和表面活性劑，試劑2包括緩沖液、穩定劑和抗體-膠乳顆粒復合物。所述緩沖液選自ph為6.5-9.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，三羥甲基氨基甲烷-咪唑緩沖液或者咪唑-鹽酸緩沖液。為了保證緩沖溶液中的離子強度，可以選擇添加無機鹽如氯化鉀和/或氯化鈉等，優選工作濃度為0.01-0.25mol/l。進一步的，所述試劑1和試劑2還可以含有防腐劑，如疊氮鈉或者proclin300，優選工作濃度為0.02-0.5％。本發明的一個優選方案，試劑1包括ph為8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，nacl、peg6000、tween-20和nan3。進一步優選ph為8.0的0.05mol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，0.9％nacl，2％peg6000和0.05％tween-20，0.05％nan3。(％為重量體積百分比)。試劑2包括ph為8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，牛血清白蛋白bsa和抗體-膠乳顆粒復合物和nan3。進一步優選ph為8.0的0.05mol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，10g/l的牛血清白蛋白bsa、0.1～0.25％抗體-膠乳顆粒復合物、0.05％nan3。(％為重量體積百分比)。本發明優點：本發明采用的免疫比濁法是基于抗原抗體結合形成復合物，使得濁度增加來測定抗原或抗體的濃度的一種方法，操作簡單，準確度高，且能準確定量，可以用在自動生化儀上對人肝素結合蛋白的檢測，最適合用于人肝素結合蛋白的檢測。附圖說明圖1為本發明實施例4的標準曲線。圖2為本發明實施例6的線性回歸曲線。具體實施方式在本發明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體實施例并參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，該實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。下述實例中所用的材料、試劑、裝置、儀器、設備等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1抗人肝素結合蛋白單克隆抗體的制備重組人肝素結合蛋白可以購買。按照參考文獻的方法來制備抗人肝素結合蛋白單克隆抗體(nature，1975，256：495-497)。具體說，將完全福氏佐劑與人肝素結合蛋白溶液按1:1的比例混合制成乳劑。腹腔注射免疫6-8周齡雌性balb/c小鼠(每只小鼠100μl，含10μg人肝素結合蛋白)。兩周后以不完全福氏佐劑腹腔注射10μg人肝素結合蛋白加強免疫小鼠。兩周后取血測定抗體的效價。經尾靜脈注射10μg人肝素結合蛋白加強免疫小鼠，四天后，將小鼠處死，分離脾臟細胞，將分離的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞sp2/0細胞以50％peg介導融合。陽性克隆用酶聯免疫法篩選。參照中國專利cn104020289a公開的方法篩選出配對抗體1和抗體2。實施例2抗人肝素結合蛋白抗體-膠乳顆粒復合物的制備(1)膠乳顆粒的活化將100μl濃度為10％的羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒溶液加入1.0ml，ph5.4的50mmmes緩沖液中，混勻，再加入20μl濃度為10mg/ml的edac，在37℃的條件下，攪拌孵育0.5～1h，13000rpm離心30分鐘，小心棄去上清液。將沉淀懸浮于50mm、ph7.4的pbs緩沖液中，13000rpm離心30分鐘，小心棄去上清液，重復洗滌兩次，最后將沉淀重懸浮于1mlph7.4的50mmpbs緩沖液中，使最終溶液中聚苯乙烯膠乳顆粒的固體百分含量為20mg/ml。(2)交聯緩沖液的選擇按步驟(1)將膠乳活化，將化后的膠乳分別重懸浮于mes，mopos或pbs緩沖液中，將活化后的羧基化聚苯乙烯膠乳微球溶液與等體積的濃度為20mg/ml的抗肝素結合蛋白抗體溶液混合，在37℃的條件下，攪拌孵育2h。13000rpm離心20分鐘，收集上清液，測定上清液中抗體蛋白質含量，計算交聯量＝(抗體交聯的起始量-上清的抗體含量)/抗體交聯的起始量x100％。結果如表1所示。表1不同交聯緩沖液的交聯率抗體mesmopospbs抗體140％70％80％抗體260％50％90％結果顯示利用pbs作為交聯緩沖液，配對抗體的兩個抗體，抗體1和抗體2交聯率都很高。選取pbs作為交聯緩沖液。(3)抗體和膠乳得共價交聯將100μl濃度為100mg/ml的羧基化聚苯乙烯膠乳顆粒溶液加入1.0ml，ph5.4的50mmmes緩沖液中，混勻，再加入20μl濃度為10mg/ml的edac，在37℃的條件下，攪拌孵育0.5～1h，13000rpm離心30分鐘，小心棄去上清液。將沉淀懸浮于50mm、ph7.4的pbs緩沖液中，13000rpm離心30分鐘，小心棄去上清液，重復洗滌兩次，最后將沉淀重懸浮于1mlph7.4的50mmpbs緩沖液中，使最終溶液中聚苯乙烯膠乳顆粒的固體百分含量為20mg/ml，加入等體積得濃度為20mg/ml的抗肝素結合蛋白抗體溶液(10mg/ml抗體1和10mg/ml抗體2)，混合均勻，在37℃的條件下，攪拌孵育2h。13000rpm離心20分鐘，去上清液，再用50mm、ph7.4的pbs緩沖液洗滌兩次，最后用50mmtris-hcl、1％bsa、0.05％疊氮鈉ph7.4的緩沖液重懸浮抗體-膠乳顆粒復合物，使最終致敏聚苯乙烯膠乳顆粒的固體含量約為0.1～0.25％。實施例3肝素結合蛋白檢測試劑的制備(1)試劑1的配制稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷(tris)、9g氯化鈉、40gpeg6000、0.5mltween-20、0.5gnan3溶于0.8l去離子水，用稀鹽酸調ph至7.4，定容至1l即得試劑1。試劑1中各組分的含量分別為0.05mol/ltris，0.9％nacl，2％peg6000，0.05％tween-20，0.05％nan3，ph8.0。(2)試劑2的配制用濃度為50mm/l的tris-hcl緩沖液將實施例2制備的抗體-膠乳顆粒復合物按一定的比例進行稀釋，使浮抗體-膠乳顆粒復合物的固體含量約為0.1～0.25％，加入牛血清白蛋白bsa，使其終濃度為10g/l，加入疊氮鈉，其終濃度為0.5g/l，即可制成試劑2。實施例4標準曲線的建立測定條件：樣品量為5μl，200μl試劑1,，40μl試劑2，用兩點終止法，主波長為575納米，副波長為700納米。測定方法：將標準品稀釋成濃度分別為0，5，10，25，50，100ng/ml,取5μl樣品，加入200μl試劑1孵育3分鐘，加入40μl的試劑2，用兩點終止法測定反應度的變化，每個濃度測3次，取平均值，以濃度為橫坐標，反應度為縱坐標作標準曲線，結果如圖1所示。實施例5膠乳顆粒大小的選擇按照實例2將抗肝素結合蛋白抗體與粒徑大小分別為100nm，200nm，300nm的聚苯乙烯膠乳顆粒交聯，按照實例3制備肝素結合蛋白檢測試劑，按照實例4建立標準曲線，對濃度為1ng/ml的肝素結合蛋白質控品進行測定，共測定10次取平均值。計算cv。結果如表2所示。表2不同大小的膠乳顆粒對精確度的影響100nm200nm300nm11.001.311.1521.021.151.1230.991.141.1441.11.091.0950.981.051.0861.21.021.0570.991.011.2180.981.071.1590.991.191.03101.031.031.17平均值1.0281.1061.119cv2.8％10.6％11.9％結果顯示利用粒徑大小為100nm的聚苯乙烯膠乳顆粒制備肝素結合蛋白檢測試劑，精確度最好。實例6線性范圍的測定將接近濃度為110ng/ml的高值樣本用緩沖液稀釋成濃度為80，30，7.5，3ng/ml共得4個不同濃度的溶液，按實施例5所述方法測定，每個濃度測定3次，對實測平均值與相應理論值作回歸分析，表明本發明所述試劑在3-110ng/ml線性范圍內相關性較好(r2>0.99)，結果如圖2所示。實例7穩定性的測定將本發明所述試劑1和試劑2置于4℃，37℃每隔7天檢測一次，取出按實例5所述方法測定標示值為25ng/ml的校準品，各重復測定3次，計算檢測平均值實驗。結果如表3所示，結果表明，本發明所述試劑穩定性較好。表3穩定性的測定結果天數4℃37℃025.2ng/ml25.2ng/ml725.3ng/ml25.1ng/ml1425.4ng/ml25.3ng/ml2125.2ng/ml24.8ng/ml2825.6ng/ml25.1ng/ml當前第1頁12