一組結腸癌轉移相關腫瘤間質標志物及應用
【專利摘要】本發明公開了一組結腸癌轉移相關腫瘤間質標志物，該組標志物存在于腫瘤間質中，隨著癌變進展標志物表達異常也更顯著。其中標志物Tenascin?C是一種新的細胞外基質標志物，且在腫瘤癌變早期就已表達異常，而且在轉移部位也表達異常，其中腫瘤自身分泌該標志物與其轉移能力相關。該組標志物可用于制備篩查和輔助診斷結腸癌轉移藥物及試劑盒。
【專利說明】
一組結腸癌轉移相關腫瘤間質標志物及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一組結腸癌轉移相關腫瘤間質標志物及應 用。
【背景技術】
[0002] 結腸癌（colon cancer，CC)是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率有著明 顯上升趨勢。在全世界范圍內每年有超過上百萬人深受其影響，而且發現時大部分已處于 中晚期，嚴重威脅著人類健康。腫瘤的發生和轉移與腫瘤細胞所處的微環境有著密切關系。 因此從結腸癌癌變過程中微環境中篩選關鍵蛋白質對深入理解癌變機制、尋找診斷和治療 靶標、預防腫瘤發生具有十分重要意義。
[0003] 目前，結腸癌診斷和治療還依賴于組織形態學手段，缺乏有效的分子診斷技術。從 而導致診斷不及時，或確診時大多數已是晚期，對早期轉移和微轉移無法及時發現，導致治 療延誤。為此篩選早期和轉移標志物對提高結腸癌治療效果具有重要意義。

【發明內容】

[0004] 因此，本發明旨在克服現有技術中診斷分子不夠特異、不能準確早期診斷的問題。 提供一組新的細胞外基質標志物，可用于結腸癌轉移的診斷和早期篩查。其中所述結腸癌 轉移相關腫瘤間質標志物為所述標志物為Tenascin-C(TNC)，Protein S100-A9(S100A9)， Protein S100-A8(S100A8),Pyruvate kinase PKM(PKM),Endoplasmin(HSP90Bl), Calumenin(CALU),Calreticulin(CALR),Galectin-1(LGALS1),Dermcidin(DCD), Chromogranin-A(CHGA),Tryptase alpha/beta-1(TPSAB1),Nidogen_l(NIDI),Laminin subunit alpha_4(LAMA4),Serum amyloid P-component(APCS)，該標志物存在于腫瘤間質 中，且在腫瘤癌變早期就已表達異常，而且在轉移部位也表達異常。其中腫瘤自身分泌該標 志物與其轉移能力相關。這些標志物還可用于制備篩查和輔助診斷結腸癌轉移藥物及試劑 盒。
[0005] 所述標志物是通過前期采用定量蛋白質組學技術，比較分析結腸癌癌變不同階段 的間質表達蛋白質的變化規律，篩選與癌變顯著相關的蛋白質分子。并進一步通過分析臨 床樣本核實最終確定的。
[0006] 本發明的研究主要包括四個方面的內容：腫瘤間質標志物的篩選，胞外基質標志 物Tenascin-C的表達驗證，Tenascin-C與臨床病理特征的關系，腫瘤自分泌Tenascin-C與 其轉移的關系。
[0007] 具體的技術方案如下：
[0008] 結腸癌起源于正常結腸上皮細胞，為此我們收集了結腸癌癌變過程中四個典型階 段的結腸組織(正常結腸上皮，腺瘤，原位癌和浸潤癌），通過激光顯微切割搜集結腸上皮細 胞周圍的間質成分，抽提間質蛋白質后，酶解后采用iTRAQ標記試劑分別標記這四種蛋白質 樣品。將標記后的樣品等量混合后，采用離子交換色譜法分離為10個組分，每一組分通過 LC-MS/MS進行檢測，生物信息學鑒定和定量蛋白質。篩選差異表達蛋白質。根據差異表達蛋 白質的亞細胞定位進一步篩選出7個分泌蛋白和7個細胞外基質蛋白為結腸癌轉移相關標 志物。Protein S10〇-A9，Tenascin-C，Protein S10〇-A8，Pyruvate kinase PKM， ￡]1(1〇卩1&8111；[11，0&111111611；[11，0&1代1：；[(3111；[11在癌變早期表達上調 。而6&16(31：；[11-1，061'111(^(1；[11， Chromogranin_A，Tryptase Alpha/beta-1,Nidogen-l,Laminin subunit alpha-4,Serum amyloid P-component?表達水平在癌變早期即低表達。
[0009]采用免疫組織化學技術分析不同階段的石蠟包埋組織中Tenascin-C的表達情況， 證實Tenascin-C主要表達于腫瘤間質中。經半定量分析確認Tenascin-C表達規律與蛋白質 組學發現結果一致。
[0010]進一步統計分析Tenascin-C表達水平與臨床病理特征的相關性進行了分析，發現 Tenascin-C表達水平與腫瘤TNM分期，轉移相關。
[0011 ] 采用Western-blot分析了不同轉移潛能的結腸癌細胞株中Tenascin-C表達，發現 高轉移潛能結腸癌細胞中Tenascin-C弱表達，而其分泌物中大量Tenascin-C。而低轉移或 無轉移能力結腸癌細胞中Tenascin-C幾乎無表達。而進一步采用免疫組織化學對結腸癌轉 移淋巴結中Tenasc in-C分析發現轉移淋巴結中高表達。而無轉移的淋巴結中無表達。再次 證實腫瘤細胞自身分泌Tenascin-C與其轉移潛能密切相關。
[0012]總之，本發明
【申請人】采用激光顯微切割(LCM)技術純化獲取正常結腸粘膜上皮、腺 瘤性息肉、原位癌和浸潤癌等各階段的間質細胞(stromal cells)，然后采用同位素標記相 對和絕對定量技術(iTRAQ)聯合液相色譜-串聯質譜(Nano LC-MS/MS)技術分離鑒定從正常 上皮細胞到浸潤癌細胞癌變各階段的間質間差異表達的蛋白質，進一步對這些差異蛋白篩 選獲得了存在于細胞外的間質蛋白質，可作為結腸癌間質標志物。發現基質蛋白Tenascin-C與腫瘤轉移相關。腫瘤細胞自分泌Tenascin-C與其轉移潛能相關。轉移性淋巴結中 Tenascin-C同樣高表達，與轉移相關。多階段研究發現在癌變早期Tenasc in-C已表達異常。 因此我們發現了一個預測轉移和協助早期轉移診斷的分子Tenascin-C，為結腸癌診斷、轉 移篩查提供了手段。
【附圖說明】
[0013]圖1:采用激光顯微切割技術(LCM)分離純化結腸癌癌變不同階段結腸上皮細胞間 質組分；圖中所示為結腸癌癌變四個階段(正常結腸粘膜NCM，腺瘤性息肉ACP，原位癌CIS， 浸潤癌ICC)顯微切割前后的組織，以及相應的切割部分的組織照片；
[0014] 圖2:采用重復實驗變異度累積函數曲線確定顯著性差異倍數閾值。圖中在累積頻 率大于90%時變異度為50 %，表明90 %的蛋白其差異變化小于50 %，即大于1.5或小于0.67 為差異表達標準；
[0015] 圖3:采用定量蛋白質組學技術分析結腸癌癌變不同階段間質標志物表達情況;A 為7個表達上調標志物各階段表達水平，B為7個表達下調的標志物各階段的表達水平；
[0016] 圖4:采用免疫組織化學技術分析靶標蛋白在不同階段組織中的表達情況;A為 NCM，B為ACP，C為ClS，D為ICC;
[0017]圖5:western_blot分析不同轉移能力結腸癌細胞總蛋白及分泌上清中革巴標蛋白 表達情況；圖中上部為五種結腸癌細胞(抝!116-，11(：1'116+，31620,31480，耵29)及正常結腸 上皮細胞NCM460總蛋白中靶標蛋白的表達;圖下部為六種細胞培養上清中靶標蛋白的表達 水平；
[0018]圖6:免疫組織化學分析轉移淋巴結中靶標蛋白的表達情況;A為有無腫瘤轉移淋 巴結，B為腫瘤轉移淋巴結。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] 結腸癌癌變間質差異表達蛋白分析
[0021] 搜集結腸癌癌變過程中的四個典型階段(正常，腺瘤性息肉，原位癌，浸潤癌）的病 理組織。切片染色后，并經病理專家確認。將組織經冷凍切片后，貼于顯微切割專用膜片上， 在75%乙醇溶液中固定30秒，0.5%甲基綠染色。染色后切片空氣干燥備用。染色后切片進 行激光顯微切割。在顯微鏡下選取一致性大于95%的區域進行切割，搜集切割組分。
[0022]結果如圖1所示，通過顯微切割，結腸上皮細胞周圍的間質組織被有效分離并收 集。由此說明后續鑒定蛋白均來自于間質組織。
[0023] 實施例2
[0024] 將搜集到的不同階段的間質組分進行蛋白提取:將間質組分溶解于適量裂解液 (7M Urea，2M Thiourea，65mM DTT，0.1mM PMSF)中4°C裂解 1 小時后，12000rpm離心30分鐘 搜集上清。采用2D定量試劑盒進行蛋白質濃度測定。將相同階段的不同個體樣本進行等量 混合，形成四個階段的混合蛋白樣本進行后續標記實驗。
[0025] 按照iTRAQ試劑盒標準流程進行樣品標記:4個混合蛋白樣品，各取100ug，經還原， 烷基化后37°C酶解過夜。酶解后的肽段采用采用8通道(8plex)iTRAQ試劑進行標記(標記試 劑114，118標記NCM間質；試劑113，117標記ACP間質；試劑115，119標記Cl S間質;試劑116， 121標記ICC間質）。標記結束后將肽段混合。
[0026] 混合肽段進行強陽離子交換色譜分離成10個組分。每個組分在經Triple T0F 5600質譜采集數據。上述實驗重復3次。數據采集完畢后導入?仰丨以#11的4.2軟件中進行 蛋白鑒定和定量分析。鑒定和定量結果導出到excel表格中進行后續分析。
[0027] 蛋白鑒定可信度閾值設定為:unused ProtScore大于1.3(95%可信區間）。如圖2 采用變異度累積分布曲線確定顯著性差異倍數的閾值(>1.5或〈0.67)。根據實驗設計可知， 每次實驗中每個樣品進行了雙標記，同時又進行了三次重復。因此每個樣品產生6個測量 值。對差異蛋白要求在6次測量中必需有4次>1.5或〈0.67。
[0028] 對差異蛋白的亞細胞定位篩選的得到僅表達于細胞外的間質蛋白，即為結腸癌間 質標志物。結果如圖3所示，這些標志物在結腸癌癌變不同階段的表達水平變化情況。（見表 1) 〇
[0029] 實施例3
[0030] Tenascin-C在不同階段組織中表達情況(見表2)
[0031] 搜集50例NCM，50例ACP，30例CIS和63例ICC石蠟包埋組織切片。切片脫蠟后，與 Tenascin-C抗體（1:1000)孵育過夜，與過氧化物酶標記二抗反應后，DAB顯色。切片經蘇木 素復染。在顯微鏡下對每張切片陽性密度、染色強度進行計分。計分范圍為0-6七級:0，1，2 為無表達;3，4為低表達，5，6為高表達。染色結果如圖4所示。
[0032] 結果如表2所示：正常間質中74 %為無表達，22 %低表達，僅2 %高表達。而浸潤腫 瘤間質中僅16 %低表達，45 %高表達，統計顯示差異具有顯著性。說明間質中Tenascin-C在 癌變過程中高表達，與癌變過程相關。
[0033] 實施例4
[0034] Tenascin-C在不同結腸細胞中的表達情況
[0035] 培養不同結腸癌細胞系肌!'116-，11(：1'116+，31620,31480，耵29及正常結腸細胞 NCM460。接種細胞與培養瓶中，待生長到80%融合時，用PBS洗滌細胞，換無血清培養基培養 24小時，搜集條件培養基。經0.45um濾膜過濾，經3kD濾膜濃縮。采用Bradford定量試劑盒測 定蛋白質濃度。細胞經NP_40buffer(20mM TrispH7.5，150mm NaCL，lmM EDTA，l%NP-40, protein inhibitor cocktail)裂解，BCA試劑盒測定蛋白濃度。
[0036] 上述樣本進行常規western-blot分析Tenascin-C表達情況。
[0037]如圖5所示在細胞總蛋白中僅有高轉移細胞株SW620中弱表達。而在條件培養基中 SW620高表達。結果顯示在高轉移結腸癌細胞中Tenascin-C表達，且向胞外分泌Tenascin-C，這表明腫瘤細胞分泌Tenascin-C與其轉移潛能相關。
[0038] 實施例5
[0039] Tenascin-C與腫瘤轉移關系
[0040] 通過對不同樣本Tenascin-C表達情況與其臨床病理資料統計匯總，并進行關聯分 析。結果如表所示Tenascin-C與性別、年齡無關(p-value>0.05)，與TNM分期和轉移相關(口-value〈0 ? 05)。（見表3)。
[0041]為此進一步對搜集了轉移性淋巴結與無轉移淋巴結，免疫組織化學分析 Tenascin-C在淋巴結中的表達情況。見表4。
[0042] 結果如圖6所不，在轉移性淋巴結中Tenascin_C高表達，而無轉移淋巴結中 Tenascin-C為陰性。對31例轉移淋巴結及10例無轉移淋巴結統計。結果如表所示，55%的轉 移淋巴結中Tenascin-C高表達，與無轉移淋巴結比較具有統計學差異(p_value〈0.05)。
[0043]表1應用蛋白質組學技術鑒定的結腸癌轉移相關間質標志物
[0045] 表2免疫組織化學分析結腸癌癌變不同階段間質Tenascin-C表達
[0047] a與正常間質比較，b與腺瘤息肉間質比較，c與原位癌間質比較.（Mann-Whitney U test 石角定 p-value)
[0048] 表3結腸癌Tenascin-C表達水平與臨床病理因素關系
[0050] Mann-Whitney U test確定p-value
[0051 ] 表4 Tenascin-C表達水平與結腸癌淋巴結轉移的關系
[0053] Mann-Whitney U test確定p-value
【主權項】
1. 一組結腸癌轉移相關腫瘤間質標志物，其特征在于，所述標志物為Tenascin-C， Protein S100-A9,Protein S100-A8,Pyruvate kinase PKM,EndoplasminjCalumenin, CalreticulinjGalectin-IjDermcidin,Chromogranin-A,Tryptase alpha/beta-1， Nidogen-I,Laminin subunit alpha-4,Serum amyloid P_component〇2. 如權利要求1所述標志物在制備篩查和輔助診斷結腸癌轉移藥物中的應用。3. 如權利要求1所述標志物在制備篩查和輔助診斷結腸癌轉移試劑盒中的應用。
【文檔編號】G01N33/574GK105891484SQ201610296655
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】李茂玉, 陳永恒, 陳主初, 彭芳, 黃英
【申請人】中南大學湘雅醫院