溫度判斷方法、目標肽的檢測方法及溫度判斷試劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供溫度判斷方法。溫度判斷方法包括將含白蛋白的樣品和溫度判斷用肽混合的工序、加熱混合物的工序、檢測混合物的加熱前后的光學變化的工序及基于光學變化的檢測結果，判斷混合物的溫度升高至指定溫度與否的工序。溫度判斷用肽與白蛋白的結合的Kd是500μM以上，含第1標記物質和第2標記物質。
【專利說明】溫度判斷方法、目標肽的檢測方法及溫度判斷試劑 【技術領域】
[0001] 本發明涉及溫度判斷方法、目標肽的檢測方法及溫度判斷試劑。 【【背景技術】】
[0002] 含白蛋白的樣品中所含的疾病標志物等的目標肽有時與白蛋白形成復合物。從 而，作為使肽從白蛋白游離的方法，例如，美國專利申請公開第2012/027740號說明書中記 載的方法等被提議。
[0003] 在美國專利申請公開第2012/027740號說明書中記載的方法中，通過將含肽和白 蛋白的復合物的樣品在指定溫度加熱而使白蛋白自身會合，由此使肽從白蛋白游離。 【
【發明內容】
】
[0004] 【發明要解決的技術課題】
[0005] 本發明提供可簡便地判斷加熱處理中的樣品的溫度是否達到指定溫度的溫度判 斷方法及溫度判斷試劑以及使用這些的目標肽的檢測方法。
[0006] 【解決課題的技術方案】
[0007] 本發明的一個側面是判斷樣品的溫度升高至指定溫度與否的方法，其包括將含白 蛋白的樣品和溫度判斷用肽混合的工序、對得到的混合物進行加熱的工序、檢測混合物的 加熱前后的光學變化的工序、及基于光學變化的檢測結果，判斷混合物的溫度升高至指定 溫度與否的工序。包括溫度判斷用肽和白蛋白的結合的解離常數(Kd)是500μΜ以上，溫度判 斷用肽含第1標記物質和第2標記物質的溫度判斷方法。
[0008] 另外，本發明的其他側面包括目標肽的檢測方法，其包括將含目標肽和白蛋白的 樣品和溫度判斷用肽混合的工序、加熱混合物的工序、檢測混合物的加熱前后的光學變化 的工序、及基于光學變化的檢測結果，判斷混合物的溫度升高至指定溫度與否的工序，溫度 判斷用肽和白蛋白的結合的Kd是500μΜ以上，溫度判斷用肽含第1標記物質和第2標記物質， 在判斷工序中，在判斷為混合物的溫度升高至指定溫度時，實行回收混合物之上清的工序 及檢測上清中的目標肽的工序。
[0009] 再者，本發明的另一側面包括溫度判斷試劑，其為用于判斷溶液升高至指定溫度 與否的試劑，試劑含溫度判斷用肽，溫度判斷用肽和白蛋白的結合的K d是500μΜ以上，溫度 判斷用肽含第1標記物質和第2標記物質。
[0010] 【發明效果】
[0011] 由本發明可提供可簡便地判斷加熱處理中的樣品的溫度是否達到指定溫度的溫 度判斷方法及溫度判斷試劑以及使用這些的目標肽的檢測方法。 【【附圖說明】】
[0012] 【圖1】是顯示在參考例1中研究水熱處理后的樣品中所含的肽的末端中的氨基酸 殘基的出現頻度的結果的坐標圖。
[0013] 【圖2】是顯示在參考例1中，對于含有人γ球蛋白的樣品，研究水熱處理后的樣品 中所含的肽的末端中的氨基酸殘基的出現頻度的結果的坐標圖。
[0014] 【圖3】是顯示在參考例1中，對于含人血清白蛋白的樣品，研究水熱處理后的樣品 中所含的肽的末端中的氨基酸殘基的出現頻度的結果的坐標圖。
[0015] 【圖4】是顯示在參考例1中，對于血清、人γ球蛋白及人血清白蛋白，研究水熱處理 后的樣品中所含的肽的末端中的氨基酸殘基的出現頻度的結果的坐標圖。
[0016] 【圖5】是顯示在實施例1中研究肽濃度和熒光強度的差的關系的結果的坐標圖。 [0017]【圖6】是顯示在實施例2中研究對HSA的各肽的Kd的結果的坐標圖。
[0018] 【圖7】(A)是在實施例2中，未處理及水熱處理后的TMR標記ACTH(l-24)的進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的附圖代用照片、（B)是未處理及水熱處理后的TMR標記ACTH(l-39)的 進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的附圖代用照片。
[0019] 【圖8】是顯示在實施例2中對于圖6所示的各肽分類為適合于接頭肽的肽及不適合 于接頭肽的肽的結果的坐標圖。
[0020] 【圖9】是在實施例3中進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的附圖代用照片。
[0021] 【圖10】(A)是在比較例1中，進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的銀染色像的附圖代用 照片、（B)是進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的熒光像的附圖代用照片。
[0022]【圖11】(A)是在實施例4中，進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的銀染色像的附圖代用 照片、（B)是進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的熒光像的附圖代用照片。
[0023]【圖12】是顯示在實施例5中，對于未處理的樣品及水熱處理后的樣品各自測定激 發波長:335nm且熒光波長:360~600nm時的熒光光譜的結果的光譜圖。
[0024]【圖13】是顯示在實施例5中，對于未處理的樣品及水熱處理后的樣品各自研究在 激發波長:335nm、且熒光波長:490nm時的熒光強度與水熱處理中的加熱溫度的關系的結果 的坐標圖。
[0025]【圖14】是在實施例5中，對于未處理的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS及DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的水熱處理后的產物各自進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的熒光像 的附圖代用照片。
[0026]【圖15】是顯示在實施例6中，對于未處理的樣品及水熱處理后的樣品各自，將 DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果的坐標 圖。
[0027]【圖16】是顯示在實施例7中，將MCA-HSA397-413片段-DNP的斷裂導致的熒光的強 度作為濃淡值數值化的結果的坐標圖。
[0028]【圖17】(A)是顯示在實施例8中，觀察放入未處理的樣品的容器及放入水熱處理后 的樣品的容器的結果的附圖代用照片、（B)是顯示將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂 導致的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果的坐標圖。
[0029]【圖18】(A)是顯示在實施例9中，在可見光下觀察放入未處理的樣品的容器及放入 水熱處理后的樣品的容器的結果的附圖代用照片、（B)是顯示在紫外線照射下觀察放入未 處理的樣品的容器及放入水熱處理后的樣品的容器的結果的附圖代用照片、（C)是顯示將 DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果的附圖 代用照片。
[0030] 【圖19】(A)是顯示在實施例10中，在可見光下觀察放入未處理的樣品的容器及放 入水熱處理后的樣品的容器的結果的附圖代用照片、（B)是顯示將DABCYL-HSA397-413片 段-EDANS的斷裂引發的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果的坐標圖。
[0031] 【圖20】(A)是顯示在實施例10中，在紫外線照射下觀察放入未處理的樣品的容器 及放入水熱處理后的樣品的容器的結果的附圖代用照片、（B)是顯示將DABCYL-HSA397-413 片段-EDANS的斷裂引發的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果的坐標圖。 【【具體實施方式】】
[0032] 以下參照【附圖說明】本發明的優選實施方式。
[0033]【1.溫度判斷方法】
[0034]本實施方式涉及的溫度判斷方法是判斷樣品的溫度升高至指定溫度與否的方法， 其特征在于包括將含白蛋白的樣品和溫度判斷用肽混合的工序（以下也稱為"混合工序"）、 對得到的混合物進行加熱的工序（以下也稱為"加熱工序"）、檢測混合物的光學變化的工序 (以下也稱為"光學變化檢測工序"）、及基于光學變化的檢測結果，判斷混合物的溫度升高 至指定溫度與否的工序（以下也稱為"判斷工序"）。溫度判斷用肽和白蛋白的結合的解離常 數(Kd)是500μΜ以上，溫度判斷用肽含第1標記物質和第2標記物質。
[0035]在本實施方式中，使用含白蛋白的樣品。作為樣品，例如，可舉出活體樣品。作為活 體樣品，例如，可舉出全血、淋巴液等的體液、尿等的排泄物、對這些預處理的樣品，但不特 別限定。作為預處理這些的樣品，可舉出血漿、血清等。
[0036]指定溫度是使白蛋白自身會合、并且使基于溫度判斷用肽的斷裂的光學變化發生 的溫度。此溫度優選為120°C以上、更優選為140°C以上。指定溫度之上限是可檢測基于溫度 判斷用肽的斷裂的光學變化的溫度即可。通常，指定溫度之上限優選為260°C。在將本實施 方式涉及的溫度判斷方法在目標肽的檢測中使用時，必需保證不因在指定溫度的加熱而目 標肽被分解至不能檢測。加熱處理條件設為可特異性地檢測加熱處理后的目標肽、或者顯 示目標肽的存在的目標肽的片段的條件。此溫度根據目標肽的種類設定。
[0037]溫度判斷用肽是對白蛋白的解離常數是500μΜ以上的肽。因此，溫度判斷用肽在樣 品中難與白蛋白結合或會合。溫度判斷用肽含后述的接頭肽、第1標記物質和第2標記物質。 接頭肽有第1標記物質和第2標記物質。
[0038]在本說明書中，"解離常數(Kd)"是指在常壓、25°C、pH7.5及電傳導率（以下也稱為 "傳導率"）l〇mS/Cm的條件下的解離常數。對白蛋白的溫度判斷用肽的解離常數的值越大， 表示對白蛋白的溫度判斷用肽的親和性越低。
[0039]在本說明書中，"接頭肽"是指含2~130個氨基酸殘基的肽。接頭肽可為合成肽，也 可為天然來源肽。接頭肽的等電點不特別限定。作為接頭肽，例如，可舉出促腎上腺皮質激 素（ACTH)(1-39)〔ACTH(1-39)〕（SEQ ID N0:16)、ACTH(1-41)(SEQ ID N0:17)、（Glu)10(SEQ ID N0:18)、強啡肽A(SEQ ID N0:19)、（Gly)10(SEQ ID N0:20)、（Arg)10(SEQ ID N0:21)、 Cp6(SEQIDN0:22)、C4a(SEQIDN0:23)、腦性鈉利尿肽(BNP、SEQIDN0:24)、緩激肽（SEQ ID N0:25)、HSA237-249片段（SEQ ID N0:26)、C3f(SEQ ID N0:27)、ITIH4(SEQ ID N0:28)、 HSA397-413片段（SEQ ID N0:29)、HSA599-609片段（SEQ ID N0:30)、C-肽（SEQ ID N0:31)、 粘菌素(SEQ ID N0:32)等，但不特別限制。再有，粘菌素也可為粘菌素A單獨、粘菌素B單獨、 及粘菌素A和粘菌素B的混合物之任何。
[0040] 在接頭肽中，第1標記物質及第2標記物質的附加部位不特別限定。只要是由后述 的接頭肽的斷裂而第1標記物質和第2標記物質被隔離的位置即可。優選在接頭肽的N末端 結合有第1標記物質，在C末端結合有第2標記物質，致使由該斷裂使得第1標記物質和第2標 記物質被更確實地隔離。
[0041] 第1標記物質及第2標記物質優選為由溫度判斷用肽的斷裂而發生能檢測的光學 變化的物質。光學變化由于容易檢測，優選為溫度判斷用肽導致的光學信號的波長的變化。 作為光學信號的波長的變化，例如，可舉出光的波長的變化、熒光的發生等，但不特別限定。 其中，"熒光的發生"是指加熱處理后發生指定的閾值以上的強度的熒光。加熱處理前不發 生熒光時或熒光強度達不到閾值時，無法將"熒光的發生"作為光學變化檢測。在本實施方 式中，第1標記物質及第2標記物質可在利用熒光共振能量轉移(FRET)的標記物質、利用生 物發光共振能量轉移(BRET)的標記物質等之中適宜選擇。
[0042] FRET是在接近的2個的熒光物質之間能量由電子的共振直接移動的現象。在FRET 中，被供體吸收的激發光的能量向作為受體的熒光物質移動。由此，自受體放射熒光。BRET 是為了生物發光物質發光而使用的能量移動到在發光物質的附近配置的熒光物質等，從而 熒光等發生的現象。
[0043] 作為第1標記物質，例如，可舉出成為能量供體的熒光物質、成為能量供體的生物 發光物質等，但不特別限定。另外，作為第2標記物質，例如，可舉出第1標記物質中使用的熒 光物質所發的熒光的猝滅劑(從成為供體的熒光物質接受能量的成為受體的熒光物質）、從 第1標記物質中使用的生物發光物質接受能量的成為受體的熒光物質等，但不特別限定。
[0044] 作為成為能量供體的熒光物質，例如，可舉出5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸、 7-甲氧基香豆素-4-醋酸、熒光素5(6)異硫氰酸、6-羧基熒光素、四氯熒光素、若丹明綠色 (商標）、四甲基若丹明、羧基若丹明、Cy5(商標）、Cyanin5(商標）、ATT0 655(商標）、 STELLATM-488(商標）、STELLATM-600 (商標）、熒光性納米粒子等，但不特別限定。成為能量 的供體的熒光物質，從熒光的檢測容易性的方面，優選為5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸 及7-甲氧基香豆素-4-醋酸。作為成為能量供體的生物發光物質，例如，可舉出熒光素酶等 的發光蛋白質等，但不特別限定。作為猝滅劑，例如，可舉出4-[4-(二甲基氨基)苯基偶氮] 安息香酸、2，4-二硝基苯酚、四甲基若丹明、BHQ-1 (商標）、BHQ-2 (商標）、7-硝基苯并呋咱、 Cy5Q(商標)等，但不特別限定。猝滅劑，從熒光的檢測的容易性的方面，優選為4-[4-(二甲 基氨基)苯基偶氮]安息香酸及2,4_二硝基苯酚。作為從生物發光物質接受能量的成為受體 的熒光物質，例如，可舉出綠色熒光蛋白質等，但不特別限定。第1標記物質和第2標記物質 的組合可適宜決定。
[0045]接頭肽上的第1標記物質和第2標記物質之間的距離是充分地接近的距離。在利用 共振能量轉移時，只要是發生此能量轉移的距離即可。由加熱處理而第1標記物質和第2標 記物質隔離時不發生該能量轉移，發生光學變化。接頭肽上的第1標記物質和第2標記物質 之間的距離只要是，例如，在第1標記物質及第2標記物質是利用FRET的熒光物質和猝滅劑 組合時，猝滅劑可對熒光物質所發的熒光進行消光的距離即可。此時，第1標記物質和第2標 記物質之間的距離之上限優選為1111個殘基、更優選為40個殘基。只要是此距離，猝滅劑就 可對熒光進行消光。
[0046] 溫度判斷用肽的斷裂被認為因肽鍵的斷裂。天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、天冬酰胺 殘基、絲氨酸殘基、甘氨酸殘基、亮氨酸殘基、丙氨酸殘基、脯氨酸殘基及賴氨酸殘基被認為 由加熱處理而易在N末端側或C末端側斷裂。從而，溫度判斷用肽優選為含上述的殘基之中 至少1種氨基酸殘基，更優選為含天冬氨酸殘基。
[0047] 溫度判斷用肽，例如，可溶解于緩沖液等的助劑而使用。
[0048] 在本實施方式涉及的溫度判斷方法中，首先，在混合工序中，將含白蛋白的樣品和 溫度判斷用肽混合。在混合工序中，相對于樣品的溫度判斷用肽的量可根據樣品中所含的 蛋白質、肽等的量、樣品的種類等適宜決定。
[0049] 接下來，在加熱工序中，加熱混合工序中得到的混合物。加熱溫度與指定溫度相 同。另外，加熱時間只要是對于進行將混合物加熱到指定溫度充分的時間即可。通常、加熱 時間，例如，是5分鐘以上。
[0050] 作為混合物的加熱方法，例如，可舉出由微波的照射的加熱、從外部的熱傳導加熱 等，但不特別限定。另外，作為在混合物的加熱中使用的裝置，例如，可舉出水熱反應器、微 波照射裝置等，但不特別限定。
[0051] 白蛋白通過在指定溫度的加熱而分子之間會合，成為不溶性的析出物，溫度判斷 用肽在樣品中難與白蛋白結合。因此，溫度判斷用肽在加熱時不被不溶性的白蛋白的析出 物捕獲。從而，在加熱工序中，在混合物的溫度達到指定溫度時，溫度判斷用肽不含在白蛋 白的不溶性的析出物中，存在于液體成分(上清）中。溫度判斷用肽被認為在混合物的溫度 達到指定溫度時，肽鍵被切斷而斷裂。從而，第1標記物質和第2標記物質之間的距離比進行 加熱工序之前遠，被認為光學變化變得容易發生。
[0052]接下來，在光學變化檢測工序中，檢測混合物的光學變化。在檢測光學變化時，可 檢測加熱前的光學狀態，也可不檢測。加熱前的光學狀態由于是試劑自體的光學狀態，所以 預先知道。通過檢測加熱后的光學狀態，與加熱前的光學狀態比較，可檢測光學變化。
[0053]在混合物被加熱到指定溫度時，溫度判斷用肽被認為斷裂。因此，在第1標記物質 和第2標記物質之間的距離變得比進行加熱工序之前長，被認為發生光學變化。第1標記物 質及第2標記物質是，例如，在FRET中使用的熒光物質和猝滅劑的組合時，由溫度判斷用肽 的斷裂(肽鍵的切斷），第1標記物質的熒光物質和第2標記物質的猝滅劑之間的距離以不發 生FRET的程度隔離。由此，猝滅劑無法對來自熒光物質的熒光進行消光，從而發生熒光。 [0054]作為光學變化的檢測手段，例如，可舉出分光光度計、熒光光度計、電泳裝置和成 像分析儀的組合等，但不特別限定。涉及的檢測手段可根據檢測對象的光學變化的種類等 適宜選擇。
[0055] 其后，在判斷工序中，基于光學變化檢測工序中得到的光學變化的檢測結果，判斷 混合物的溫度升高至指定溫度與否。
[0056] 在判斷工序中，例如，檢測的光學信號的強度是指定的閾值以上時，可判斷為混合 物的溫度升高至指定溫度。另一方面，檢測的光學信號的強度不到指定的閾值時，可判斷為 混合物的溫度未升高至指定溫度。再有，在本說明書中，"指定的閾值"是指可最高精度分類 加熱前的光學信號的強度和由加熱引起溫度判斷用肽的斷裂導致的光學信號的強度的值。 [0057]在光學變化檢測工序中，檢測基于混合物的上清中的溫度判斷用肽中所含的標記 物質的熒光時，在判斷工序中，可基于上清的熒光的強度進行判斷。在上清的熒光的強度是 指定的閾值以上時，可判斷為混合物的溫度升高至指定溫度。另一方面，上清的熒光的強度 不到指定的閾值時，可判斷為混合物的溫度未升高至指定溫度。
[0058] 在有將放入樣品的容器密封而加熱的必要時，難以使測定對象物接觸溫度計而進 行溫度測量。此時，樣品的溫度不使用溫度記錄法等的非接觸溫度計，自外部測定困難。在 使用本實施方式的溫度判斷用肽時，可不使用與測定對象物接觸而測定的溫度計或非接觸 溫度計而簡便地確認容器內的樣品的溫度。從而，由本實施方式涉及的溫度判斷方法適宜 于對放入樣品的容器密封加熱時的樣品的溫度的確認等。
[0059] 【2.目標肽的檢測方法】
[0060] 本實施方式涉及的目標肽的檢測方法（以下也簡稱為"檢測方法"）包括將含目標 肽和白蛋白的樣品與溫度判斷用肽混合的工序（混合工序）、加熱混合物的工序（加熱工 序）、檢測混合物的光學變化的工序(光學變化檢測工序）、及基于光學變化的檢測結果，判 斷混合物的溫度升高至指定的溫度與否的工序(判斷工序）。溫度判斷用肽如上所述。在判 斷工序中，判斷為混合物的溫度升高至指定溫度的時，實行回收混合物的上清的工序（以下 也稱為"回收工序"）及檢測上清中的目標肽的工序（以下也稱為"目標肽檢測工序"）。本實 施方式涉及的檢測方法中的混合工序、加熱工序、光學變化檢測工序及判斷工序是與前述 的溫度判斷方法中的混合工序、加熱工序、光學變化檢測工序及判斷工序同樣。
[0061] 本實施方式涉及的檢測方法的目標肽與溫度判斷用肽的接頭肽優選不同。
[0062] 作為目標肽，例如，可舉出活體樣品中所含的生物標志物等的肽等，但不特別限 定。作為生物標志物，例如，可舉出ACTH、BNP、心房性鈉利尿肽(ANP)、緩激肽、α-內啡肽、 C3f、ITIH4、C-肽、β-淀粉樣蛋白、端絲氨酸、腎上腺髓質素、加壓素、縮宮素、Imtaktl型原膠 原-N-原肽（Intact PINP)、原膠原III肽(P-IIΙ-P)等，但不特別限定。
[0063] 在判斷工序中，判斷為混合物的溫度升高至指定溫度的時，實行回收工序及目標 肽檢測工序。另一方面，在判斷工序中，不判斷為混合物的溫度升高至指定溫度時，不實行 回收工序及目標肽檢測工序。
[0064] 在回收工序中，混合物的上清的回收，例如，可由離心分離、超濾、傾析等進行。
[0065] 在目標肽檢測工序中，目標肽的檢測可舉出，使用針對目標肽的抗體的方法、例 如，酶聯免疫吸附法(ELISA)等;液相層析質譜分析法(LC/MS、LC/MS/MS);使用反射干涉分 光傳感器的方法;反射強度測定法等，但不特別限定。
[0066] 在本實施方式涉及的檢測方法中，在混合工序中，除樣品和溫度判斷用肽之外，也 可進一步混合含熒光物質的相分配判斷用肽。其中，"相分配"是指分配不溶性的析出層和 溶液層。在加熱處理含白蛋白的樣品時，白蛋白構成自身聚集體，發生不溶性的析出物。在 此不溶性的析出物還含與白蛋白結合的蛋白質或肽等。不與白蛋白結合的成分存在于溶液 層中。上述的溫度判斷用肽由于不與白蛋白結合，存在于溶液層，由于相分配判斷用肽如后 述一樣與白蛋白結合，存在于不溶性的析出層。
[0067] 相分配判斷用肽是與白蛋白的結合的Kd不足500μΜ的肽。從而，相分配判斷用肽在 樣品中易與白蛋白結合。因此，在加熱工序中，混合物的溫度達指定溫度時，相分配判斷用 肽含在白蛋白的不溶性的析出物中。此時，使用相分配判斷用肽時，可簡便地判斷由加熱處 理發生的白蛋白的不溶性的析出物和上清級分的相分離實現與否。作為熒光物質，例示與 溫度判斷用肽中使用的熒光物質同樣的物質。再有，相分配判斷用肽的熒光物質從容易地 檢測相分配判斷用肽中的熒光物質所發的熒光的觀點來看，是與溫度判斷用肽的標記物質 不同的物質。
[0068] 在使用相分配判斷用肽時，在光學變化檢測工序中，除了溫度判斷用肽導致的光 學變化之外，檢測白蛋白的不溶性的析出物中所含的相分配判斷用肽中的熒光物質所發的 熒光。
[0069] 在使用相分配判斷用肽時，在混合物中檢測到發生基于相分配判斷用肽的熒光標 記的熒光的析出物。在自析出物發生的熒光的強度是指定的閾值以上時，可判斷為相分配 適宜地進行。
[0070] 【3.溫度判斷試劑】
[0071] 本實施方式涉及的溫度判斷試劑含上述的溫度判斷用肽。此試劑可為僅由溫度判 斷用肽構成的試劑，也可為使溫度判斷用肽溶解于水等的溶劑的試劑。另外，溫度判斷用試 劑也可進一步含有用于穩定保持肽等的助劑。作為助劑，可舉出緩沖液、防腐劑等，但不特 另IJ限定。
[0072] 本實施方式的試劑也可進一步含相分配判斷用肽。此時，優選為在不同容器中收 容溫度判斷用肽和相分配判斷用肽的試劑盒的形態。
[0073]【實施例】
[0074] 如以下表1所示，有將氨基酸殘基的符號以3字母表示的情況。
[0075] 【表1】
[0077] 【參考例1】
[0078] 使用含有0.1M氯化鈣的0.1M Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)將健康者的血清150yL稀 釋10倍，得到含有血清的樣品。將得到的含有血清的樣品1.5mL放入水熱處理用玻璃容器。 接下來，將放入稀釋液的水熱處理用玻璃容器設置在微波合成反應裝置〔Milestone General公司制、商品名:Mul t iSYNTH〕中，進行160 °C的水熱處理。其后，從水熱處理后的樣 品回收上清。再有，將160 °C的水熱處理的溫度條件設定為，從常溫(20°C)至100 °C的升溫進 行30秒鐘、從100 °C至160 °C的升溫進行1分鐘的條件。
[0079] 將得到的上清使用超濾膜〔MerckMillipore公司制、商品名：AmiconUltra-0 · 5 10kDa〕進行超濾。將得到的過濾液使用固相提取柱〔GL Science公司制、商品名:RP-1〕進行 脫鹽。再者，將脫鹽后的溶液供于離心蒸發器而使干燥。使得到的干燥物溶解于乙腈/三氟 醋酸(TFA) /水混合溶劑〔含有50體積％乙腈和0.1體積％ TFA的純化水〕1 OOyL。將得到的溶 液5yL用0.1體積％TFA/純化水混合溶劑稀釋50倍。將得到的稀釋液5yL供于液相層析儀裝 置〔Michrom BioResources Inc.制、商品名：ADVANCE UPLC SYSTEM〕及質譜分析裝置 (Thermo Fisher Scientific Inc.制、商品名：Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL質譜 儀〕，由液相層析質譜分析法(LC-MS/MS)解析由水熱處理生成的肽。液相層析質譜分析法 (LC-MS/MS)的測定條件及測定結果的解析條件設定為下述條件。
[0080] 〈液相層析條件〉
[0081 ]分離柱：（財)化學物質評價研究機構制、商品名:L-柱0DS(0.1 X 150mm)
[0082] 溶出溶劑A: 2體積％乙腈/0.1體積％蟻酸混合溶劑
[0083] 溶出溶劑B:90體積％乙腈/0.1體積％蟻酸混合溶劑
[0084] 流速：500nL/min
[0085] 濃度梯度:表2中所示的濃度梯度
[0086] 【表2】
[0088]〈質譜分析條件〉
[0089] 離子化方式：Nanoflow-LC ESI
[0090] 離子化模式:正模式
[0091] 毛細管電壓：1.8kV
[0092] 碰撞能：35eV
[0093] 〈測定結果的解析條件〉
[0094] 解析軟件:Matrix Science，Inc.提供、Mascot Server(在內部的數據庫檢索）
[0095] 數據庫：NCBIInr
[0096]生物種:全可行(全部的生物種）
[0097]消化酶:無
[0098] 修飾:氧化(M)
[0099]結果，由LC-MS/MS鑒定出292種肽。水熱處理后的樣品中所含的肽的末端的氨基酸 殘基的出現頻度示于圖1。
[0100] 使人γ球蛋白〔和光純藥(株)制〕及氯化鈣溶解于〇. 1M Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0) 至各自的濃度成20mg/mL及0.1M，得到含有人γ球蛋白的樣品。使人血清白蛋白（以下也稱 為"HSA"）〔SIGMA · ALDRICH公司制〕及氯化鈣溶解于0.1Μ Tris-鹽酸緩沖液(ρΗ7.0)至各自 的濃度成40mg/mL及0.1M，得到含有HSA的樣品。
[0101] 接下來，在上述中，除代替含有血清的樣品而使用含有人γ球蛋白的樣品或含有 HSA的樣品之外，與上述同樣地，進行水熱處理及LC-MS/MS。接下來，求出水熱處理后的樣品 中所含的肽的末端的各氨基酸殘基的出現頻度。對于含有人γ球蛋白的樣品研究水熱處理 后的樣品中所含的肽的末端的氨基酸殘基的出現頻度的結果示于圖2、對于含人血清白蛋 白的樣品研究水熱處理后的樣品中所含的肽的末端的氨基酸殘基的出現頻度的結果示于 圖3、研究在將血清、人γ球蛋白及人血清白蛋白各自通過水熱處理生成的肽的末端出現的 氨基酸殘基的出現頻度的結果示于圖4。
[0102] 從圖1~4所示的結果得知，在血清中含的蛋白質及肽中，存在由水熱處理易斷裂 的位置。易斷裂的位置優選為天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、天冬酰胺殘基、絲氨酸殘基、甘氨 酸殘基、亮氨酸殘基、丙氨酸殘基、脯氨酸殘基及賴氨酸殘基各自的位置、更優選為天冬氨 酸殘基的位置。
[0103] 【實施例1】
[0104] 使HSA(SIGMA · ALDRICH公司制）溶解于磷酸緩沖生理鹽水至其濃度成ΙμΜ，得到A 液。另外，使由HSA的397~413位的氨基酸構成的HSA397-413片段（SEQIDN0:29)、四甲基 若丹明（以下也稱為"TMR"）標記HSA397-413片段及HSA溶解于磷酸緩沖生理鹽水至各自的 濃度成833μΜ、7μΜ及ΙμΜ，，得到B液。接下來，通過將A液和B液以各種的混合比混合，調制HSA 濃度一定、并且HSA397-412片段濃度不同的各種的混合液。將得到的各混合液供于分光熒 光光度計〔（株）日立高技術制、商品名：F-7000〕，測定激發波長:540nm、且熒光波長:580nm 時的熒光強度（以下，稱為"熒光強度A"）。
[0105] 另外，使HSA397-412片段及TMR標記HSA397-412片段溶解于磷酸緩沖生理鹽水至 各自的濃度成833μΜ及7μΜ，得到C液。通過將磷酸緩沖生理鹽水和C液以各種的混合比混合， 調制HSA397-412片段濃度不同的各種混合液。將得到的各混合液供于分光熒光光度計 〔（株）日立高技術制、商品名:F-7000〕，測定激發波長:540nm且熒光波長:580nm時的熒光強 度（以下，稱為"熒光強度B"）。
[0106] 算出混合液中的HSA397-412片段濃度和TMR標記HSA397-412片段濃度的和（以下 也稱為肽濃度）。另外，根據式(I):
[0107] 熒光強度的差=熒光強度A-熒光強度B (I)
[0108] 求出熒光強度的差。將各混合液中的肽濃度及使用各混合液之時的熒光強度的差 的數據點標繪在X軸是肽濃度，y軸是熒光強度的差的2維座標上。研究肽濃度和熒光強度的 差的關系的結果示于圖5。再者，使用標繪的數據點組的近似曲線、數據解析一圖表制成軟 件〔HULINKS(Hulinks)制、商品名：KaleidaGraph〕及式（II):
[0109] Y=AXCn/Cn+Kdn (II)
[0110] (式中，Y表示熒光強度、A表示用于熒光強度的校正的系數、C表示肽濃度、Kd表示 解離常數、η表示希爾系數)所表示的希爾公式，求出對HSA的HSA397-412片段的Kd。
[0111] 結果得知，對HSA的HSA397-412片段的Kd是ΙΟΟΟμΜ以上。從而得知，HSA397-412片 段對HSA的親和性低。結果提示，HSA397-412片段難與HSA結合。
[0112]【實施例2】
[0113] 【（1)水熱處理】
[0114] 將表3所示的各肽用TMR標記。
[0115] 【表3】
[0117] 接下來，在實施例1中，除代替HSA397-412片段而使用各TMR標記肽之外，與實施例 1同樣地求出對HSA的表3所示的各肽的Kd。在實施例2中，對HSA的各肽的Kd示于圖6。
[0118] 從圖6所示的肽之中，選擇對HSA的Kd是200μΜ的ACTH(l-24)和對HSA的Kd是520μΜ的 ACTH(l-39)。將TMR標記ACTH(l-24)和HAS混合于0.1Μ Tris-鹽酸溶液中，使得各自的濃度 成5μΜ及470μΜ，得到含有TMR標記ACTH(l-24)的樣品。另外，將TMR標記ACTH(l-39)和HAS混 合于0.1M Tris-鹽酸溶液中，使得各自的濃度成8μΜ及600μΜ，得到含有TMR標記ACTH(l-39) 的樣品。
[0119] 在參考例1中，除代替含有血清的樣品、含有人γ球蛋白的樣品或含有HSA的樣品 而使用含有TMR標記ACTH(l-24)的樣品或含有TMR標記ACTH(l-39)的樣品之外，與參考例1 同樣地進行水熱處理。其后，從水熱處理后的樣品回收上清。
[0120]【（2) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用被驗樣品的調制】
[0121] 將SDS-PAGE用添加緩沖液〔寶生物(株）制、商品名：10 X裝載緩沖液〕10yL和60體 積％甘油水溶液20yL混合，得到樣品用緩沖液。向得到的樣品用緩沖液3yL添加含有TMR標 記ACTH( 1-24)的樣品1.5yL，得到被驗樣品。另外，在上述中，除代替含有TMR標記ACTH(1-24)的樣品而使用含有TMR標記ACTH(l-39)的樣品或各樣品的水熱處理后的上清之外，與上 述同樣地，得到被驗樣品。
[0122] 【（3)SDS_PAGE】
[0123] 使用電泳裝置〔Invitrogen公司制、商品名：垂直型小電泳系統〕、電泳凝膠 〔Invitrogen公司制、商品名：NuPAGE 4-12%Bis_Tris Gels、1 · 0mm、10孔〕、電泳緩沖液 〔Invitrogen公司制、商品名：NuPAGE MES SDS電泳緩沖液(20X )稀釋20倍的稀釋液〕，在電 壓:200V下進行上述實施例2(2)中得到的各被驗樣品的SDS-PAGE。將得到的電泳凝膠供于 熒光成像儀〔BIO-RAD(BIO-RAD)公司制、商品名：Pharos FX Molecular Imager〕，以TAMRA 用波長(激發波長:532nm)的高樣品強度模式取得電泳凝膠的熒光像。
[0124] 在實施例2中，未處理及水熱處理后的TMR標記ACTH(l-24)的進行SDS-PAGE的結果 示于圖7(A)、未處理及水熱處理后的TMR標記ACTH(l-39)的進行SDS-PAGE的結果示于圖7 (B)。圖7(A)中，泳道Μ顯示分子量標志物的電泳圖譜、泳道2顯示在HSA存在下未處理的含有 TMR標記ACTH( 1-24)的樣品的電泳圖譜、泳道2顯示在HSA存在下水熱處理后的含有TMR標記 ACTH(l-24)的樣品的上清級分的電泳圖譜。另外，圖7(B)中，泳道1顯示在HSA存在下未處理 的含有TMR標記ACTH(l-39)的樣品、泳道2顯示在HSA存在下水熱處理后的含有TMR標記ACTH (1-39)的樣品的上清級分、泳道3顯示在HSA非存在下的未處理的TMR標記ACTH( 1-39)。
[0125] 從圖7 (A)所示的結果，在HSA存在下未處理的含有TMR標記ACTH (1 -24)的樣品的電 泳圖譜（泳道1)中，確認ACTH(1 -24)來源的條帶。與此相對，在HSA存在下水熱處理后的TMR 標記ACTH(l-24)的上清的電泳圖譜（泳道2)中確認不到ACTH(l-24)來源的條帶。從該結果 預計，ACTH(l-24)在水熱處理后與不溶性級分的白蛋白的析出物結合。
[0126] 另一方面，在HSA存在下水熱處理后的含有TMR標記ACTH( 1-39)的樣品的上清的電 泳圖譜（泳道2)中，確認到ACTH(l-39)來源的條帶。從結果得知，ACTH(l-39)在通過加熱含 ACTH(l-39)的樣品而加熱溫度達指定溫度時，不與不溶性級分中所含的白蛋白的析出物結 合，在上清級分中存在。
[0127] 這些結果提示，ACTH(1_39)在白蛋白存在下加熱時，在加熱溫度達指定溫度時，可 在上清級分中容易地檢測。從而提示，ACTH(l-39)適宜為用于判斷含白蛋白的樣品的溫度 是否是指定溫度的溫度判斷用肽的接頭部分。另外，這些結果提示，對白蛋白的Kd是500μΜ 以上的肽適宜為用于判斷含白蛋白的樣品的溫度是否是指定溫度的溫度判斷用肽的接頭 肽。對于圖6所示的各肽分類為適宜于接頭肽的肽及不適宜于接頭肽的肽的結果示于圖8。
[0128] 從圖 8 所示的結果可知，ACTH(l-39)、ACTH(l-41)、（Glu)10d^_MicA、（Gly)10、 (Arg)10、Cp6、C4a、BNP、緩激肽、HSA237-249 片段、03廠111!14、批厶397-413片段、!^厶599-609 片段、C-肽及粘菌素適宜為接頭。
[0129] 【實施例3】
[0130] 【（1)水熱處理】
[0131] 使 TMR 標記 HSA237-249 片段、TMR 標記 HSA397-413 片段或 TMR 標記 HSA599-609 片段 溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至其濃度成5μΜ，得到樣品A(含有TMR標記HSA237-249片段）、 樣品B(含有TMR標記HSA397-413片段)或樣品C(含有TMR標記HSA599-609片段）。
[0132]將樣品A 0.7mL放入螺旋管瓶。接下來，不蓋蓋子而將樣品A連同螺旋管瓶一起放 入鐵制傳熱容器內。將鐵制傳熱容器在保持于200°C的恒溫槽內加熱40分鐘后，通過溫育鐵 制傳熱容器進行水熱處理至恒溫槽內的溫度下降到室溫。將得到的溶液作為水熱處理后樣 品A。另外，在上述中，除代替樣品A而使用樣品B或樣品C之外，與上述同樣地進行水熱處理。
[0133] 【（2) SDS-PAGE用被驗樣品的調制】
[0134] 在實施例2(2)中，除代替含有TMR標記ACTH(l-24)的樣品、含有TMR標記ACTH(1-39)的樣品或各樣品的水熱處理后的上清而使用樣品A~C或水熱處理后的各樣品之外，與 實施例2 (2)同樣地得到被驗樣品。
[0135] 【（3)SDS_PAGE】
[0136] 在實施例2 (2)中，除代替實施例2 (2)中得到的各被驗樣品而使用實施例3 (2)中得 到的被驗樣品之外，與實施例2 (2)同樣地，取得SDS-PAGE的電泳凝膠的熒光像。
[0137]在實施例3中，進行SDS-PAGE的結果示于圖9。圖中，泳道Μ顯示分子量標志物的電 泳圖譜、泳道1顯示未處理的含TMR標記HSA237-249片段的樣品Α的電泳圖譜、泳道2顯示未 處理的含TMR標記HSA397-413片段的樣品B的電泳圖譜、泳道3顯示未處理的含TMR標記 HSA599-609片段的樣品C的電泳圖譜、泳道4顯示水熱處理后的含TMR標記HSA237-249片段 的樣品A的電泳圖譜、泳道5顯示水熱處理后的含TMR標記HSA397-413片段的樣品B的電泳圖 譜、泳道6顯示水熱處理后的含TMR標記HSA599-609片段的樣品C的電泳圖譜。
[0138]從圖9所示的結果得知，在使用未處理的肽的泳道1~3中確認對應于各肽的1條條 帶。另一方面，在使用水熱處理后的肽的泳道4~6中，僅在使用了水熱處理后的TMR標記 HSA397-413片段的泳道5確認2條條帶。HSA237-249片段、HSA397-413片段及HSA599-609片 段之中，僅HSA397-413片段在氨基酸序列中有天冬氨酸殘基。從而預計，HSA397-413片段由 水熱處理在天冬氨酸殘基的位置斷裂。另外，從這些的結果得知，即使代替微波而使用傳熱 時，也可與使用微波時同樣地進行水熱處理。
[0139] 【比較例1】
[0140] 【（1)水熱處理】
[0141] 使TMR標記SA21及HSA溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至各自的濃度成8μΜ及300μΜ， 得到含有TMR標記SA21的樣品。
[0142] 在實施例3(1)中，除代替樣品Α~C而使用含有TMR標記SA21的樣品之外，與實施例 3(1)同樣地，進行水熱處理。
[0143] 結果，含有TMR標記SA21的樣品，在水熱處理后，分離為在溶液下部著紅色（TMR導 致的顏色）的不溶性級分和幾乎接近無色透明的上清這二相。從結果預計，大部分TMR標記 SA21存在于不溶性級分中。
[0144] 回收水熱處理后的含有TMR標記SA21的樣品的上清。
[0145] 【（2) SDS-PAGE用被驗樣品的調制】
[0146] 在實施例2(2)中，除代替含有TMR標記ACTH(l-24)的樣品、含有TMR標記ACTH(1-39)的樣品或各樣品的水熱處理后的上清而使用未處理的含有TMR標記SA21的樣品或水熱 處理后的含有TMR標記SA21的樣品的上清之外，與實施例2(2)同樣地，得到被驗樣品。
[0147] 【（3)SDS_PAGE】
[0148] 在實施例2(2)中，除代替實施例2(2)中得到的各被驗樣品而使用比較例1(2)中得 到的被驗樣品之外，與實施例3(2)同樣地，進行SDS-PAGE。將得到的電泳凝膠供于熒光成像 儀〔BI0-RAD公司制、商品名：Pharos FX Molecular Imager〕，以TAMRA用波長（激發波長： 532nm)的高樣品強度模式取得電泳凝膠的熒光像。另外，將得到的電泳凝膠銀染色，取得銀 染色像。
[0149] 在比較例1中，進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的銀染色像示于圖10(A)、進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的熒光像示于圖10(B)。圖中，泳道Μ顯示分子量標志物的電泳圖譜、泳 道1顯示未處理的含有TMR標記SA1的樣品的電泳圖譜、泳道2顯示水熱處理后的含有TMR標 記SA21的樣品的上清的電泳圖譜。另外，圖中，"Α"表示未處理的SA21來源的條帶、"Β"表示 SA21的凝集體。
[0150] 從圖10(A)所示的結果得知，在未處理的含有TMR標記SA1的樣品的電泳圖譜(泳道 1) 中確認HSA來源的濃的條帶。該結果提示，未處理的含有TMR標記SA1的樣品含大量的HSA。 另外，從圖10(B)所示的結果得知，在未處理的含有TMR標記SA1的樣品的電泳圖譜(泳道1) 中確認TMR標記SA1來源的條帶。
[0151] 另一方面，從圖10(A)所示的結果得知，在水熱處理后的含有TMR標記SA21的樣品 的上清的電泳圖譜(泳道2)中確認推測為HSA被片段化的片段肽組來源的條帶。另外，從圖 10(B)所示的結果得知，在水熱處理后的含有TMR標記SA21的樣品的上清的電泳圖譜(泳道 2) 中確認TMR標記SA21來源的淺的條帶。結果提示，水熱處理后的含有TMR標記SA21的樣品 的上清含極其少量的TMR標記SA21。
[0152] 這些結果提示，水熱處理后，大部分HSA作為不溶性級分沉淀，對HSA的Kd低的肽、 即，與HSA的親和性高的肽被不溶性級分納入。這些的結果與水熱處理后的上清及不溶性級 分的在肉眼的觀察結果一致。從而提示，對HSA的Kd低的肽不適合作為溫度判斷肽的接頭。
[0153] 【實施例4】
[0154] 【（1)水熱處理】
[0155] 使TMR標記HSA397-413片段溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至其濃度成5μΜ，得到樣 品D。另外，使TMR標記HSA599-609片段溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至其濃度成5μΜ，得到樣 品Ε。使TMR標記HSA397-413片段及HSA溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至各自的濃度成5μΜ及 600μΜ，得到樣品F。另外，使TMR標記HSA599-609片段及HSA溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至 各自的濃度成5μΜ及600μΜ，得到樣品G。使HSA溶解于磷酸緩沖生理鹽水lmL至其濃度成600μ Μ，得到對照樣品。
[0156] 在實施例3(1)中，除代替樣品Α~C而使用樣品D~G或對照樣品之外，與實施例3 (1)同樣地，進行水熱處理。回收水熱處理后的各樣品的上清。
[0157] 【（2) SDS-PAGE用被驗樣品的調制】
[0158] 在實施例2(2)中，除代替實施例2(2)中得到的各被驗樣品而使用樣品D~G、對照 樣品或水熱處理后的各樣品的上清之外，與實施例2(2)同樣地，得到被驗樣品。
[0159] 【（3)SDS_PAGE】
[0160] 在實施例3(2)中，除代替實施例3(2)中得到的各被驗樣品而使用實施例4(2)中得 到的被驗樣品之外，與實施例3(2)同樣地，取得電泳凝膠的銀染色像及熒光像。
[0161] 在實施例4中，進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的銀染色像示于圖11(A)、進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的熒光像示于圖11(B)。圖中，泳道Μ顯示分子量標志物的電泳圖譜、泳 道1顯示未處理的樣品D的電泳圖譜、泳道2顯示未處理的樣品Ε的電泳圖譜、泳道3顯示未處 理的樣品F的電泳圖譜、泳道4顯示未處理的樣品G的電泳圖譜、泳道5顯示未處理的對照樣 品的電泳圖譜、泳道6顯示水熱處理后的樣品F的上清的電泳圖譜、泳道7顯示水熱處理后的 樣品F的上清的電泳圖譜、泳道8顯示水熱處理后的對照樣品的上清的電泳圖譜。
[0162] 從圖11(A)所示的結果，在未處理的樣品F、樣品G及對照樣品的電泳圖譜(泳道3~ 5)中確認HSA來源的濃的條帶。另外，在水熱處理后的樣品F、樣品G及對照樣品各自的上清 的電泳圖譜(泳道6~8)中確認推測HSA被片段化的片段肽組來源的條帶。
[0163] 另一方面，從圖11(B)所示的結果，在未處理的樣品F的電泳圖譜(泳道3)及水熱處 理后的樣品F的電泳圖譜(泳道6)中確認TMR標記HSA397-413片段來源的條帶。另外，在未處 理的樣品G的上清的電泳圖譜(泳道4)及水熱處理后的樣品G的上清的電泳圖譜（泳道7)中 確認TMR標記HSA599-609片段來源的條帶。與此相對，在對照樣品的電泳圖譜（泳道5)中確 認不到肽來源的條帶。
[0164] 從這些的結果得知，對HSA的Kd高的肽(對HSA的Kd是500μΜ以上）、即與HSA的親和性 低的肽在水熱處理后被不溶性級分納入。從而，這些結果提示，對HSA的Kd高的肽是適宜于 溫度判斷用肽的接頭肽的肽。
[0165] 【實施例5】
[0166] 【（1)未處理的樣品的調制】
[0167] 使HSA397-413片段的兩末端(N末端及C末端）被標記的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS溶解于100mM甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)6mL至其濃度成20μΜ，得到樣品IDABCYL-HSA397-413片段-EDANS被設計為，在未斷裂的狀態下，由DABCYL使得EDANS的熒光被消光， 但通過斷裂而由EDANS導致熒光強度升高。
[0168] 【（2)水熱處理】
[0169] 將實施例5(1)中得到的樣品H 1.5mL放入水熱處理用玻璃容器。接下來，將放入樣 品Η的水熱處理用玻璃容器設置在微波合成反應裝置〔Milestone General公司制、商品名： Mu 11 i SYNTH〕中，根據表4所示的條件進行80 °C、120 °C或160 °C的水熱處理。
[0170] 【表4】
[0172] 【（3)熒光光譜的測定】
[0173] 將實施例5(1)中得到的未處理的樣品Η及實施例5(2)中得到的水熱處理后的樣品 Η各自供于分光熒光光度計〔（株）日立高技術制、商品名：F-7000〕，測定激發波長:335nm且 熒光波長:360~600nm時的熒光光譜。
[0174] 在實施例5中，將對于未處理的樣品及水熱處理后的樣品各自測定激發波長： 335nm且熒光波長:360~600nm時的熒光光譜的結果示于圖12。圖中，（A)顯示未處理的樣品 Η的熒光光譜、（B)顯示在80°C的水熱處理后的樣品Η的熒光光譜、（C)顯示在160°C的水熱處 理后的樣品Η的熒光光譜、（D)顯示在160°C的水熱處理后的樣品Η的熒光光譜。另外，將對于 未處理的樣品及水熱處理后的樣品各自，研究激發波長:335nm且熒光波長:490nm時的熒光 強度與水熱處理中的加熱溫度的關系的結果示于圖13。
[0175] 從圖12及圖13所示的結果得知，在進行120°C以上的水熱處理時，熒光強度增大。 從而，這些結果提示，在進行120°C以上的水熱處理時，HSA397-413片段斷裂。
[0176] 【(4) SDS-PAGE用被驗樣品的調制】
[0177] 在實施例3(1)中，除代替樣品A~C或水熱處理后的各樣品而使用實施例5(1)中得 到的未處理的樣品Η或實施例5(2)中得到的水熱處理后的樣品Η之外，與實施例3(1)同樣地 得到被驗樣品。
[0178] 【（5)SDS_PAGE】
[0179] 在實施例2(2)中，除代替實施例2(2)中得到的各被驗樣品而使用實施例5(4)中得 到的被驗樣品之外，與實施例2(2)同樣地，進行SDS-PAGE。對于電泳后的凝膠，通過由透照 器(UVP公司制匪-15 95-0219-03型)進行UV照射，用設置橙色濾鏡的照相機(Nicon公司制 C00LPIX 4500)攝影而將排除激發光的狀態的僅熒光像的電泳圖譜可視化。基于發出EDANS 來源的熒光的條帶的位置確認由水熱處理的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂狀態。 在實施例5中，對于未處理的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS及DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的水熱處理后的產物各自進行SDS-PAGE之后的電泳凝膠的熒光像示于圖14。圖中，泳 道1顯示未處理的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的電泳圖譜、泳道2顯示DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的水熱處理后的產物的電泳圖譜。
[0180] 從圖14所示的結果，在泳道1中僅確認未處理的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS來 源的條帶（箭頭A)。與此相對，在泳道2中，確認不到未處理的DABCYL-HSA397-413片段-EDANS來源的條帶，確認到對應于有更小的分子量的肽的條帶。這些結果提示，由水熱處理 而HSA397-413片段斷裂。
[0181] 【實施例6】
[0182] 【（1)未處理的樣品的調制】
[0183] 在實施例5(1)中，除代替100mM甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH2.5)而使用50μΜ pHl 1CAPS-氫氧化鈉緩沖液之外，與實施例5( 1)同樣地得到樣品I。
[0184] 【（2)水熱處理】
[0185] 在實施例5(2)中，除代替實施例5(1)中得到的樣品Η而使用實施例6(1)中得到的 樣品I之外，與實施例5(2)同樣地進行160Γ的水熱處理。
[0186] 【(3)熒光強度的測定】
[0187] -邊將放入實施例6(1)中得到的未處理的樣品I的容器及放入實施例6(2)中得到 的水熱處理后的樣品I的容器各自由透照器(UVP公司制NM-15 95-0219-03型)進行UV照射， 一邊用設置橙色濾鏡的照相機(Nicon公司制C00LPIX 4500)攝影而對排除激發光的狀態的 熒光像進行攝影。使用得到的圖像和圖像處理軟件〔美國國立衛生研究所提供、商品名： Image J〕，將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0188] 在實施例6中，對于未處理的樣品及水熱處理后的樣品各自將DABCYL-HSA397-413 片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果示于圖15。在圖15所示的坐 標圖中，將在所述坐標圖內的照片中的箭頭A所示的位置的熒光的強度作為濃淡值數值化。 [0189]從圖15所示的結果得知，即使在堿性條件下(pHl 1)進行160 °C的水熱處理時，與未 處理的情況比，熒光強度也增加。這些結果提示，由水熱處理所致的DABCYL-HSA397-413片 段-EDANS的斷裂導致的熒光強度的增加是判斷加熱溫度是否達到指定溫度的指標。從而提 示，DABCYL-HSA397-413片段-EDANS可作為溫度判斷用肽使用。
[0190]【實施例7】
[0191] 【（1)未處理的樣品的調制】
[0192] 使HSA397-413片段的兩末端(N末端及C末端）被標記的MCA-HSA397-413片段-DNP 溶解于磷酸緩沖生理鹽水6mL至其濃度成20μΜ，得到樣品JJCA-HSA397-413片段-DNP被設 計為，在未斷裂的狀態下，由MCA使得DNP的熒光被消光，但通過斷裂使得DNP導致熒光強度 升尚。
[0193] 【（2)水熱處理】
[0194] 在實施例5 (2)中，除代替實施例5 (1)中得到的樣品Η而使用實施例7 (1)中得到的 樣品J之外，與實施例5(2)同樣地進行160Γ的水熱處理。
[0195] 【(3)熒光強度的測定】
[0196] 在實施例6(3)中，除代替放入未處理的樣品I的容器及放入水熱處理后的樣品I的 容器而使用放入實施例7(1)中得到的未處理的樣品J的容器及放入實施例7(2)中得到的水 熱處理后的樣品J的容器之外，與實施例6(3)同樣地，將MCA-HSA397-413片段-DNP的斷裂導 致的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0197] 在實施例7中，將MCA-HSA397-413片段-DNP的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值 數值化的結果示于圖16。在圖16所示的坐標圖中，將在所述坐標圖內的照片中的箭頭A所示 的位置的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0198] 從圖16所示的結果得知，對于MCA-HSA397-413片段-DNP，在中性條件下(pH7.5)進 行160°C的水熱處理時，與未處理的情況比熒光強度也增加。這些結果提示，由水熱處理所 致的MCA-HSA397-413片段-DNP的斷裂導致的熒光強度的增加是判斷加熱溫度是否達到指 定溫度的指標。從而提示，MCA-HSA397-413片段-DNP可作為溫度判斷用肽使用。
[0199] 【實施例8】
[0200]【（1)未處理的樣品的調制】
[0201] 使DABCYL-HSA397-413片段-EDANS及HSA溶解于磷酸緩沖生理鹽水1.5mL至各自的 濃度成20μΜ及300μΜ，得到樣品K。
[0202]【（2)水熱處理】
[0203]在實施例5(2)中，除代替實施例5(1)中得到的樣品Η而使用實施例8(1)中得到的 樣品Κ之外，與實施例5(2)同樣地，進行160Γ的水熱處理。
[0204]【（3)熒光強度的測定】
[0205]在實施例6(3)中，除代替放入未處理的樣品I的容器及放入水熱處理后的樣品I的 容器而使用放入實施例8(1)中得到的未處理的樣品K的容器及放入實施例8(2)中得到的水 熱處理后的樣品K的容器之外，與實施例6(3)同樣地，將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS及 HSA的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0206]在實施例8中，將觀察放入未處理的樣品的容器及放入水熱處理后的樣品的容器 的結果示于圖17(A)、將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡 值數值化的結果示于圖17(B)。在圖17(B)所示的坐標圖中，將在圖17(A)所示的照片中的箭 頭A所示的位置的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0207]從圖17所示的結果得知，在HSA存在下進行水熱處理時，與HSA存在下未處理的情 況比，熒光強度增加。從而，這些結果提示，DABCYL-HSA397-413片段-EDANS即使在HSA等的 夾雜蛋白質的存在下，也可作為溫度判斷用肽使用。
[0208]【實施例9】
[0209]【（1)未處理的樣品的調制】
[0210] 調制 3mL樣品至 DABCYL-HSA397-413 片段-EDANS 成濃度 60μΜ、全血〔PR0MEDDX (PR0MEDDX)公司制、商品名:EDTA全血(女性20歲）〕成5倍稀釋濃度、甘氨酸成濃度1Μ，得到 樣品L。
[0211] 【（2)水熱處理】
[0212] 在實施例5(2)中，除代替實施例5(1)中得到的樣品Η而使用實施例9(1)中得到的 樣品L之外，與實施例5(2)同樣地，進行160Γ的水熱處理。
[0213] 【（3)未處理的樣品及水熱處理后的樣品的評價】
[0214]將未處理的樣品L及水熱處理后的樣品L供于以15000 Xg離心分離3分鐘。將放入 得到的上清的容器在可見光下攝影。另外，將放入得到的上清的容器一邊由透照器(UVP公 司制匪-15 95-0219-03型）進行UV照射，一邊經橙色濾鏡由照相機（尼康公司制⑶OLPIX 4500)進行攝影。使用在UV照射下攝影的圖像和圖像處理軟件〔美國國立衛生研究所提供、 商品名：Image J〕，將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為濃淡值 數值化。
[0215] 在實施例9中，將在可見光下觀察放入未處理的樣品的容器及放入水熱處理后的 樣品的容器的結果示于圖18(A)、將在紫外線照射下觀察放入未處理的樣品的容器及放入 水熱處理后的樣品的容器的結果示于圖18(B)、將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導 致的熒光的強度作為濃淡值數值化的結果示于圖18(C)。在圖18(C)所示的坐標圖中，將在 所述坐標圖內的照片中的箭頭A所示的位置的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0216] 從圖18所示的結果得知，在全血存在下進行水熱處理時，與全血存在下未處理的 情況比，熒光強度增加。從而，這些結果提示，DABCYL-HSA397-413片段-EDANS即使在含多數 的夾雜蛋白質的全血等的活體樣品的存在下，也可作為溫度判斷用肽使用。
[0217]【實施例10】
[0218] 【（1)未處理的樣品的調制】
[0219] 使DABCYL-HSA397-413片段-EDANS及TMR-SA21溶解于0.1倍磷酸緩沖生理鹽水至 各自的濃度成2 0 0 μ Μ及2 0 μ Μ。將得到的溶液7 5 0 μ L和自健康的女性（2 2歲）得到的血清 〔PR0MEDDX公司制、商品名:Normal Serum Poo 1〕300yL混合。向得到的含有血清的溶液1050 yL添加2M甘氨酸溶液375yL和磷酸緩沖生理鹽水75yL，得到樣品M。
[0220] 【（2)水熱處理】
[0221] 在實施例5 (2)中，除代替實施例5 (1)中得到的樣品Η而使用實施例9 (1)中得到的 樣品Μ之外，與實施例5(2)同樣地，進行160Γ的水熱處理。
[0222] 【（3)未處理的樣品及水熱處理后的樣品的評價】
[0223] 對放入未處理的樣品Μ的容器及放入水熱處理后的樣品Μ的容器各自在可見光下 攝影。結果確認，不溶性級分附著于容器的壁面。另外，確認不溶性級分呈TMR來源的紅色。 另外，從得到的圖像，使用圖像處理軟件〔Adobe公司制、商品名：Photoshop〕僅取得紅色通 道的數據圖像。使用得到的僅紅色通道的數據圖像和圖像處理軟件〔美國國立衛生研究所 提供、商品名：Image J〕，將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強度作為 濃淡值數值化。
[0224] 在實施例10中，將在可見光下觀察放入未處理的樣品的容器及放入水熱處理后的 樣品的容器的結果示于圖19(A)、將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光的強 度作為濃淡值數值化的結果示于圖19(B)。在圖19(B)中，（a)表示水熱處理后的樣品、虛線 (b)表示未處理的樣品。在圖19(B)所示的坐標圖中，將圖19(A)所示的照片中的框包圍的部 分的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0225] 接下來，僅將上清移到Eppendorf管。將放入上清的Eppendorf管在由透照器(UVP 公司制匪-15 9 5 -0 219 -0 3型）進行的U V照射下，由設置橙色濾鏡的照相機(N i c ο η公司制 C00LPIX 4500)攝影，得到UV激發像。使用在UV照射下攝影的圖像和圖像處理軟件〔美國國 立衛生研究所提供、商品名：Image J〕，將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒 光的強度作為濃淡值數值化。
[0226] 在實施例10中，將在紫外線照射下觀察放入未處理的樣品的容器及放入水熱處理 后的樣品的容器的結果示于圖20(A)、將DABCYL-HSA397-413片段-EDANS的斷裂導致的熒光 的強度作為濃淡值數值化的結果示于圖20(B)。在圖20(B)所示的坐標圖中，將在圖20(A)所 示的照片中的箭頭A所示的位置的熒光的強度作為濃淡值數值化。
[0227] 從圖19所示的結果確認，附著于玻璃管表面的不溶性級分呈TMR來源的紅色。另 外，從圖20所示的結果確認，進行水熱處理時，與未處理的情況相比，EDANS來源的熒光增 強。這些結果提示，由水熱處理，血清中的HSA和TMR-SA21結合而TMR-SA21移動到不溶性級 分及在上清中DABCYL-HSA397-413片段-EDANS斷裂。再有，SA21對HSA的Kd不足500μΜ，是對 HSA的親和性高的肽。從而，這些結果提示，對HSA的親和性高的肽可作為用于判斷HSA是否 作為不溶性級分析出的相分配判斷用肽使用。
[0228] 【序列表自由正文】
[0229] SEQ ID NO: 1是β-淀粉樣蛋白（1-40)片段的序列。
[0230] SEQ ID Ν0:2是β-淀粉樣蛋白（1-42)片段的序列。
[0231] SEQ ID Ν0:3是RSA21 的序列。
[0232] SEQ ID Ν0:4是胰高血糖素（1-29)的序列。
[0233] SEQ ID Ν0:5是ACTH(7-11)的序列。
[0234] SEQ ID N0:6是(Lys)10的序列。
[0235] SEQ ID N0:7是激肽原的序列。
[0236] SEQ ID N0:8是C3f(16氨基酸殘基）的序列。
[0237] SEQ ID N0:9是SA21 的序列。
[0238] SEQ ID 從)：10是厶(：1'!1(2-16)的序列。
[0239] SEQ ID 從)：11是（把8)3的序列。
[0240] SEQ ID N0:12是纖維蛋白原α的序列。
[0241] SEQ ID 從)：13是1(?)的序列。
[0242] SEQ ID 從)：14是厶(：1'!1(1-24)的序列。
[0243] SEQ ID N0:15是血液凝固第XIII因子的序列。
[0244] SEQ ID 從)：16是厶(：1'!1(1-39)的序列。
[0245] SEQ ID 從)：17是厶(：1'!1(1-41)的序列。
[0246] SEQ ID 從)：18是(6111)10的序列。
[0247] SEQ ID N0:19是強啡肽A的序列。
[0248] SEQ ID N0:20是(Gly)10的序列。
[0249] SEQ ID恥：21是(厶坪）10的序列。
[0250] SEQ ID 從)：22是0口6的序列。
[0251] SEQ ID 從)：23是04&的序列。
[0252] SEQ ID從)：24是8陬的序列。
[0253] SEQ ID N0:25是緩激肽的序列。
[0254] SEQ ID從)：26是批六237-249片段的序列。
[0255] SEQ ID N0:27是C3f(8氨基酸殘基）的序列。
[0256] SEQ ID 從)：28是111!14的序列。
[0257] SEQ ID從)：29是批4397-413片段的序列。
[0258] SEQ ID從)：30是批4599-609片段的序列。
[0259] SEQ ID NO :31 是C-肽的序列。
[0260] SEQ ID N0:32是粘菌素的序列。4位的Xaa是6-甲基-1-氧代辛基-Dbu或6-甲基-1- 氧代庚基-Dbuj位、4位、5位、8位及9位的Xaa是Dbuj位的Xaa和10位的Thr結合形成環。6位 的Leu是D-亮氨酸。10位的Thr不是末端。
【主權項】
1. 判斷樣品的溫度升高至指定溫度與否的方法，其包括 將含白蛋白的樣品和溫度判斷用肽混合的工序、 對得到的混合物進行加熱的工序、 檢測所述混合物的光學變化的工序、及 基于所述光學變化的檢測結果，判斷所述混合物的溫度升高至所述指定溫度與否的工 序， 所述溫度判斷用肽和白蛋白的結合的解離常數(Kd)是500μΜ以上， 所述溫度判斷用肽含第1標記物質和第2標記物質。2. 權利要求1所述的方法，其中所述溫度判斷用肽含選自天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、 天冬酰胺殘基、絲氨酸殘基、甘氨酸殘基、亮氨酸殘基、丙氨酸殘基、脯氨酸殘基及賴氨酸殘 基的至少1種氨基殘酸基。3. 權利要求2所述的方法，其中所述選自天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、天冬酰胺殘基、絲 氨酸殘基、甘氨酸殘基、亮氨酸殘基、丙氨酸殘基、脯氨酸殘基及賴氨酸殘基的至少1種氨基 殘酸基位于所述第1標記物質和所述第2標記物質之間。4. 權利要求1所述的方法，其中所述樣品是全血、血清或血漿。5. 權利要求1所述的方法，其中所述溫度判斷用肽有SEQ ID NO: 1~32之任一個所示的 氨基酸序列。6. 權利要求1所述的方法，其中所述光學變化是所述溫度判斷用肽導致的光學信號的 波長的變化。7. 權利要求6所述的方法，其中所述光學信號的波長的變化是熒光的發生。8. 權利要求1所述的方法，其中 所述第1標記物質是熒光物質， 所述第2標記物質是對自所述熒光物質發生的熒光進行消光的猝滅劑。9. 權利要求8所述的方法，其中所述第1標記物質是通過與所述第2標記物質隔離而發 生熒光的物質。 1 〇.權利要求8所述的方法，其中 所述第1標記物質是5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸或7-甲氧基香豆素-4-醋酸， 所述第2標記物質是4-[4-(二甲基氨基)苯基偶氮]安息香酸或2,4_二硝基苯酚。11. 權利要求6所述的方法，其中 在所述判斷工序中，在所述檢測的光學信號的強度是指定的閾值以上時，判斷為所述 混合物的溫度升高至所述指定溫度， 在所述判斷工序中，在所述檢測的光學信號的強度不到指定的閾值時，判斷為所述混 合物的溫度不升高至所述指定溫度。12. 權利要求1~11之任一項所述的方法，其中所述指定溫度是120~250 °C。13. 權利要求12所述的方法，其中所述溫度判斷用肽一旦達到所述指定溫度就分解。14. 目標肽的檢測方法，其包括 將含目標肽和白蛋白的樣品和溫度判斷用肽混合的工序、 加熱所述混合物的工序、 檢測所述混合物的加熱前后的光學變化的工序、及 基于所述光學變化的檢測結果，判斷所述混合物的溫度升高至所述指定溫度與否的工 序， 所述溫度判斷用肽和白蛋白的結合的解離常數(Kd)是500μΜ以上， 所述溫度判斷用肽含第1標記物質及第2標記物質， 在所述判斷工序中，判斷為所述混合物的溫度升高至所述指定溫度時，實行回收所述 混合物的上清的工序及檢測上清中的目標肽的工序。15. 權利要求14所述的方法，其中在所述判斷工序中，在不判斷為所述混合物的溫度升 高至所述指定溫度時，不實行所述回收工序及所述目標肽檢測工序。16. 權利要求14所述的方法，其中所述光學變化是所述溫度判斷用肽導致的光學信號 的波長的變化。17. 權利要求14~16之任一項所述的方法，其中所述光學信號的波長的變化是熒光的 發生。18. 權利要求17所述的方法，其中在所述光學變化檢測工序中，檢測到所述混合物的上 清的熒光， 所述上清的熒光是基于所述溫度判斷用肽中所含的標記物質的熒光， 在所述判斷工序中，在所述上清的熒光的強度是指定的閾值以上時，判斷為所述混合 物的溫度升高至所述指定溫度， 在所述判斷工序中，在所述上清的熒光的強度不到指定的閾值時，判斷為所述混合物 的溫度不升高至所述指定溫度。19. 權利要求18所述的方法，其中在所述混合工序中，除所述樣品和所述溫度判斷用肽 之外，還混合含熒光物質的相分配判斷用肽， 所述相分配判斷用肽和白蛋白的結合的解離常數(Kd)不足500μΜ， 在所述判斷工序中，在所述混合物中檢測到發生基于所述相分配判斷用肽的熒光物質 的熒光的析出物，自所述析出物發生的熒光的強度是指定的閾值以上時，判斷為所述白蛋 白形成自身聚集體，所述目標肽存在于所述上清中。20. 用于判斷溶液升高至指定溫度與否的試劑，其中 所述試劑含溫度判斷用肽， 所述溫度判斷用肽與白蛋白的結合的解離常數(Kd)是500μΜ以上， 所述溫度判斷用肽含第1標記物質和第2標記物質。
【文檔編號】G01N33/68GK106018821SQ201610195950
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年3月31日
【發明人】鶴岡禮奈, 三浦由貴子
【申請人】希森美康株式會社