一種分泌cpiv3抗體的雜交瘤細胞株及elisa試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于分子生物學領域，涉及一種分泌CPIV3抗體的雜交瘤細胞株及ELISA試劑盒。本發明使用的山羊副流感病毒3型CPIV3 免疫原是從臨床分離的CPIV3 JS2013毒株，從建立的分泌 CPIV3 單克隆抗體的雜交瘤細胞庫中篩選出一株雜交瘤細胞 2E6。本發明的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有阻斷作用，應用于CPIV3 阻斷ELISA試劑盒。本發明的CPIV3 阻斷ELISA試劑盒可特異性檢測CPIV3 感染或者免疫山羊后產生的抗體。收集212份山羊臨床血清樣品，分別用上述建立的阻斷ELISA方法和中和實驗檢測血清中CPIV3抗體。阻斷ELISA結果與中和實驗相比，符合率為98.8%。CCTCC NO ：C201
【專利說明】
一種分泌CP IV3抗體的雜交瘤細胞株及EL ISA試劑盒
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及一種分泌CPIV3抗體的雜交瘤細胞株及ELISA試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 副流感病毒3型(Parainfluenza virus type 3，PIV3)屬于副黏病毒科呼吸道病 毒屬，是有囊膜的單股負鏈RNA病毒，該屬病毒包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1，HPIV3)， 牛副流感病毒3型(BPIV3)等。該屬成員是引起人和動物呼吸道疾病的重要病原。本實驗室 于2013年底首次報道從江蘇等地發生呼吸道疾病羊群中發現新型PIV3,遺傳進化分析明顯 不同于HPIV3及BPIV3,將其命名為山羊副流感病毒3型(CPIV3)。流行病學調查表明CPIV3在 羊群較為普遍，造成發病引起較大損失。
[0003] PIV3有6種結構蛋白，分別為1?^、圓和1^，其中圓蛋白和?蛋白是？1￥3的主要保 護性抗原。HPIV3HN蛋白對病毒吸附宿主細胞表面起輔助作用，與宿主細胞表面的唾液酸受 體親和性較高，通過與分布在宿主細胞表面的唾液酸受體結合，把病毒牢牢結合在宿主細 胞表面。HPIV3HN蛋白表面存在至少6個抗原表位，有3個中和性抗原表位。HN蛋白作為PIV3 的一種中和抗原，具有很高的種屬特異性，與其他副黏病毒科成員的基因組進行比較，發現 它們之間的同源性很小或者根本沒有同源性。
[0004] 自從Kohler和Milstein 1975年建立了單克隆抗體技術以來，單克隆抗體作為檢 測以及治療動物疫病的一種工具，使疫病防制技術發生了一次革新。單克隆抗體較以往的 多克隆抗體有如下的優點：（1)針對的抗原表位是單一且特異的；（2)可以被無限量的生產。 單克隆抗體在動物疫病診斷中，可以更加容易識別和鑒定病原的特性。利用單克隆抗體建 立的阻斷ELISA檢測方法，在動物傳染病的監測和預防方面發揮著越來越重要的作用。目前 國內外尚無針對山羊副流感病毒（CPIV3)抗體的高通量檢測方法，本發明旨在建立檢測 CPIV3抗體的阻斷ELISA檢測試劑盒，為臨床檢測和相關研究奠定基礎。

【發明內容】

[0005] 技術問題
[0006] 本發明的目的是提供一種分泌具有阻斷作用的CPIV3單克隆抗體的雜交瘤細胞 株。雜交瘤細胞株的建立是用分離純化的CPIV3JS2013株為抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋 巴細胞雜交瘤技術建立分泌CPIV3特異單克隆抗體的雜交瘤細胞庫，通過篩選而獲得。利用 篩選的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，建立一種靈敏、高通量的檢測CPIV3抗體的阻斷 ELISA試劑盒。
[0007] 技術方案
[0008] 本發明的目的通過如下技術方案實現：
[0009] 一種分泌CPIV3單克隆抗體的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞株2E6于2016年2月1日保 藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:C201627， 分類命名雜交瘤細胞株2E6。
[0010] 用所述雜交瘤細胞株2E6制備的單克隆抗體，所述單克隆抗體制備方法為，將雜交 瘤細胞2E6株注射到BALB/c小鼠腹腔，制備單克隆抗體腹水，離心并收集上清液，滅活補 體，過濾除菌，稀釋，分裝，-70 °C低溫凍存。
[0011] 用所述雜交瘤細胞2E6株制備的CPIV3單克隆抗體。所述的單克隆抗體可在CPIV3 阻斷ELISA試劑盒中得到應用。
[0012] 所述CPIV3阻斷ELISA試劑盒可特異性檢測CPIV3感染和免疫后產生的抗體，該試 劑盒系將超離濃縮的CPIV3 (JS2013)病毒包被的酶標板，單克隆抗體2E6，標準陰、陽性對照 血清，酶標二抗，底物及終止液組合成。
[0013] 有益效果：
[0014] CPIV3是國內新發現的病毒，感染山羊后引起呼吸道癥狀，目前國內外沒有相關的 ELISA檢測方法。
[0015] 1.本發明使用的CPIV3免疫原是從臨床分離的CPIV3 JS2013毒株，從建立的分泌 CPIV3單克隆抗體的雜交瘤細胞庫中篩選出一株雜交瘤細胞2E6。
[0016] 2.本發明的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有阻斷作用，應用于CPIV3阻斷 ELISA試劑盒。
[0017] 3.本發明的CPIV3阻斷ELISA試劑盒可特異性檢測CPIV3感染或者免疫山羊后產生 的抗體。收集212份山羊臨床血清樣品，分別用上述建立的阻斷ELISA方法和中和實驗檢測 血清中CPIV3抗體。阻斷ELISA結果與中和實驗相比，符合率為98.8%。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。
[0019] -、單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立
[0020] 1.抗原的制備：將CPIV3病毒（JS2013) (Yang L,Li W,Mao L，et al .Analysis on the complete genome of anovel caprine parainfluenza virus 3. Infect Genet Evol. 2016,38:29-34.)感染MDBK細胞，接毒4d待細胞出現病變后收獲病毒，10，000rpm離心 30min，去細胞碎片;上清經40，000g超速離心2h，棄上清，沉淀用適量PBS過夜溶解。
[0021] 2.免疫Balb/c小鼠：將超離病毒皮下多點注射免疫Balb/c小鼠 ，一共免疫3次，每 次免疫間隔2周，首免使用100ul超離病毒與等量完全弗氏佐劑混合免疫，后兩次均使用100 ul超離病毒與等量的不完全弗氏佐劑混合免疫;第三次免疫2周后采血，檢測小鼠的免疫血 清效價，選取效價>106的小鼠，細胞融合前4d加強免疫一次，100ul超離病毒腹腔注射。 [0022] 3.細胞融合:細胞融合采取PEG細胞融合方法。取小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)與免疫 的Balb/c小鼠脾臟細胞按1: 5的比例充分混勻，2000rpm 25°C離心5min，棄上清，再加入適 量的無血清RPMI-1640培養基重懸，2000rpm 25°C離心5min以清洗細胞，棄上清，輕擊管底， 使細胞松散均勻，置37°C水浴預熱，lmin中加入0.8ml提前在37°C水浴中預熱的PEG2000,邊 加邊振蕩。加完后繼續振蕩lmin，然后在5min內按照l、2、3、3、3ml/min分別加入12ml預熱至 37 °C的無血清RPMI-1640培養基，37 °C靜置10min，2000rpm25°C離心5min，棄上清，加入含 15%FBS和HAT的RPMI-1640培養基重懸，分裝到已鋪有飼養細胞的96孔板中，于5%C02培養 箱培養。期間觀察孔中細胞情況，待融合7d后，細胞生長至96孔板孔底面積1/10~1/5時，取 上清進行抗體檢測。
[0023] 4.雜交瘤細胞的篩選：以0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，以400倍稀釋 的超離病毒為包被抗原包被酶標板，l〇〇ul/孔，4°C過夜。PBST洗滌3次，拍干;將融合細胞上 清，1:1000稀釋的Balb/c免疫小鼠陽性血清以及1:1000稀釋的小鼠陰性血清加入相應的孔 內，100ul/孔，37 °C作用lh，PBST洗滌3次，拍干;加入1:4000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP) 標記的羊抗鼠 IgG，100ul/孔，37°C孵育lh，PBST洗滌3次，拍干。加入底物TMB，100ul/孔，室 溫避光顯色lOmin;每孔加入50ul 2mol/L硫酸終止反應。酶標儀測定酶標板OD45〇nm值，P為各 檢測孔的0D··值，N為陰性血清的0D··值，當陰性血清OD450·值< 0 · 1且陽性血清0D··值 與陰性血清〇D45Qnm的比值2 2.1，即陰、陽性對照均成立的前提下，以P/N 2 2.1判定為陽性孔 的判定標準判定檢測孔的陰陽性。隔2d后再檢測一次，選擇兩次檢測結果均為陽性的雜交 瘤細胞株進行亞克隆。
[0024] 5.雜交瘤細胞的克隆化:將篩選出的陽性孔細胞株用臺盼藍染色，計數，用含15 % FBS的RPMI-1640培養基稀釋成100個細胞/10mL培養基，將稀釋后的細胞懸液加入提前鋪有 飼養細胞的96孔板，每孔100uL，置37°C，5 %C02培養箱中培養，期間觀察細胞株，待生長至 96孔板孔底面積1/10~1/5時，按照之前建立的間接ELISA方法及時進行ELISA檢測。記錄單 克隆細胞的陽性孔，并進行同樣的亞克隆3次以上，直至克隆后所有的克隆細胞株上清檢測 均為陽性且各孔檢測的〇D45Qnm值較接近。將克隆化的CPIV3特異單克隆抗體雜交瘤細胞株進 行擴大培養，凍存。
[0025] 7 .腹水的制備:將滅菌的液體石蠟腹腔注射10~12周齡的Balb/c小鼠（購自揚州 大學比較醫學實驗中心），0.3mL/只，7d后，將雜交瘤細胞株2E6注射入小鼠腹腔，每只0.2mL (2X106~3X106個雜交瘤細胞）。7~10d后收取腹部明顯鼓起的小鼠的腹水，3000rpm離心 20min，收集上清，分裝，標記并保存至-20 °C備用。
[0026] 二、阻斷ELISA試劑盒的建立
[0027] 1.通過優化抗原包被濃度，待檢血清稀釋度，單克隆抗體2E6和羊抗鼠 IgG二抗(北 京全式金生物技術有限公司）的工作濃度，以及待檢血清、單克隆抗體2E6、HRP-羊抗鼠 IgG (武漢博士德)和底物TMB的作用時間，最終完成CPIV3特異性單克隆抗體2E6的阻斷ELISA檢 測方法的建立和試劑盒的組裝。
[0028] 2.抗原包被濃度和單克隆抗體2E6工作濃度的優化:按照矩陣法進行，以0.05mol/ L pH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，分別以300、400、500、600、700、800倍稀釋的超離全病毒作 為包被抗原，4°C過夜包被酶標板(CostarhPBST洗滌3次后加入0.5%BSA置37°C培養箱封 閉2h，PBST洗滌3次，拍干，分別加入CPIV3陽性和陰性血清，50uL/孔。37 °C作用lh，取出酶標 板，PBST洗滌3次，拍干，依次加入500、600、700、800、900、1000倍稀釋的單克隆抗體2E6，每 個稀釋度重復一次，取其平均值，計算各條件下的PI值，選擇陰性血清〇D45Qnm值接近1、PI值 最大的反應條件作為最佳反應條件。結果如下：最佳抗原包被濃度為1:400稀釋;單克隆抗 體2E6的最佳工作濃度為1:900稀釋(表1)。
[0029]表1抗原包被濃度和單克隆抗體2E6工作濃度的選擇
[0030]
[0032] 3.血清稀釋度和作用時間的優化:按照上述的最佳包被濃度包被酶標板，PBST洗 滌3次后加入0.5 % BSA置37 °C培養箱封閉2h，PBST洗滌3次，拍干，分別加入1:1、1:2、1:4、1: 5、1:8、1:10倍稀釋的CPIV3陽性和陰性血清，50uL/孔，每個稀釋度重復一次，置37 °C培養 箱，分別在孵育30min、45min、60min時取出相應的酶標條，PBST洗滌3次，拍干，同時加入單 克隆抗體后繼續作用。計算各條件下的PI值，取重復孔平均值，選擇陰性血清〇D45Qnm值接近 1、PI值大且前兩個結果相近時作用時間最短的反應條件作為最佳反應條件。結果如下:反 應條件中國血清稀釋度為1:4-1:5;血清作用時間為30-45min，結果均較好(表2)。
[0033] 表2血清稀釋度和作用時間的優化
[0034]
[0035] 4.單克隆抗體的作用時間優化:按照上述的條件包被酶標板，封閉，加入血清，作 用30min后，PBST洗滌3次，拍干，加入1:900倍稀釋的單克隆抗體2E6,置37°C培養箱，分別在 孵育30min，45min，60min時取出相應的酶標條，PBST洗滌3次，拍干，3個時間點的酶標條同 時加入酶標二抗后繼續作用。每個時間點重復一次，計算各條件下的PI值，取重復孔平均 值，選擇陰性血清〇D45Qnm值接近1、PI值最大且前兩個結果相近時作用時間最短的反應條件 作為最佳反應條件。結果如下:單克隆抗體2E6的最佳作用時間為30min(表3)。
[0036]表3單克隆抗體2E6的作用時間優化
[0037]
[0039] 5.酶標二抗的工作濃度優化:按照前述的最佳反應條件依次包被酶標板，封閉，加 入血清，單克隆抗體，37°C作用30min后取出酶標板，PBST洗滌3次，拍干，分別加入1:3000， 1:4000，1:5000倍稀釋的酶標二抗HRP-羊抗鼠 IgG，50uL/孔，每個稀釋度重復一次，計算各 條件下的PI值，取重復孔平均值，選擇陰性血清〇D45Qr?值接近1、PI值最大的反應條件作為最 佳反應條件。結果如下:酶標二抗HRP-羊抗鼠 IgG的最佳工作濃度為1:4000(表4)。
[0040] 表4酶標二抗的工作濃度優化
[0041]
[0042] 6.酶標二抗的作用時間優化:按照前述最佳反應條件依次進行，加入酶標二抗后， 置37 °C培養箱，分別在孵育30min，45min，60min時取出相應的酶標條，PBST洗滌3次，拍干，3 個時間點的酶標條同時加入底物TMB后顯色。每個時間點重復一次，計算各條件下的PI值， 取重復孔平均值，選擇陰性血清〇D45Qnm值接近1、PI值最大且前兩個結果相近時作用時間最 短的反應條件作為最佳反應條件。結果如下：酶標二抗HRP-羊抗鼠 IgG的最佳作用時間為 30min(表5)。
[0043]表5酶標二抗作用時間優化
[0044]
[0045] 7 .底物作用時間優化:按照前述最佳反應條件依次進行，加入底物TMB，50uL/孔， 室溫避光作用。分別在作用5min，8min，12min時取下相應的酶標條，加入2M H2S〇4，25uL/孔 終止反應。每個時間點重復一次，計算各條件下的PI值，取重復孔平均值，選擇陰性血清 0D45Qnm值接近1、PI值最大且前兩個結果相近時作用時間最短的反應條件作為最佳反應條 件。結果如下:底物最佳作用時間為12min(表6)。
[0046] 表6底物作用時間優化
[0047]
[0048] 8.阻斷ELISA臨界值的確定：用阻斷ELISA檢測確定的CPIV3抗體陰性山羊血清，計 算其阻斷率，經統計學分析，通過與中和實驗結果進行比較，進行特異性和敏感性分析，以 PI 2 35%時判定血清樣品為抗體陽性，PI < 35%時判定血清樣品為抗體陰性。
[0049] 實施例：
[0050] 收集212份山羊臨床血清樣品，分別用上述建立的阻斷ELISA方法和中和實驗檢測 血清中CPIV3抗體。阻斷ELISA結果與中和實驗相比，符合率為98.8%。
【主權項】
1. 一種分泌山羊副流感病毒3型CPIV3抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株2E6株于 2016年2月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏編 號為 CCTCC NO :C201627。2. 用權利要求1所述雜交瘤細胞株2E6制備的單克隆抗體。3. 根據權利要求2所述的單克隆抗體，其制備方法為，將雜交瘤細胞2E6株注射到BALB/ c小鼠腹腔，制備單克隆抗體腹水，離心并收集上清液，滅活補體，過濾除菌，稀釋，分裝，-70 °C低溫凍存。4. 用權利要求1所述雜交瘤細胞株2E6制備的CPIV3阻斷ELISA試劑盒。5. 用權利要求2或3所述的單克隆抗體制備的CPIV3阻斷ELISA試劑盒。6. 根據權利要求4所述的CPIV3阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒系將超離濃縮 的CPIV3 JS2013株包被的酶標板，單克隆抗體2E6，標準陰、陽性對照血清，酶標二抗，底物 及終止液組合成。7. 根據權利要求5所述的CPIV3阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒系將超離濃縮 的CPIV3 JS2013株包被的酶標板，單克隆抗體2E6，標準陰、陽性對照血清，酶標二抗，底物 及終止液組合成。
【文檔編號】G01N33/577GK105838678SQ201610222623
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月11日
【發明人】毛立, 李文良, 江杰元, 楊蕾蕾, 郝飛, 李基棕, 張紋紋, 周天賜
【申請人】江蘇省農業科學院