一種超聲波輔助外源基因轉化大腸桿菌的方法
【專利說明】-種超聲波輔助外源基因轉化大腸桿菌的方法 (-)技術領域
[0001] 本發明設及外源基因導入微生物的方法，尤其設及一種將構建的含有外源基因的 質粒導入大腸桿菌的高效超聲波轉化方法。 (二）【背景技術】
[0002] 膽固醇廣泛存在于動物體內，尤W腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和 膽汁中含量也高。其溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙酸、氯仿等溶劑。膽固醇是動 物組織細胞所不可缺少的重要物質，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D W及醬體激素的原料。膽固醇經代謝還能轉化為膽汁酸、類固醇激素、7-脫氨膽固醇，并且 7-脫氨膽固醇經紫外線照射就會轉變為維生素D3,所W膽固醇并非是對人體有害的物質。 但當其過量時便會導致高膽固醇血癥，對機體產生不利的影響。現代研究已發現，動脈粥樣 硬化、靜脈血栓形成與膽石癥與高膽固醇血癥有密切的相關性。膽固醇氧化酶可W將膽固 醇氧化為膽醬-4-締-3-酬。應用膽固醇氧化酶的氧化性質可W建立酶法檢測膽固醇含量 的檢測體系。此外，膽固醇的氧化產物膽醬-4-締-3-酬具有防屯、血病、抑制皮膚角質化、 治療肝病和防止肥胖等藥效。因此，膽固醇氧化酶是一種具有多種功能和用途的酶類，其主 要來源于微生物。
[0003] 野生菌的產酶能力在300U/L左右，滿足不了工業生產要求。所W，學者們一直在 對菌種進行改造并優化發酵條件，W提高菌種產酶活力、膽固醇氧化酶的分離純化及應用。 目前都集中在通過基因工程方法來提高膽固醇氧化酶產量。而常規的基因工程方法要求有 高端儀器設備，所用試劑昂貴且大多對人體和環境有害，超聲波作為一種物理方法可W解 決運種不利。
[0004] 超聲技術是學術界、工程界公認的高新技術與未來產業之一，近年來，運項高新技 術才隨著物理、機械、電子、材料學的長足進步及許多邊緣或交叉工業領域的需求，得到迅 猛發展。上世紀八十年代W來，超聲技術不斷應用于工業、農業、醫藥衛生等領域。超聲波 技術應用于生物學領域，已經設及到細胞的破碎，滅菌，提取胞內物質，利用微超聲波增強 細胞內酶的生產和提高非水相酶催化的均質效應W及改善細胞的壁膜結構，增加通透性W 及對液體中固形物或液體濃度的在線檢測等。適當控制超聲波作用的強度和頻率，可使之 對工業微生物產生正面效應，提高工業微生物發酵過程的效率。超聲波轉化是一種高效的 將外源基因導入宿主的方法，目前在哺乳動物和植物中應用較多，而在微生物上鮮見報道。 (H)
【發明內容】

[0005] 本發明提供一種超聲波輔助外源基因轉化大腸桿菌的方法，該方法新穎、轉化條 件溫和、成本低、綠色環境，易于實現基因轉化的方法，解決了現有方法轉化率低，細胞活力 低，易死亡等問題。
[0006] 本發明采用如下技術方案：
[0007] 本發明提供一種超聲波輔助外源基因轉化大腸桿菌的方法，所述方法為：將攜帶 外源基因的表達質粒與大腸桿菌感受態細胞懸液混合，調節抑值至6. 5~7. 5,在35~ 37°C、超聲波場強200~500W的條件下進行轉化反應，轉化反應結束后，篩選獲得含外源基 因的大腸桿菌的陽性轉化子；所述大腸桿菌感受態細胞懸液是由大腸桿菌感受態細胞與二 甲基亞諷混合而成。 陽00引進一步，所述大腸桿菌感受態細胞懸液中濕菌體細胞含量為1 X IO7~1 X 10S個細 胞/mU二甲基亞諷體積終濃度1-4%。
[0009] 進一步，所述轉化反應在35~37°C、超聲波場強200~500W的條件下反應10~ 30min。
[0010] 進一步，所述攜帶外源基因的表達質粒中外源基因為膽固醇氧化酶基因，核巧酸 序列為沈QIDNO. 1所示。
[0012] 進一步，所述大腸桿菌為大腸桿菌E.coli值E3)，購自Novagen公司。
[0013] 進一步，所述攜帶外源基因的表達質粒與大腸桿菌感受態細胞懸液體積比為 1:40-55,所述大腸桿菌感受態細胞懸液中濕菌體細胞含量為1XIO7~1X10 8個細胞/mL。
[0014] 進一步，所述大腸桿菌感受態細胞按如下步驟制備：將大腸桿菌接種至LB液體培 養基中，180~22化/min, 35~37°C振蕩培養至指數生長期（通常培養2. 5~IOh)，12000r/ min, 10~15min，4°C離屯、，收集濕菌體，獲得大腸桿菌感受態細胞。 陽015] 進一步，所述攜帶膽固醇氧化酶基因的表達質粒為祀T28a-choB載體質粒。
[0016] 本發明所述超聲波輔助外源基因轉化大腸桿菌的方法，具體按如下步驟進行：
[0017] (1)大腸桿菌感受態細胞的培養和收集
[0018] 挑取大腸桿菌（優選大腸桿菌E.C01UDE3))單菌落，接種至LB液體培養基中， 180~220r/min，35~37°C振蕩培養至指數生長期（通常培養2. 5-20h)，12000r/min，10~ 15min，4°C離屯、，收集濕菌體，獲得大腸桿菌感受態細胞；
[0019] 似W大腸桿菌為宿主的基因轉化研究
[0020] 向大腸桿菌感受態細胞中加入二甲基亞諷使濕菌體細胞含量為IX IO7~IX 10 S 個細胞/mL(二甲基亞諷體積終濃度為1-4% )，添加攜帶膽固醇氧化酶基因的祀T28a載體 質粒，在抑值至6. 5~7. 5、35~37°C、超聲波場強200~500W下，經超聲波作用進行轉化 反應，分別考察場強和處理時間等參數對轉化的影響；
[0021] (3)陽性轉化子的篩選
[0022] 當轉化結束后，將轉化后的菌液涂布到含50~100yg/mL Kan和50~100yg/mL 的LB平板上，35~37°C培養24~48小時進行篩選，得到陽性轉化子；
[0023] (4)陽性轉化子的鑒定
[0024] 隨機選取轉化平板上的轉化子提取基因組DNA，W其為模板，采用特異性引物進行 PCR驗證。所用引物：5' -TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3' 和 5'-GCGAATTCTCACTGGATGT 〔664〔6464164-3'。？〇?反應條件為：941：5111111;941：303,551：303,72°(：1111111，30個循環； 72°C5min;凝膠電泳檢測重組載體是否插入大腸桿菌基因組。 陽0巧](5)產物表達和穩定性研究
[0026] 鑒定好的轉化子接種到含50~100yg/mL Kan和50~100yg/mL的LB液體培 養基中，在35~37°C培養12~15小時后，加IPTG至終濃度為0. 1~0. 6mmol/l，繼續培 養3~化，檢測膽固醇氧化酶酶活。
[0027] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：
[0028] 1)目前報道多集中在超聲誘導植物和動物基因轉化，本發明擬W超聲波方法誘導 微生物基因轉化。
[0029] 2)常用的基因轉化方法有基因工程法和電穿孔法，基因工程法要求有高端儀器設 備，所用試劑昂貴且大多對人體和環境有害；電穿孔要求有較低的離子介質和較高的電壓， 并且接合要求有直接細胞-細胞接觸。本發明所述超聲波誘導基因轉化方法更加環保，不 依賴于細胞型，且轉化率和電轉化率相當。本發明與現有的電轉化方法相比除具有上述優 勢外，轉化效率也與電轉化相當或高于電轉化，如一種將穿梭質粒導入黃色短桿菌的電轉 化方法（CN1718732A)的轉化率為2.OX103,本發明轉化率達2. 6XIO4陽性轉化子/yg質 粒DNA，其中產量最高的重組菌株的酶活達到1.22U/mU較出發菌株的酶活提高了 144%。 (四）【附圖說明】
[0030] 圖1為實施例1陽性轉化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽性轉化 子。
[0031] 圖2為實施例2陽性轉化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽性轉化 子。
[0032] 圖3為實施例3陽性轉化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道I為陽性轉化 子。 (五）【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0034] LB液體培養基配方為：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g，化CllOg，用去離子水定容 至1L。 陽0對 實施例1
[0036] (1)大腸桿菌感受態細胞的培養和收集
[0037] 挑取大腸桿菌E.COli0E3)(購自Novagen公司）接種至LB培養基，180r/min， 35°C振蕩培養2.化至指數生長期，12000r/min，10min，4°C離屯、，收集濕菌體，獲得大腸桿 菌感受態細胞。
[0038] (2)W大腸桿菌為宿主的基因轉化研究
[0039] 將膽固醇氧化酶基因ChoB克隆到祀T28a載體質粒上。
[0040] 將步驟（1)獲得的濕菌體與二甲基亞諷混合制成菌體濃度為IXlO8個/mU二甲 基亞諷的體積終濃度為2%的細胞懸液，將含膽固醇氧化酶基因ChoB的祀T28a質粒（質粒 濃度應不小于70ng/yL)與細胞懸液W體積比為1:40混合，即取0. 5血質粒與20血細胞 懸液混合，抑調至6. 5 ;溫度調至35°C，超聲波場強為200W，處理時間為15min。
[0041] (3)陽性轉化子的篩選和鑒定
[0042] 陽性轉化子的篩選：將轉化后的菌液涂布到含50yg/mLKan和50yg/mLCam的 LB平板上，35°C培養24小時，進行平板篩選，獲得陽性轉化子。